蛋白质磷酸化与基因转录的调节

蛋白质磷酸化与基因转录的调节敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）基因的转录受顺式作用元件和反式作用因子的控制,涉及很多蛋白质与ＤＮＡ,蛋白质与蛋白质之间的复杂反应,在这些反应中,蛋白质的磷酸化与去磷酸化起着重要的调节作用。在已详细研究的转录因子中,都存在磷酸化与非磷酸化的两种形式。磷酸化对转录因子的活性调节主要在三个水平上起作用：控制转录因子从细胞质到细胞核的运转,影响转录因子与特异DNA序列的结合, 调节蛋白质因子转录激活区与其他因子的作用。     

磷酸化蛋白质组学分析和定量技术的研究进展

蛋白质的磷酸化是一种可逆性的蛋白质翻译后修饰,在生物体内起着极为重要的作用.近年来蛋白质翻译后修饰日益成为蛋白质组研究的热点之一.定量磷酸化蛋白质组学方法和技术的快速发展为研究蛋白质磷酸化时空动态变化,更好地了解生物学功能调节网络奠定了坚实的基础.作为蛋白质组学研究的一个重要组成部分,定量磷酸化蛋白质组学因其磷酸化蛋白质所具有的独特特征,在技术和方法研究方面将面临更为严峻的挑战.综述了磷酸化蛋白质组学定量的一些分析技术和方法的发展现状、优缺点以及未来的发展趋势.     

人胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞间酪氨酸磷酸化的比较蛋白质组学研究

比较人正常胃黏膜上皮细胞GES-1与人胃癌细胞SGC-7901间酪氨酸磷酸化蛋白质的差异,筛选差异磷酸化蛋白质分子,为揭示胃癌发生发展的分子机制提供新的理论依据.采用免疫沉淀方法从人胃黏膜上皮细胞GES-1与人胃癌细胞SGC-7901总蛋白质中免疫沉淀出酪氨酸磷酸化蛋白质,用SDS-PAGE和二维凝胶电泳技术分离沉淀出的酪氨酸磷酸化蛋白质,银染,差异蛋白点进行胶内酶解,采用MALDI-TOF/TOF-MS质谱进行差异蛋白质鉴定.结果显示获得了7个差异酪氨酸磷酸化蛋白质,这些蛋白质涉及细胞骨架、细胞调控等.通过比较正常胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞内酪氨酸磷酸化蛋白质的差异,筛选获得7个差异酪氨酸磷酸化蛋白质分子,有助于深入研究胃癌发生发展的分子机制,进而为胃癌的早期诊断和防治提供新的理论依据和作用靶标.     

蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰对tau蛋白磷酸化修饰的影响

蛋白质的O位N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化修饰是一种新近发现的广泛存在于细胞核蛋白与细胞浆蛋白的蛋白质翻译后修饰.其性质与经典的膜蛋白和分泌蛋白的糖基化修饰不同,而与蛋白质磷酸化修饰更相似.O-GlcNAc糖基化和磷酸化均修饰tau蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基,通过改变O-GlcNAc糖基化供体底物浓度以及其关键酶活性等方法,改变分化后成神经细胞样的PC12细胞中的蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰水平,然后用特异性识别不同位点磷酸化的tau蛋白抗体,进行蛋白质印迹分析来检测tau蛋白磷酸化水平的变化.结果发现细胞内蛋白质O-GlcNAc糖基化对tau蛋白磷酸化的影响,在不同的磷酸化位点其影响不同.增加蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰导致tau蛋白大多数磷酸位点的磷酸化水平降低,反之亦然.这些结果说明,tau磷酸化在大多数位点受到O-GlcNAc糖基化修饰的负性调节.这一研究为阐明调节tau蛋白磷酸化水平的机理和阿尔茨海默病脑中tau异常过度磷酸化的分子机制提供了新的线索.     

