菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达及乙醇发酵

以乙醇耐受力较强的酿酒酵母为受体菌,构建了能够分泌菊粉酶的基因工程菌并进行了菊芋粉的生料发酵。首先,以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus中的基因组DNA为模板,PCR扩增菊粉酶编码基因inu,分别使用菊粉酶自身启动子和酵母磷酸甘油激酶 (Phosphoglycerate kinase,pgk) 启动子,构建重组表达质粒HO/p-inu和HO/pgk-inu。经NotⅠ线性化后,采用电击法转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6525,分别得到含菊     

菊粉酶基因的异源表达、分离纯化及酶学性质

为进一步提高菊粉酶在生物技术领域的应用,研究了来源于马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus YX01的菊粉酶性质。通过在毕赤酵母GS115宿主细胞中异源表达该菊粉酶基因(inu),获得了一种外切型菊粉酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证其分子量为86.0 k Da。进一步在该菊粉酶上增加6个His标签,采用聚乙二醇(PEG)20 000透析浓缩和Ni-NTA Agarose静态亲和吸附作用的方法,完成菊粉酶的分离纯化,纯化倍数和酶回收率分别为3.6和33.1%。比较发现粗酶液与纯酶的酶学性质相似,且菊粉酶的最适反应温度为60℃,最适p H值为4.62,并测得该酶的Km和Vmax值,以菊粉为底物时,Km和Vmax值分别为80.53 g/L和4.49 g/(L·min);以蔗糖底物时,Km和Vmax值分别为183.10 g/L和20.20 g/(L·min)。金属离子Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+对酶活力具有不同程度的抑制作用,其中Cu2+、Zn2+和Fe2+的抑制作用最为显著。这些研究为进一步提高菊粉酶在工业化的应用奠定了基础。     

一步法发酵菊芋产乙醇菌种的筛选及产酶条件、酶学性质的研究

从腐烂的菊芋及实验室保存的菌种中,选育到一株发酵菊芋产乙醇的菌株克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus Y1。利用正交实验法对克鲁维酵母产菊粉酶的培养基组成及培养条件进行优化,确定培养基组成（g/L）为：菊粉40,酵母粉4,蛋白胨4,尿素1;初始pH5．0,温度30℃,150r／min条件下培养达到最佳产酶效果（57U／mL）。该菌株所产菊粉酶的性质测定结果表明：以菊粉为底物,该菊粉酶最适反应温度为55℃,在60℃以下稳定性很好,高于60℃时酶迅速失活;最适pH为5．0,pH4．6—5．2范围内酶稳定性很好;该酶属于外切型菊粉酶,体积分数为8％的乙醇对酶活力基本没有影响。     

腐皮镰孢菌壳聚糖酶的酶学性质研究及其在酿酒酵母工业菌株中的表达

摘要：【目的】本研究旨在了解腐皮镰孢菌（Fusarium solani）壳聚糖酶的基本酶学性质及其在壳寡糖生产中的应用,构建能高效分泌表达壳聚糖酶的酿酒酵母工业菌株。【方法】采用RT-PCR扩增腐皮镰孢菌壳聚糖酶的cDNA序列;通过组氨酸标签,纯化得到E. coli表达的重组壳聚糖酶,并进行基本酶学性质研究;以薄层层析、高效液相色谱等技术对该酶的酶解产物进行分析;通过马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）菊粉酶信号肽（INU1A）实现壳聚糖酶在酿酒酵母工业菌株N-27中的分泌表     

通气量和菊粉浓度对克鲁维酵母乙醇发酵的影响

马克斯克鲁维酵母能够利用集成生物加工技术发酵菊芋生产乙醇,具有非粮燃料乙醇生产潜力.文中研究了该技术中的两个关键因素(通气量和底物浓度)对于K.marxinaus YX01乙醇发酵过程和菊粉酶活性的影响.研究结果表明,底物浓度对乙醇得率影响不大,底物浓度为250 g/L时,发酵终点乙醇浓度为84.74 g/L,但乙醇得率由低浓度50 g/L的86.4％(理论值),降为84.7％.通气能够加速K.marxinaus YX01的乙醇发酵过程,但降低了乙醇得率,当底物浓度为250 g/L时,乙醇得率由不通气的84.7％降为1.0 vvm时的73.3％.随底物浓度的升高及通气量的降低,K.marxinaus YX01分泌的菊粉酶活力表现出降低的趋势.在不通气及底物浓度为250 g/L时,菊粉酶的活性为6.59 U/mL,而底物浓度50 g/L,通气量1.0 vvm时的酶活力为21.54 U/mL.乙醇发酵过程中的副产物甘油随通气量的降低及底物浓度的升高而增大,而乙酸的浓度随通气量的增大及底物浓度的升高而升高.     

