鹅源新城疫病毒拯救体系的建立

参照GenBank上公布的鹅源新城疫病毒ZJI株全序列,设计8对引物,经RT-PCR法从尿囊液中扩增目的片段后,分别克隆进pCR2.1载体,将Ⅰ～Ⅶ7对引物的扩增片段依次亚克隆到TVT7R转录载体中,构建了含NDV全基因组cDNA的转录载体(pNDVZJI),将Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ3对引物的扩增片段分别克隆进pCR2.1载体,并亚克隆到表达质粒pCI-neo上,构建了L基因的真核表达载体(pCI-L),pNDVZJI、pCI-L与另外两个辅助表达质粒(pCI-NP和pCI-P)共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了具有血凝性的鹅源新城疫病毒,ZJI株鹅源新城疫病毒的成功拯救为后续相关研究工作的开展打下了基础。     

山羊卵泡刺激素β-亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的母山羊脑垂体中提取总RNA,反转录获得cDNA,以皮cDNA为模板用PCR法扩增目的片段,获得长为390bp的山羊卵泡刺激素β－亚基cNDA片段,与预期的目的片段大小一致。将它克隆至pMD-18-T-Verctor中,随机挑选2个阳性重组子进行测序,并将测序结果与绵羊,牛等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较。结果表明,山羊的卵泡刺激素β－亚基因与绵羊的该基因氨基酸同源性最高,达99．9％,只有1个氨基酸不同,与牛,猪,马,虎,人,大鼠的该基因氨基酸同源性分别为92.5%,91.7%,89.9%,89.1%,86.0%,83.7%。从核苷酸同源性来看,山羊的卵泡刺激素β－亚基因与绵羊该基因的同源性了高,达98％;与牛,猪,马,虎,人,大鼠的核苷酸同源性为95％,90％,90％,88％,86％,84％。结果表明,尽管β－亚基基因有种的特异性,但在哺乳动物中其同源性还是很高的。     

小麦RCA的cDNA片断克隆和反义表达载体的构建

目的:试图分离和克隆小麦Rubisco活化酶cDNA片断并构建反义表达载体。方法:采用RT-PCR技术克隆cDNA片断,对序列用Blast等软件进行分析,并将该片断反向连接于植物表达载体pROK2的CaMV35S启动子下游,构建反义表达载体。结果:获得了小麦Rubisco活化酶(RCA)的cDNA片断(GenBank注册号:DQ984669);小麦RCA的cDNA片断推导的氨基酸序列与其它植物的RCA氨基酸序列高度同源。序列比较表明,用本实验所得的cDNA序列推导出的氨基酸序列与GenBank登录的大麦(AAA63163)、南极银须草(AAP83928)、水稻(AAX95414)、玉米(AAC97932)、拟南芥(NP 850321)和烟草(CAA78703)等的RCA序列的同源性分别为97%、95%、88%、83%、82%和82%;分析表明,该序列为新的小麦RCAα的cDNA序列;通过选择和引入合适的酶切位点进行载体构建,构建了小麦RCA的cDNA反义表达载体pR-AntiRCA。结论:构建成了小麦RCA的cDNA反义表达载体。     

小麦苗期冷驯化相关cDNA的克隆

以中国春小麦幼苗为材料,利用改进的mRNA差异显示方法和银染技术,对不同低温驯化诱导表达的差异基因进行分离,共得到cDNA差异片段60条.经Reverse Northern验证,检出阳性表达片段8条,克隆并测序,分别命名为TIGW1~TIGW8.其中,TIGW2和TIGW3可能与抗冻蛋白积累、低温诱导蛋白的生成或低温信号的感受与传递有关;TIGW1、TIGW6、TIGW8中具有ACGT应答元件,TIGW3含有CAACA应答元件,说明可能获得了冷诱导基因的启动子序列.     