蛋白质可逆磷酸化调节植物细胞离子跨膜运动研究进展

蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的可逆磷酸化是植物细胞中多种信号转导途径中重要的组成因子.本文对蛋白质可逆磷酸化通过调节多种离子跨膜运动而参与植物细胞激发子信号途径、毒性物质诱导的钙离子内流、盐胁迫适应、气孔运动以及蛋白质可逆磷酸化参与胞外与胞内之间Ca2 状况信息传递,调节花粉管顶端Ca2 离子通道活性进行综述,以揭示蛋白质可逆磷酸化在植物细胞离子跨膜运动中的调控作用,为蛋白质可逆磷酸化调节植物生长发育、响应逆境胁迫等机理的研究提供参考.     

玉米早期花药蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析

蛋白质磷酸化修饰是调控其功能的一种重要方式。植物有性生殖过程在农作物产量形成和物种繁衍过程中起着重要作用。作为植物雄性生殖器官的花药,其正常生长发育对于保证形成功能性配子(花粉)以及完成双受精过程至关重要。本研究以重要农作物玉米(B73)为材料,利用Nano UHPLC-MS/MS质谱技术对玉米早期发育的花药在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平进行全面分析,以探究玉米花药发育过程中的蛋白调控网络和磷酸化修饰调控网络。在蛋白质组学分析中,共鉴定到了3 016个多肽,匹配到1 032个蛋白质上。通过Map Man分析,预测到了一些和花药发育相关的蛋白质,例如受体激酶(GRMZM2G082823_P01、GRMZM5G805485_P01等)。另外,在磷酸化蛋白质组学研究中,通过对Ti O2亲和层析富集到的磷酸化多肽进行质谱分析,检测到了257个磷酸化多肽,匹配到210个蛋白质上。我们的数据揭示了玉米花药发育过程中的223个磷酸化位点。与已发现的玉米中的86个磷酸化蛋白质(植物蛋白磷酸化数据库(P3DB):http://www.p3db.org/organism.php)相比,其中203个磷酸化蛋白和218个磷酸化位点为首次揭示。进一步生物信息学分析表明:磷酸化在14-3-3蛋白质、激酶、磷酸酶、转录因子、细胞周期和染色质结构相关的蛋白质介导的玉米早期花药发育过程中起着重要的调控作用。总之,本研究首次在蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学水平研究了玉米早期花药发育的蛋白质调控网络,不仅丰富了玉米蛋白质和磷酸化修饰蛋白质数据库,并为利用遗传学和生物化学手段深入研究玉米花药发育的分子调控机理提供了基础。     

细胞外钙调素对烟草悬浮培养细胞蛋白质磷酸化作用的影响

用液体闪烁计数法研究了细胞外钙调素对烟草悬浮培养细胞质蛋白质磷酸化的作用。结果表明烟草细胞细胞质蛋白质磷酸化活性在细胞培养过程中逐渐增加,达到最高峰后又开始下降。在细胞质蛋白质磷酸化强度高峰时,加入抗CaM血清后,细胞质蛋白质磷酸化活性受到了部分抑制。加抗CaM血清后再补加CaM能够部分解除抗CaM血清对细胞质部分与细胞核部分蛋白质磷酸化的抑制作用。外加纯化钙调素可以引起烟草悬浮培养细胞细胞质蛋白质磷酸化的活性增强,并且这种增强作用具有时间（高峰为70min）与剂量（最适为CaM10-7mmol/L）依赖性。CaM引起的细胞质蛋白质磷酸化变化与红光所引起的细胞质蛋白质磷酸化变化在时间进程上是不相同的。     

神经节苷脂GM3对J6－2细胞蛋白质磷酸化的影响

通过研究神经节苷脂GM₃对国人单核样白血病细胞系J6-2细胞蛋白质磷酸化的影响,在[γ- ³²P]ATP,GM₃,ATP,Mg²⁺与J6-2细胞液及颗粒两部分共同反应,10min(30℃)体系中,观察到GM₃对两部分蛋白质磷酸化的调节作用.GM₃(100μmol/L)促进颗粒部分分子量为180 000,87 000,78 000,67 000,43 000及31 000的蛋白质磷酸化,促进胞液部分分子量为87 000及56 000的蛋白质磷酸化,而且能抑制70 000及43 000蛋白质磷酸化.由于GM₃已被前人证实能对J6-2细胞起分化作用,其作用时间长达4-6d,很可能GM₃对蛋白质磷酸化作用的调节是GM₃促分化作用的早期信号.     