一步法发酵菊芋生产乙醇

利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)YX01具有菊粉酶生产能力且乙醇发酵性能良好的特点,直接发酵菊粉生成乙醇.在摇瓶中考察了该菌株最适发酵温度,进而在2.5L发酵罐中考察了通气量和底物浓度的影响.实验结果表明:该菌株最适发酵温度为35℃;在通气量为50 mL/min和100 mL/min时菌体生长加快,发酵时间缩短,但在不通气条件下糖醇转化率明显提高;在菊粉浓度235 g/L时,发酵终点乙醇浓度达到92.2 g/L,乙醇对糖的得率为0.436,为理论值的85.5%.在此基础上,使用近海滩涂种植海水灌溉收获的菊芋为底物,以批式补料方式直接发酵菊芋干粉浓度为280 g/L的底物,发酵终点乙醇浓度为84.0 g/L,乙醇对糖的得率为0.405,为理论值的80.0%.这些研究工作,为以菊芋为原料的燃料乙醇技术开发奠定了基础.     

鹰嘴豆孢克鲁维酵母利用菊芋原料同步糖化与发酵生产乙醇

菊芋含有大量的菊粉多糖,且种植简单、产量高,是极具开发价值的替代玉米等粮食作物生产燃料乙醇的原料。文中研究了鹰嘴豆孢克鲁维酵母Y179利用菊芋原料同步糖化与发酵生产乙醇。鹰嘴豆孢克鲁维酵母Y179具有高效分泌菊粉酶的能力,摇瓶试验显示Y179酵母能够利用完全由菊芋原料配制而成的培养基良好生长并发酵产生乙醇。通气及温度对乙醇产量影响明显,相对厌氧环境对Y179酵母发酵产乙醇具有促进作用,30℃发酵温度相对37℃和42℃更有利于乙醇产量提高。种子液培养时间及接种量对乙醇产量影响较小。在5 L发酵罐中以10%(V/V)量接入预培养36 h的Y179种子液,发酵液完全由菊芋干粉配制而成,总糖含量22%(W/V),30℃不通气,300 r/min搅拌,发酵144 h时,乙醇浓度达到12.3%(V/V),糖醇转化效率86.9%,糖利用率大于93.6%。初步研究结果显示鹰嘴豆孢克鲁维酵母Y179在利用菊芋原料生产乙醇方面具有良好应用前景。     

Kluyveromyces marxianus发酵己糖和戊糖生产乙醇

对利用底物广泛的乙醇发酵菌株马克斯克鲁维(Kluyveromyces marxianus)DL1菌株与工业用乙醇发酵菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6525利用己糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖)和戊糖(木糖、阿拉伯糖)的情况进行对比研究。结果发现:以己糖为底物时,K.marxianus DL1均表现出细胞生长快、乙醇得率高的特点;在不通气、糖20 g/L条件下,K.marxianus DL1的最大乙醇质量浓度均比S.cerevisiae 6525高出10%左右,细胞量及乙醇生产强度分别是S.cerevisiae 6525的近2和1.7倍。当以戊糖为底物时,K.marxianus DL1可以利用木糖和阿拉伯糖;在不通气、糖20g/L条件下,K.marxianus DL1利用木糖产木糖醇和乙醇,乙醇终质量浓度可达7.68 g/L,木糖醇质量浓度为9.12 g/L;以阿拉伯糖为发酵底物时,阿拉伯糖醇的产量可达6 g/L左右;而S.cerevisiae 6525不能利用戊糖。马克斯克鲁维酵母比酿酒酵母更适合纤维乙醇生产。     

非传统酵母代谢工程研究进展

近30年来解脂耶氏酵母、克鲁维酵母、毕赤酵母、假丝酵母、汉逊酵母等非传统酵母因其具有天然的生理代谢优势,如快速生长、多底物利用、胁迫耐受性等,在代谢工程领域得到了广泛关注,多种基因工程改造工具正逐渐被开发用于非传统酵母的特性拓展,使其成为合成重组蛋白、生物可再生化学物质的高效细胞工厂.文中总结了非传统酵母中基因编辑工具...     