鸡IFN-γcDNA的克隆及测序

应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）技术,参照图外报道的鸡γ干扰素（CHIFN-γ）cDNA全基因序列,利用自行设计合成的一对引物,从ConA诱导培养的SPF鸡外周血淋巴细胞中扩增出CHIFN-γcDNA基因,并与PMD18-T载体连接,构建了CHIFN-γ基因重组体,经DNA序列测定,确认为CHIFN-γ基因,为进一步表达CHIFN-γ奠定了基础。     

辣椒温和斑点病毒(PMMV)外壳蛋白基因的克隆和序列测定

从本院分离的辣椒温和斑点病毒株系PMMV-QD中提取RNA.根据已有报道的外壳蛋白(CP)自行设计引物P1、P2,用RT-PCR扩增PMMV-QD的CP基因的cDNA,插入pMD 18-T载体,转化感受态受体菌XL1-B1ue,以蓝白菌落筛选转化株,用PCR检测白色菌落,确认获得了含cDNA的阳性重组子.序列测定和比较的结果表明该片段确含有PMMV的CP基因编码区,此种cDNA与国外报道的PMMV病毒株系核苷酸序列的同源性达到97.7%.     

两种茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA在原核中表达的研究

采用原核表达系统pET-32a( )载体和BL21trxB(DE3)菌株对两条茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA(GluⅠ和GluⅡ)进行了表达,研究了不同诱导时间、不同诱导温度对两个茶树β-葡萄糖苷酶表达量的影响并测定了两者的活性。表达分析结果表明,诱导6h、25℃时,GluⅠ在总蛋白中所占比例最高;诱导6h、37℃时,GluⅡ在总蛋白中所占比例最高,活性测定结果表明,两种表达蛋白均具有正常的β-葡萄糖苷酶活性,在相同的测定条件下,GluⅡ活性(0.310±0.03U·ml-1)比GluⅠ(0.234±0.03U·ml-1)活性更高。     

人类β-1,4-半乳糖苷转移酶基因家族中1个新成员的克隆与表达谱分析

应用从EST出发克隆基因家族新成员的策略 ,在人类睾丸组织cDNA文库中分离出 1个新的全长cDNA片段 ,它编码的蛋白产物与 (UDP 半乳糖苷 :N 乙酰基葡萄糖胺 )半乳糖苷转移酶 (GalT)有较高的同源度 .分析表明 ,在其 2 173bp的序列中含有 1个长 10 3 2bp的开放读框 ,编码 3 44个氨基酸 .基于该基因与半乳糖苷转移酶基因家族各成员的同源关系 ,尤其是与G .gallus β 1,4 半乳糖苷转移酶Ⅰ型(CKⅠ )的关系密切 ,这个基因的蛋白产物被命名为人类 β 1,4 半乳糖苷转移酶同源蛋白Ⅰ型 .Northern杂交发现它在被检测的人体 16种组织中均有表达 ,但丰度各异 .通过与含人单条染色体的人 /啮齿类的杂种细胞DNA进行Southern杂交 ,证明该基因位于 3号染色体上 .     

EST的应用现状与前景

综述EST（Expressed sequence tag）的用途,应用现状及其发展前景。     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

玉米根系蛋白磷酸酶基因ZmPP2C的克隆及表达特性

依据植物蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase2C,PP2C)基因的保守区设计简并引物,运用RT-PCR方法,从玉米根系中分离到一个长度为936 bp的PP2C基因的cDNA克隆,命名为ZmPP2C.Southern杂交结果表明它在玉米基因组中是低拷贝的,且存在一个小的PP2C基因家族.Northern杂交结果表明,不同玉米组织之间ZmPP2C的表达差异明显;分别用CaCl2、MgCl2、PEG、EGTA和ABA处理根系24 h,只有CaCl2处理增加表达量,说明Ca2 能诱导玉米ZmPP2C基因在转录水平上的表达,或被依赖于Ca2 的方式诱导.     

