以Aβ4-11为免疫原制备Aβ1-42多克隆抗体

β淀粉样蛋白1-42(βamyloid 1-42,Aβ1-42)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的主要致病蛋白,其抗体一直处于研发当中。现以Aβ4-11耦联KLH免疫2月龄雌兔,ELISA检测雌兔免疫血清中所产生的抗Aβ4-11 IgG滴度,Protein G-琼脂糖亲和层析纯化IgG,Bradford方法进行IgG蛋白含量测定,SDS-PAGE进行IgG纯度测定,最后运用所制备的多克隆抗体采用免疫组化的方法分别对正常小鼠和9月龄APP转基因小鼠进行老年斑的检测,以鉴定此抗体对Aβ1-42的特异性及亲和力。结果显示Aβ4-11具有良好的体液免疫原性,而且以其为免疫原制备的抗体对Aβ1-42表现出良好的特异性及亲和力。结果表明,以Aβ4-11亚单位片段为免疫原制备的Aβ1-42多克隆抗体,可以作为AD的一种有效研究工具,同时也为AD的诊断和治疗提供了一种新的可能。     

响应面法优化巨大芽孢杆菌中的聚-β-羟基丁酸(PHB)提取工艺

为获得聚-β-羟基丁酸(PHB)提取的最佳工艺,以氯仿浓度,提取时间,和提取温度为影响因子,在单因素实验结果的基础上,应用Box-Benhnken中心组合方法进行三因素三水平的实验设计,以PHB提取量为响应值,运用响应面法(RSM)对提取条件进行进一步的优化。结果表明:在氯仿浓度69.7%,提取温度59.7℃,提取时间3.0 h的条件下,PHB提取量达到最大值4.430 g/L。     

腾冲嗜热厌氧杆菌6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的表达与结晶及其功能鉴定

6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (PbgL,EC 3.2.1.86) 催化由磷酸烯醇式丙酮酸 糖磷酸转移酶系统(PEP-PTS)转运入胞内的某些磷酸化二糖水解．一段来自腾冲嗜热厌氧杆菌 (Thermoanaerobacter tengcongensis) 编码PbgL (436个氨基酸残基) 的开放阅读框 (ORF TTE0337)被成功克隆,并在大肠杆菌BL21(Escherichia coliBL21)中有活性地表达．序列分析显示,该6-磷酸-β-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶家族4(GH4),与枯草杆菌(Bacillus subtilis)的LicH,海栖热袍菌(Thermotoga Maritima)的BglT的一致性分别为62%和40%．纯化后的重组PbgL(rPbgL)经SDS-PAGE分析,为1条分子量约50 kD的蛋白条带,与推测的分子量大小一致．该酶需要Mn²⁺、NAD⁺ 和 还原剂为辅因子,能专一性地水解pNPβG6P,并在85 ℃达到最高酶活性．Western免疫印迹实验,利用针对rPbgL的多克隆抗体血清,能从腾冲嗜热厌氧杆菌胞内检测到PbgL的表达．此外,rPbgL的蛋白晶体已被筛选获得,并收集到2.4Å分辨率的衍射数据．采用分子置换法的结构解析目前仍在进行中．     

吩嗪-1-羧酸发酵培养基配方的初步确定

对本公司自主分离、优化得到的新型农用抗生素吩嗪-1-羧酸的产生菌STH16#生产吩嗪-1-羧酸的发酵培养基配方的初步确定。经实验确定吩嗪-1-羧酸的发酵培养基配方为:甘油15.0g/L、蛋白胨20.0g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁2g/L。前体饲喂:在接种后8小时加入质量分数为2.0g/L的MCS。发酵产量可达2500mg/L。     

用错配PCR技术检测中国人β-地中海贫血基因突变

β-地中海贫血(β-地贫)的分子基础主要为点突变,目前中国β-地贫人群中已发现16种点突变。我们在基因频率调查的基础上,发现我国南方95％以上的β-地贫由5种点突变所致,它们是:codon 41-42(-CTTT)缺失突变,IVS-2 nt 654(C→T)突变,codon 17     