神经节苷脂GM_3对J6－2细胞蛋白质磷酸化的影响

通过研究神经节苷脂ＧＭ＿３对国人单核样白血病细胞系Ｊ６－２细胞蛋白质磷酸化的影响,在［γ－￣３２Ｐ］ＡＴＰ,ＧＭ＿３,ＡＴＰ,Ｍｇ￣（２＋）与Ｊ６－２细胞液及颗粒两部分共同反应,１Ｏｍｉｎ（３０℃）体系中,观察到ＧＭ＿３对两部分蛋白质磷酸化的调节作用。ＧＭ＿３（１００μｍｏｌ／Ｌ）促进颗粒部分分子量为１８００００,８７０００,７８０００,６７０００,４３０００及３１０００的蛋白质磷酸化,促进胞液部分分子量为８７０００及５６０００的蛋白质磷酸化,而且能抑制７００００及４３０００蛋白质磷酸化。由于ＧＭ＿３已被前人证实能对Ｊ６－２细胞起分化作用,其作用时间长达４－６ｄ,很可能ＧＭ＿３对蛋白质磷酸化作用的调节是ＧＭ＿３促分化作用的早期信号。     

N-乙酰氨基葡萄糖化在信号转导中的作用

蛋白质磷酸化在生命活动以及信号转导过程中的重要作用已经被研究证实,但不少研究发现在大多数核,胞液蛋白质上不仅存在磷酸化动态修饰,还存在广泛的动态N－乙酰氨基葡萄糖修饰,N－乙酰氨基葡萄糖基转移酶和N－乙酰氨基葡萄糖基酶以类似于蛋白质激酶和磷酸酶的方式调节蛋白质是否发生N－乙酰氨基葡萄糖化。N－乙酰氨基葡萄糖化蛋白质主要分布在细胞核与胞液,其生理功能涉及细胞基本生命活动和调节信号传递。N－乙酰氨基葡萄糖的作用基础与阻断或影响蛋白质的磷酸化有关。     

In the Beginning,There Was Protein Phosphorylation

The importance of reversible protein phosphorylation to cellular regulation cannot be overstated. In eukaryotic cells, protein kinase/phosphatase signaling pathways regulate a staggering number of cellular processes, including cell proliferation, cell death (apoptosis, necroptosis, necrosis), metabolism (at both the cellular and organismal levels), behavior and neurological function, development, and pathogen resistance. Although protein phosphorylation as a mode of eukaryotic cell regulation is familiar to most biochemists, many are less familiar with protein kinase/phosphatase signaling networks that function in prokaryotes. In this thematic minireview series, we present four minireviews that cover the important field of prokaryotic protein phosphorylation.     

Protein phosphorylation: hormones, drugs, and bioregulation

Reversible protein phosphorylation is widely recognized as an important mechanism for the regulation of cell function by a variety of physiological stimuli. Exposure of cells to hormones, neurotransmitters, and growth factors initiates a cascade of events facilitated by intracellular second messengers and mediated in many cases by protein kinases and/or phosphatases. The subsequent covalent modification of target proteins and the associated changes in their function account for the physiological response. Considerable evidence points to cross-talk between multiple membrane-associated signaling processes leading to coordinated regulation of cellular processes. The role of protein phosphorylation at multiple points in the pathways that integrate these signals is becoming increasingly apparent. Pharmacological modulation of cellular protein phosphorylation has yielded useful information on the molecular events involved. This review surveys some of the recent progress in hormonal regulation of cell function, focusing on examples that may provide new insight into the role of protein phosphorylation in the coordinated control of cellular processes by physiological stimuli.     