马克斯克鲁维酵母的木糖和阿拉伯糖发酵

马克斯克鲁维酵母作为非常规酵母在燃料乙醇发酵中受到人们越来越多的关注。马克斯克鲁维具有天然的发酵戊糖的能力,但不同菌株的发酵能力存在较大差异。本研究比较了3株马克斯克鲁维菌株Kluyveromyces marxianus 9009/1911/1727(K.m 9009/1911/1727)在不同温度下的木糖和阿拉伯糖的发酵性能差异,结果发现不同发酵温度下,3株菌在耗糖速率、糖醇产率均表现出了显著的差异。菌株K.m 9009和K.m 1727在40℃下的发酵性能均优于30℃,这充分体现了马克斯克鲁维酵母的高温发酵优势。针对发酵差异,采用PCR方法获得3个不同菌株的戊糖代谢途径中的5种关键代谢酶(XR、XDH、XK、AR和LAD)的基因序列,并利用Clustalx 2.1进行了序列比对。结果显示3株菌的相关基因与文献中报道的1株克鲁维酵母的相应关键酶氨基酸编码序列相似性达98%以上,并且差异的氨基酸不在酶的关键位点处。在此基础上,通过Real-time实验,对木糖发酵差异最为明显的K.m 1727和K.m 1911的木糖代谢过程4个关键酶(XR、XDH、XK和ADH)的基因表达量进行测定,其结果显示对于耐热菌株K.m 1727,XDH和XK基因表达量低是导致木糖代谢过程中木糖醇积累、乙醇产量低的主要原因。最后,将所测得的马克斯克鲁维酵母的戊糖代谢关键酶序列与其他不同种属相比对,确定了其木糖和阿拉伯糖代谢途径,为进一步利用代谢工程方法提高戊糖发酵性能奠定了基础。     

马克斯克鲁维酵母菌菊粉酶的异源表达及低聚果糖制备工艺优化

【目的】低聚果糖是新型的食品和保健品原料,具有广阔的市场需求。以菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖的酶法工艺是先进的绿色制造。本研究旨在获得高产的菊粉酶菌株及以菊粉为原料酶法制备低聚果糖的优化工艺。【方法】采用基因工程手段克隆马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶基因,实现其在毕赤酵母中的高效表达;测定菊粉酶在不同p H、温度、金属离子和底物浓度等条件下的酶活变化趋势,获得最佳的反应参数;通过高效液相色谱法检测水解产物,获得不同酶量水解产物各组分分布。【结果】菊粉酶工程菌株在10 L发酵罐中的产菊粉酶活达1 570 U/m L、蛋白质含量为2.75 g/L发酵液;菊粉酶最适反应参数为:在体积为1 L的反应体系中,p H 5.0、反应温度50°C、含0.2 mmol/L Mg2+以及菊粉浓度为8%。在该条件下,酶量为10 U时菊粉被完全水解。水解产物中单糖和二糖含量仅为9.25%,而低聚果糖(C3-C8)含量为90.75%,且C3-C5低聚果糖含量高达72.92%。【结论】克隆了K.marxianus菊粉酶基因并实现了高效表达,获得了水解菊粉制备低聚果糖的最佳工艺条件。为菊粉酶的大量生产及低聚果糖的酶法制备奠定了良好的基础。     

高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶学性质研究

筛选到1株菊粉酶高产克鲁维酵母菌株,采用酵母高密度细胞发酵方法,最高菊粉酶产量达到288.78u/mL,比80～90年代国际上报道的克鲁维酵母菊粉酶最高产量高6.8倍。该酶的菊粉酶/转化酶活性比为1/24.72;菊糖m=13.3mmol/L,蔗糖Km=62.6mmol/L;最适反应pH值为4.4,但在pH3.8～5.6的范围内均保持了较高的活性,相当于最适pH值下活性的90%;最适反应温度为55℃,在50～575℃范围内能够保持较高活性,50℃下酶的半衰期约为16h;外加Mg2+提高酶活性11.28%。     