凝乳酶β-转角突变体的构建、表达和性质分析

为了阐明牛凝乳酶的第二个发夹结构中的Ⅵ型β-转角的功能,利用基因突变技术,将该转角的氨基酸残基(Leu20-Gly21-The22-Pro23-Pro24-Gln25)改为(Leu20-Gly-Gly-Gln25)、(Leu20SerGlyGln25)或(Leu20GlySerGln25),得到3个突变牛凝乳酶原表达质粒Pmcgg,Pmcsg和Pmcgs。除Pmcgs不能在大肠杆菌中表达外,Pmcgg和Pmcsg均能以包含体的形式进行表达,且表达水平与野生型相当。像野生型凝乳酶原一样,Pmcgg和Pmcsg的表达产物经过变性复性,均能自活化为假凝乳酶,而且复性后的酶原突变体在DEAESepharose CL6B上的柱行为与野生型相类似,但突变体假凝乳酶的凝乳及水解酪蛋白活性均明显低于野生型。说明突变对酶原的折叠影响较小,但对酶的催化效率影响较大。     

Ca2+与CaM对大白菜离体叶圆片Ca2+-ATPase和β-1,3-葡聚糖合成酶活性的影响（简报)

经 Ｃａ~（２＋）与 ＣａＭ促进剂和抑制剂处理的大白菜离休叶圆片,其细胞膜 Ｃａ~(２＋)ＡＴＰａｓｅ活性同时受Ｃａ~（２＋）与ＣａＭ的调节,而β－１,３－葡聚糖合成酶活性仅受 Ｃａ~（２＋）的调节,与 ＣａＭ无关。     

L-天冬氨酸-α-脱羧酶高产菌株初筛方法的建立

通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法对L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)高产菌株的初筛方法进行研究。分别检测转化体系中底物L-天冬氨酸减少引起的pH变化及产物CO2和β-丙氨酸的增加量,并用高效液相色谱法比较这四种方法的准确性。结果表明:CO2能溶于转化液,难以用倒置管收集完全;PanD系胞内酶,难以用平板点种法改变平板的pH;β-丙氨酸和L-天冬氨酸在Berthelot检测中吸收值均偏低,不适用于PanD高产菌的筛选;纸层析法可以直接检测β-丙氨酸和L-天冬氨酸,成本低,操作简单,具一定的精确度,可以较大规模地筛选PanD高产菌株。     

β-肾上腺素能受体在NO抑制小鼠回肠自主收缩中的作用

目的：观察一氧化氮（nitric oxide,NO）供体左旋精氨酸（L-argnine,L—Arg）对小鼠回肠自主收缩幅度的影响,探讨肛肾上腺素能受体在NO抑制小鼠回肠自主收缩中的作用。方法：应用张力换能器记录标本自主收缩的方法,以回肠肌条自主收缩幅度变化为指标,观察一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）抑制剂L-NNA,可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylyl cyclase,sGC）抑制剂ODQ（1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-aJquinoxalin-1-one）,β-肾上腺素能受体激动荆异丙肾上腺素（Isoprenaline,ISO）和拮抗剂普萘洛尔（Propranolol）对NO作用的影响。结果：①L—Arg抑制小鼠回肠自主收缩幅度,呈浓度依赖性。②L-NNA（3×10^-4mol／L）,ODQ（3×10^-4mol／L）均减弱L-Arg的抑制效应。③Propranolol（3×10^-6mol／L）明显减弱L—Arg的抑制效应。④ISCO（1×100mol／L）明显增强L—Arg的抑制效应。而Propranolol（3×10^-6mol／L）和ISCO（1×10^-7mol／L）孵育组,L—Arg的抑制作用无明显变化。结论：L-Arg经NOS催化生成NO后经cGMP途径发挥对小鼠回肠自主收缩的抑制作用,良受体途径也部分参与了NO的作用过程。     