烟草花叶病毒(普通株中国分离物)及其弱毒疫苗N14(番茄株)基因组侵染性cDNA核苷酸全序列测定与分析

用双脱氧末端终止法对侵染性烟草花叶病毒普通株中国分离物(TMV-vulgar,Chinese Isolate,TMVCv)和番茄株弱毒疫苗TM-N14(Attenuated TMV vaccine strain)基因组cDNAs的核苷酸全序列进行了测定,并分析和比较了其基因组的结构和特征。结果表明：普通株基因组(Genbank接收号：AF165190)为6395个核苷酸;4个功能性开放阅读框架(ORF),分别编码126kD/183kD的复制酶、30kD运动蛋白和17.6kD外壳蛋白。弱毒疫苗TMV-N14基因组(Genbank接收号：AF155507)为6384个核苷酸;5个功能性ORF分别编码985kD/126kD/183kD的复制酶、27kD运动蛋白和17.6kD外壳蛋白。与参比序列核苷酸和氨基酸序列比较：普通株核苷酸序列同源率为99.4%;推断的复制酶与运动蛋白分别有5个和2个氨基酸残基不同。TMV-N14核苷酸序列同源率为99.7%;核苷酸位置2670～2672和5632～5634分别发生乳石(Opal)突变(UGA)和赭石(Ochre)突变(UAA);推断复制酶有13个氨基酸残基发生了变异。     

下一代测序cDNA样品制备及优化技术探讨DD

下一代测序技术目前已经应用于微生物、人类、动物、植物等的基因组分析.样品制备是开展大规模测序的必要前提和测序成功的根本保证.对大规模测序造成干扰的主要因素有: polyA干扰测序信号及高丰度基因对低丰度基因的掩盖等.文章以堇菜(Viola verecumda A.Gray)叶片为试材, 提取总RNA, 合成双链cDNA, 利用DSN核酸酶对双链cDNA进行均一化处理, 并对双链cDNA polyA进行了切除, 将处理后的cDNA进行了TA克隆, 挑取100个克隆随机测序.结果表明, 未处理的cDNA样本测序有15个克隆由于polyA的存在而影响了附近碱基的正确阅读, 独立克隆只有62个, 而处理后的cDNA样本经测序未发现polyA, 独立克隆有94个.序列分析发现, 经过处理的cDNA样本随机测序有两个克隆是经MALDI-TOF检测在样本中有蛋白质峰, 而基因克隆一直没有分离到的序列.以处理后的cDNA样本为模板扩增2个已知表达丰度差异较大的基因显示, 处理后这2个基因的PCR扩增产量差异明显减小.这些结果表明polyA切除、DSN核酸酶处理的cDNA样本完全满足大规模测序、寻找新基因的要求.     

罗非鱼胰蛋白酶ⅠmRNA克隆与分析

应用3′/5-′RACE方法对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)和奥利亚(Oreochromis aureus)罗非鱼胰蛋白酶ⅠmR-NA进行了克隆和测序,序列分析表明,尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼胰蛋白酶ⅠmRNA序列全长分别为863bp和858bp,序列中均含有738个核苷酸组成的开放阅读框,编码长度为245个氨基酸残基的胰蛋白酶Ⅰ。胰蛋白酶Ⅰ氨基末端均存在信号肽和激活肽序列,序列中均具有与催化活性必须的高度保守的催化三联体氨基酸残基(His、Asp、Ser)和构成二硫键的12个半胱氨酸残基,以及决定底物特异性的保守性氨基酸残基即天冬氨酸残基和S1结合袋。南极鱼(Patanotothenia magellanica)、大西洋鲑(Salmo salar)、日本鲽(Paralichthys olivaceus)、大西洋鳕(Gadusmorhua)、牛和人类胰蛋白酶mRNA序列以及氨基酸序列与奥利亚罗非鱼相比较同源性分别为58.3%—72.5%和63.3%—76.1%,与尼罗罗非鱼相比较同源性分别为59.1%—73.1%和63.6%—75.6%。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼胰蛋白酶mRNA序列以及氨基酸序列同源性分别为96.2%和99.2%。       