乳酸克鲁维酵母表达外源蛋白研究进展

乳酸克鲁维酵母已成功地应用于多种异源蛋白的表达生产之中。与其他酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有许多优点，如超强的分泌能力，良好的大规模发酵特性、食品安全的级别及整合表达能力等，其作为宿主系统表达药用蛋白也已显示出巨大的潜力。从不同的菌属、遗传工程和分子生物学技术（如启动子、表达载体）等方面简要综述了乳酸克鲁维酵母作为蛋白表达宿主系统的优势。     

马克斯克鲁维酵母GX-UN120糖转运蛋白基因的克隆及表征

【背景】马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)具有完整的木糖代谢途径,可以高效利用木质纤维素中的木糖,因此对其糖转运蛋白基因的研究或可有效解决酵母木糖转运的相关问题。【目的】根据马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042中KLMA＿70145和KLMA＿80101基因位点的功能预测,获得马克斯克鲁维酵母GX-UN120相应的糖转运蛋白基因序列并探究其功能。【方法】将转运蛋白基因分别克隆表达至酿酒酵母EBY.VW4000中考察重组菌株生长特性,以此间接评价对应转运蛋白的转运能力。【结果】Km＿SUT2基因编码的糖转运蛋白可有效提高宿主细胞转运木糖、阿拉伯糖、山梨糖、核糖、乳糖和葡萄糖的能力,但却不能转运甘露糖、果糖、蔗糖和半乳糖。类似地,Km＿SUT3基因编码的糖转运蛋白可提高细胞转运木糖、阿拉伯糖、山梨糖、半乳糖、核糖、乳糖和葡萄糖的能力,但却不能转运甘露糖和果糖。然而在葡萄糖存在的条件下,重组菌株对各种碳源的利用均受抑制,但Km＿SUT3转运木糖和核糖过程中受葡萄糖的抑制作用较小。【结论】马克斯克鲁维酵母GX-UN120中转运蛋白Km＿SUT2和Km＿SUT3可...     

一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体的构建

用化学法合成克鲁维酵母的菊粉酶基因的信号肽序列(INU),将其嵌入酵母附加型表达质粒pYES2,得到一套新型的分泌表达载体pYES2I,pYES2Ⅱ,pYES2Ⅲ。然后用PCR方法分别扩增大肠杆菌的天冬酰胺酶基因(ASN)和短芽孢杆菌α乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)基因,连接到INU下游,得到重组质粒pASN和pALDC。分别将这两个重组质粒转化酿酒酵母菌株INVScⅠ中表达,胞内和胞外的酶活分析表明ASN和ALDC基因都能在酿酒酵母中分泌表达,表明菊粉酶信号肽序列能很好地将酿酒酵母中的重组蛋白分泌到胞外。稳定性分析表明,重组酵母菌株在没有选择压力的条件下连续接种培养100h,未发现重组质粒的不稳定性。     

乳酸克鲁维酵母表达型T载体的研发及应用

[目的]构建以乳酸克鲁维酵母表达载体p KLAC2为基础的表达型T载体。[方法]利用定点突变技术突变载体p KLAC2上的XcmⅠ位点,获得表达载体p KL-MUT;PCR扩增含黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过EcoRⅠ和XhoⅠ位点连接至表达载体p KL-MUT,构建成重组载体p KL-YFP,限制性内切酶XcmⅠ酶切后即产生T载体p KL-T。连接融合基因14-3-3-Zs G转化至乳酸克鲁维酵母GG799。[结果]利用该T载体可成功克隆外源基因14-3-3-Zs G并在乳酸克鲁维酵母中表达14-3-3-Zs G蛋白,荧光和Western blotting验证正确。[结论]乳酸克鲁维酵母表达型T载体已成功构建,具有快速克隆高效分泌表达外源基因的特点,对于促进乳酸克鲁维酵母表达系统表达相关蛋白的产业化具有实际意义。     