血管紧张素-（1-7）对糖尿病大鼠肾脏PDGF、TGF-β的影响

目的:通过观察血管紧张素-(1-7)(Ang-(1-7))作用后糖尿病大鼠肾脏PDGF(血小板源性生长因子)、TGF-β1(转化生长因子β1)的变化,研究其对糖尿病大鼠肾脏的作用。方法:将SD大鼠分为单肾切除对照组(C组)、糖尿病模型Ang-(1-7)干预组(T组)及糖尿病模型对照组(D组)三组进行研究。分别检测空腹血糖、血尿素氮、血肌酐,24h尿总蛋白;同时用1000倍显微镜观察肾脏组织改变情况及用RT-PCR法检测肾脏组织内PDGF、TGF-β1的基因表达水平。结果:T组肾重体重比(RW/BW)、尿蛋白定量、mRNA表达水平等指标明显下降,与D组相比具有非常显著性差异(P<0.01),肾脏组织光镜下差别显著,D、T组较C组大鼠肾小球体积增大,且以D组病变明显。结论:Ang-(1-7)具有延缓糖尿病大鼠肾脏病变病发生、发展的作用。     

Aβ对阿尔茨海默病影响机制的研究进展

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以突触丢失、认知功能衰退和渐进性神经元死亡为特征的退行性神经系统疾病,主要临床表现为认知能力下降和行为障碍.在众多病因学说中,淀粉样蛋白斑块是AD病理的主要标志,在AD的发病过程中起着相当重要的作用.胞外β淀粉样蛋白(amyloid β-protein,...     

秦岭地区大林姬鼠(Apodemus peninsulae)的酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶的研究

用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分析了大林姬属(Apodemus peninsulae)心、肝、脾、肾和腿肌的α—酯酶、β—酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶。结果表明3种同工酶的活性在5种器官组织中均有明显差异,其中以肝组织的酯酶活性最高;不同器官组织的酶谱也有明显差别,如脾的β—酯酶仅有B区带;同一器官组织通常以α—酯酶活性高于β—酯酶。苹果酸脱氢酶在碱性溶液中染色,肝组织有明显的AB区。心肌与腿肌的苹果酸脱氢酶活性略高于其他组织。     

通过番茄红素环化酶的优化构建β-胡萝卜素高产菌株

目标产物的合成途径往往需要对关键酶的来源、表达水平等因素进行系统性优化才能实现代谢通量的最大化。β-胡萝卜素是一类具有重要应用价值的萜类化合物,其中番茄红素环化酶(Lycopene cyclase,CrtY)是β-胡萝卜素合成途径中的关键酶,能够催化FAD依赖的环化反应将番茄红素转化合成β-胡萝卜素。本研究通过对CrtY的系统优化提高β-胡萝卜素的合成水平,并确定CrtY的表达对代谢通路的影响。在大肠杆菌中以番茄红素合成模块为基础,通过引入番茄红素环化酶基因crt Y构建了β-胡萝卜素合成模块。并进一步利用寡聚接头介导的DNA组装方法 (Oligo-linker mediated assembly method,OLMA)引入一系列不同强度的人工设计的核糖体结合位点(Ribosome-binding site,RBS),对CrtY的表达强度、基因来源等因素进行高通量的优化。通过OLMA文库构建和平板筛选,获得了5株高产β-胡萝卜素的工程菌株。在摇瓶中,5株工程菌株的β-胡萝卜素产量可达15.79-18.90 mg/g DCW(Dry cell weight),比优化前提高了65%。进一步选取了其中的CP12菌株,在5 L发酵罐上,利用高密度培养技术验证工程菌株合成β-胡萝卜素的能力。最终β-胡萝卜素产量可达1.9 g/L。RBS强度分析及代谢中间体分析表明,适当地降低CrtY表达强度能够有利于β-胡萝卜素模块相关基因之间协同发挥作用。以上结果为β-胡萝卜素合成途径的优化规律提供了理论指导。     