香猪雌激素受体α、β基因cDNA的克隆及分析

本文采用RT-PCR技术,分别从香猪的子宫和卵巢总RNA中扩增了雌激素受体α和β(Erα、Erβ)两种cDNA,分别长1788 bp和1581 bp,包括起始密码子和终止密码子,碱基序列与大白猪的Erα、Erβ基因的相似性为99.3%和99.6%.Erα、Erβ两个基因编码595、526个氨基酸,N-末端的20、24个氨基酸残基为信号肽,成熟肽序列与大白猪之间均有4个氨基酸不同.三维结构分析发现,与大白猪相比,香猪Erα成熟肽第192、231位氨基酸由Ser、Met变为Gly、Thr,位于DNA结合结构域,成熟肽438位氨基酸由Val变为Gly,位于Erα的配体结合结构域;Erβ成熟肽中,167位和360位氨基酸由Asp和Phe变为Glu和Pro,位于受体的DNA结合域和配体结合域,这五个位点的氨基酸替代可能影响Ers蛋白与雌激素受体应答元件、雌激素等配体的结合,改变相关基因的转录效率,并可能影响香猪的卵巢、子宫等繁殖系统的发育,与香猪的低繁殖力有关     

山羊、绵羊MT-Ⅳ分子特性研究

金属硫蛋白(MTs)是一类低分子量、金属和半胱氨酸含量高的细胞质蛋白,哺乳动物的MTS包括MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ4种亚型,其中MT-Ⅳ只在磷状复层扁平上皮细胞中表达,相关研究报道较少.本研究根据GenBank已公布的动物MT-Ⅳ基因序列,设计出扩增山羊和绵羊MT-Ⅳ基因的特异性PCR引物MT-ⅣSP1和MT-ⅣSP2,利用RT-PCR的方法,分别从山羊和绵羊的瘤胃组织mRNA中,克隆出山羊和绵羊的MT-Ⅳ基因编码区序列(均为189bp),序列登录GenBank,获得序列号EF470251和EF624067.通过序列分析,表明山羊和绵羊两个物种MT-Ⅳ基因编码区全编码均为189 bp、编码62个氨基酸,其中绵羊的MT-Ⅳ含有20个半胱氨酸,而山羊第61位保守的半胱氨酸被色氨酸所代替.两个物种的MT-Ⅳ均不含芳香族氨基酸,含有MTs特有的C-X-C、C-X-X、C-C-C-X-C-C结构,无明显的跨膜结构域,无信号肽,是一种细胞质蛋白.二级结构分析表明两个物种的MT-Ⅳ二级结构大多数为无规则卷曲结构,分别在第7～9和第49～51氨基酸残基性存在折叠结构,不存在螺旋结构.三级结构预测结果表明两个物种MT-Ⅳ的三级结构由α和β两个结构域组成,其中β结构域相同,α结构域山羊少一个半胱氨酸残基,其结构与绵间存在明显差异,这一差异可能对山羊MT-Ⅳ的生理功能产生一定影响,有必要深入研究.     

孔石莼凝集素蛋白基因的克隆与表达

根据孔石莼(Ulva pertusa)凝集素(Lectin)蛋白cDNA全长序列(GenBank登录号:AY433960)设计引物,以其总DNA为模板,采用PCR技术扩增蛋白DNA序列,经克隆、测序获得基因序列。结果表明,孔石莼凝集素蛋白(UPL)基因序列长约为670 bp,含有一个大小为56 bp的内含子。此外,设计带酶切位点的引物,以UPL-cDNA为模板,扩增其开放阅读框,并与表达载体pGEX-2T连接,构建原核表达载体pG2T-UPL,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达大小约为47 kD的目的蛋白。     

山羊卵泡刺激素α亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的雌山羊脑垂体中提取总RNA ,反转录获得cDNA .以此cDNA为模板用PCR法扩增目的片段 ,获得长为 380bp的山羊卵泡刺激素α亚基cDNA片段 .将它克隆至pMD 18 T Verctor.随机挑选 3个阳性重组子进行测序 ,将测序结果与绵羊、牛、猪等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较 .结果表明 ,山羊卵泡刺激素α亚基基因氨基酸序列与绵羊、水牛的同源性最高 ,达 96 % ,与牛的同源性达 95 % ,与人的同源性较低 ,为 74 % .山羊卵泡刺激素α亚基基因编码区的核苷酸与绵羊的同源性最高 ,达 95 % ,与水牛、牛的同源性达 94 % ,与马和大鼠的同源性较低 ,为 85 % .总体来看 ,在哺乳类动物中FSHα亚基基因同源性还是很高的 .