酿酒酵母和克鲁维酵母发酵菊芋生产燃料乙醇

为获得菌株发酵菊芋生产燃料乙醇的最佳方案,首先选取实验室保存的重组菌株R32对其产酶条件进行优化,其最高产菊粉酶活性为298.8 U· mL-1,此时的最佳培养基配方为:YPG培养基为酵母粉1％ (w/v),蛋白胨2％ (w/v),甘油0.5％ (v/v);YPM培养基为酵母粉1％ (w/v),蛋白胨2％ (w/v),甲醇1％(v/v);培养基pH为自然初始pH.然后选取酿酒酵母S.c和克鲁维酵母Klu,比较是否在添加重组菌株R32粗酶液条件下,两株酵母菌分别进行单独发酵和混合发酵时的产乙醇能力,以获得最佳的发酵组合.结果表明,酿酒酵母S.c和克鲁维酵母Klu在未添加重组菌株R32粗酶液时,混合一步发酵获得的乙醇含量较高,发酵84 h时乙醇含量为11.37％.添加重组菌株R32粗酶液进行两步发酵时,2株酵母菌混合发酵72 h时,乙醇含量为11.43％.2种发酵组合的最高乙醇含量以及各个发酵参数基本相同,虽然一步法发酵时间延长,但节省成本,操作简单,更适宜工业生产应用.最后对其进行正交试验优化,培养条件为菊粉浓度225 g· L-1,脲素浓度40 g·L-1,接种量15％,pH为5时,酿酒酵母菌S.c和克鲁维酵母Klu混合一步发酵法的最高乙醇体积比达11.82％.     

固定化克鲁维酵母Y-179外切菊粉酶的研究

鹰嘴豆孢克鲁维酵母(Kluveromyces cicerisporus Y-179)分泌的糖基化菊粉外切酶经高碘酸钠氧化其分子表面的糖链产生醛基,再共价结合于氨基型固定化载体ZH-HA上,固定化酶活力达到4 000 U/g湿载体。所制备的固定化酶在pH 3.5和70℃温度下表现出最大反应活性,该固定化酶pH稳定性和热稳定性较游离酶明显提高。固定化酶在分批式反应器中重复水解菊粉50批次,活力没有明显损失,表现出良好的工作稳定性。     

低温几丁质酶基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达及酶学性质表征

【目的】通过构建假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)低温几丁质酶(chitinaseA,chi A;chitinase C,chi C)的重组乳酸克鲁维酵母菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质表征,为低温几丁质酶潜在工业化生产几丁寡糖奠定理论基础。【方法】人工合成密码子优化的几丁质酶基因,构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒(p KLAC1-chi A、p KLAC1-chi C)并用电脉冲法转化到乳酸克鲁维酵母中,实现低温几丁质酶的可溶表达。利用镍柱亲和层析纯化得到高纯度的重组几丁质酶。【结果】成功构建产低温几丁质酶的重组乳酸克鲁维酵母并纯化获得高纯度的重组几丁质酶。经SDS-PAGE分析在110 k Da与90 k Da附近出现符合预期大小的蛋白条带。铁氰化钾法测得Chi A和Chi C的酶活分别为51.45 U/mg与108.56 U/mg。最适反应温度分别为20°C和30°C,最适p H分别为8.0和9.0。在低于40°C,p H 8.0–12.0时,Chi A和Chi C重组酶较稳定。Chi A和Chi C对胶体几丁质以及粉状底物α-几丁质与β-几丁质具有明显的降解活性,且具有一定协同降解能力。【结论】首次实现假交替单胞菌来源的低温几丁质酶在乳酸克鲁维酵母中的重组表达、纯化、酶学性质及其降解产物分析,为其他低温几丁质酶的研究提供借鉴意义。     

一个外切菊粉酶基因的克隆表达及酶学性质

从马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）DSM5418中克隆出外切菊粉酶（INU）的成熟肽编码区域,在毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115中实现了高效分泌表达,体积酶活力达到15．27U／mL,进一步对重组酶进行了纯化与表征。经过（NH4）2SO4沉淀、透析和分子筛过滤后,得到了纯度大于95％的纯化重组酶,SDS-PAGE分析发现INU的表观相对分子质量为9．0×10^4,大于理论预测值6．0×10^4。纯化酶液的表征结果表明,INU的最适温度和最适pH分别为55℃和5．0,在此条件下INU对菊粉的K。值和比酶活分别为1．90mmol／L和433．86U／mg,对蔗糖的K。值和比酶活分别为27．81mmol/L和1249．49U／mg,I/S值为0．34;HPLC分析表明,INU酶解菊粉的产物由果糖和葡萄糖组成;金属离子Mn2＋、Fe3｜、K｜和Co2＋对酶有促进作用,而Zn2＋、Cu2＋、Ni2＋、SDS和EDTA对酶活力有不同程度的抑制作用。