氧化应激与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种多病因神经退行性疾病,以β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集沉积引起的老年斑(senile plaque,SP),聚集的磷酸化微管稳定蛋白质(tau)引起的细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)为主要病理特征。活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的增加引起的氧化应激和抗氧化防御酶功能丧失在AD形成中具有重要作用。综述近年来这方面的研究进展,着重总结了AD中的生物大分子(脂质、蛋白质和核酸)氧化以及Aβ和金属离子(铁、铜和锌等)动态平衡紊乱诱导的氧化应激与AD的关系,同时介绍了AD中氧化应激相关的信号转导,旨在对今后这方面的研究及预防和治疗AD提供帮助。     

1,4-β-葡聚糖内切酶基因的克隆及其在麝香百合花粉和花粉管中的特异表达

利用RT-PCR和RACE在麝香百合(Lilium longiflorum Thunb.)花粉管中克隆到1,4-β-葡聚糖内切酶(Endo-1,4-β-glucanase,EGase)的全长cDNA序列(LlpCel1).序列分析结果表明:该基因编码一个含有490个氨基酸的球状蛋白,并在N端有一个由21个氨基酸构成的信号肽序列.序列比对结果显示,LlpCel1和植物分泌型1,4-β-葡聚糖内切酶高度同源(约50%),不含有跨膜结构域和纤维素结合域(CBD).Northern杂交结果显示,该基因的转录本仅在花粉粒、萌发中的花粉和花粉管生长过程中表达,表达量基本相同.而在百合植株其他组织中均未见表达.这种葡聚糖内切酶的高度特异表达说明LlpCel1对花粉萌发和花粉管伸长起着重要作用.     

烟草肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酸-辅酶A基因的

肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸-辅酶A(4CL)是烟草苯丙烷代谢途径的关键酶,其多酚类产物与烟草品质密切相关。本研究以酚类物质含量合成差异较大的2个烤烟品种红花大金元(HD)和K326为试验材料,利用同源克隆技术获得这2种烟草Ntc4h和Nt4cl基因的cDNA序列并进行表达特性分析。结果表明,在2个品种中Ntc4h和Nt4cl各有2个同源基因,Ntc4h1、Ntc4h2、Nt4cl1和Nt4cl2的ORF长度分别为1518 bp、1518 bp、1644 bp和1629 bp。Nt4cl1、Ntc4h1和Ntc4h2在编码序列上存在品种间差异。实时荧光定量PCR分析结果表明,该2种酶的基因在烟草中具有明显的时空表达特异性,2种酶基因在根、茎、叶、花和萼片中都有表达,在茎的木质部和韧皮部中的表达量均显著高于其他组织;在圆顶期和适熟期表达水平较高,在适熟期达到最高;且两品种中的表达模式存在差异。     

分子疫苗防治老年性痴呆小鼠模型的研究进展

老年斑是老年性痴呆(Alzheimer's disease, AD)的特征性病理改变,β-淀粉样(β-amyloid,Aβ)是其主要成分.将Aβ作为疫苗对动物进行免疫,有明显抑制转基因小鼠脑内Aβ的沉积,清除原有斑块的作用,从而减少异常Aβ沉积对认知功能的损害.疫苗没有引起针对动物自身抗原的免疫反应,对中枢神经系统的正常功能也没有明显损害.     

（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯的微生物法合成

采用酿酒酵母CGMCC No．2266菌体,不对称还原β-羰基苯丙酸乙酯制备光学纯（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯。结果表明：采用初始pH为8．0的液体发酵培养基培养的CGMCCNo．2266菌体经过50℃预热处理30min后用于生物转化获得的（S）-（-）-G-羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值可以达到100％ee。确定了合成（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯的较佳转化条件为pH7．0,温度30℃,转化时间24h,底物浓度为3．63mmol／L,菌体用量为86g/L（干重／反应体积）。以10％葡萄糖为辅助底物,产率比不加辅助底物时提高了75．4％。在最佳转化条件下反应转化率及（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值可分别达到98．4％和100％ee。     

Aβ1-15疫苗预防Tg2576小鼠脑病理变化和认知退化的研究

探讨Aβ亚单位疫苗接种后对Tg2576小鼠脑病理变化和认知退化的预防作用．32只5月龄Tg2576小鼠随机分成4组：对照组（只接种佐剂）,Aβ42组（接种Aβ42疫苗）,Aβ1-15小组（接种Aβ1-15疫苗）和Aβ36-42组（接种Aβ36-42疫苗）,每组8只,3组接种疫苗小鼠的血清抗Aβ42抗体滴度比对照组显著增高;脑组织匀浆内也可检测到少量抗体．Morris水迷宫实验结果显示Aβ42组、Aβ1-15小组和Aβ36-42组与对照组小鼠的行为学有明显改善．取各组2只小鼠的脾细胞培养,经Con A或各自抗原刺激后,3组疫苗免疫后小鼠脾细胞增殖显著高于对照组;Aβ42组,IL-4和IL-10相对较高,而IL-2和INF-γ相对较低;Aβ1-15小组中IL-4和IL-10较高;Aβ36-42组IL-2和INF-γ较高．免疫组织化学法显示对照组小鼠脑皮质与海马部位有大量老年斑,而Aβ42组和Aβ1-15组脑内无老年斑出现,Aβ36-42组小鼠脑内有少量老年斑．实验证明Aβ1-15亚单位疫苗可防止Tg2576小鼠认知行为的退化,阻止Tg2576小鼠脑内Aβ沉积和老年斑的形成．     

重组大肠杆菌合成聚(3-巯基丙酸)和聚(3-羟基丁酸-3-巯基丙酸)的研究

利用Clostridium acetobutylicum的丁酸激酶基因 (buk) 和磷酸转丁酰基酶基因(ptb),以及Thiocapsa pfennigii的PHA合成酶基因,设计了一条能够合成多种聚羟基烷酸的代谢途径,用构建的质粒转化大肠杆菌,获得了重组大肠杆菌菌株.前期的研究表明,在合适的前体物条件下,该重组大肠杆菌能够合成包括聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-戊酸)等多种生物聚酯[Liu and Steinbüchel, Appl. Environ. Microbiol. 66739-743].利用该重组大肠杆菌,通过生物催化作用合成了3-巯基丙酸的同型共聚酯,同时利用该重组大肠杆菌还获得了含3-巯基丙酸单体的多种异型共聚物.实验首先研究了3-巯基丙酸对大肠杆菌生长的影响,在此基础上优化了培养过程中添加3-巯基丙酸的时机和浓度,结果表明,在实验的条件下,细胞合成聚(3-巯基丙酸)可达6.7%(占细胞干重),合成聚(3-羟基丁酸-3-巯基丙酸)(分子中3-巯基丙酸3-羟基丁酸=31)可达24.3%.实验进一步研究了同时或分别表达以上3个基因的重组大肠杆菌合成聚合物的能力,结果表明只有当3个基因同时表达时才能合成聚合物,说明3个基因对合成过程是必须的,从而表明了合成途径是按照设计的路线进行的.还通过GC/MS、GPC、IR等手段对合成的化合物进行了定性的研究.聚(3-巯基丙酸)或聚(3-羟基丁酸-3-巯基丙酸)等聚酯属于一类新型生物聚合物,它在分子骨架中含有硫酯键,不同于聚羟基烷酸酯的氧酯键,从而具有显著不同的物理、化学、光学等性质和具有重要的潜在应用价值.