Alternative splicing of potassium channels: a dynamic switch of cellular excitability

Alternative splicing of pre-messenger RNA and reversible protein phosphorylation are fundamental mechanisms for regulating protein structure and function. Recent studies of one class of potassium channel (BK(Ca)) reveal dynamic reciprocal interactions between pre-mRNA splicing and protein phosphorylation. Splicing is regulated by phosphorylation, and exon selection determines the sensitivity of the channel protein to regulation by protein phosphorylation. These studies reveal a powerful dynamic molecular switch to determine cellular excitability.     

光系统II蛋白磷酸化及其生理意义

蛋白磷酸化修饰在几乎所有的生命活动中都起重要的调节作用.该文结合作者研究组的研究工作,概述了光系统II(PS II)蛋白磷酸化的调节及其生理功能.PS II复合体中的核心组分D1、D2、CP43和PsbH蛋白以及外周捕光天线(LHC II)蛋白都可以发生磷酸化.PS II蛋白磷酸化受质醌(PQ)的氧化还原状态、细胞色素b6f (Cyt b6f ) 和硫氧还蛋白以及光调节.PS II蛋白磷酸化可以调节激发能在两种光系统(PS I和PS II)之间的分配,减轻光胁迫对PS II的压力,保护核心蛋白免于光破坏,稳定PS II复合体的结构.     

Light-dependent phosphorylation of D1 reaction centre protein of photosystem II: hypothesis for the functional role in vivo

Reversible phosphorylation of the D1 reaction centre protein of photosystem II (PSII) occurs in thylakoid membranes of higher plants. The significance of D1 protein phosphorylation in the function of PSII is not yet clear. This paper summarizes the data implying that phosphorylation of D1 protein in higher plants is involved in the regulation of the repair cycle of photoinhibited PSII centres. Photoinhibition of PSII, D1 protein phosphorylation and degradation have been studied in vivo in higher plant leaves acclimated to different growth irradiances. It is shown that photoinhibitory illumination induces maximal phosphorylation of the D1 protein. Under these conditions D1 turnover is also saturated. We postulate that phosphorylation retards the degradation of damaged D1 protein under conditions where rapid replacement by a new D1 copy is not possible. This would protect PSII from total disassembly and degradation of all PSII subunits. We conclude that the phosphorylation of D1 protein and the regulation of D1 protein degradation may have evolved together. Furthermore, these characteristics seem to be related to the highly organized structure of higher-plant type thylakoid membranes, since the capability to phosphorylate D1 protein is restricted to seed plants.     

细菌蛋白质磷酸化修饰研究进展

细菌蛋白质磷酸化修饰是调控细菌基因表达的一种重要方式,在细菌诸多生命活动中发挥非常关键的作用。本文系统概括了近年来细菌蛋白质磷酸化修饰的种类、双组分调控系统中磷酸化修饰调控信号传导、酪氨酸残基磷酸化修饰以及丝/苏氨酸残基磷酸化修饰等,同时对不同种类细菌蛋白质磷酸化修饰的功能进行综述,这些研究将对人类了解细菌蛋白质翻译后修饰的磷酸化调控及其与控制细菌感染的关系提供参考价值。     

Kinases and phosphatases in the mammalian circadian clock

Posttranslational modifications of circadian oscillator components are crucial for the generation of circadian rhythms. Among those phosphorylation plays key roles ranging from regulating degradation, complex formation, subcellular localization and activity. Although most of the known clock proteins are phosphoproteins in vivo, a comprehensive view about the regulation of clock protein phosphorylation is still missing. Here, we review our current knowledge about the role of clock protein phosphorylation and its regulation by kinases and phosphatases in eukaryotes with a major focus on the mammalian circadian clock.     

Kinase-selective enrichment enables quantitative phosphoproteomics of the kinome across the cell cycle

Protein kinases are pivotal regulators of cell signaling that modulate each other's functions and activities through site-specific phosphorylation events. These key regulatory modifications have not been studied comprehensively, because low cellular abundance of kinases has resulted in their underrepresentation in previous phosphoproteome studies. Here, we combine kinase-selective affinity purification with quantitative mass spectrometry to analyze the cell-cycle regulation of protein kinases. This proteomics approach enabled us to quantify 219 protein kinases from S and M phase-arrested human cancer cells. We identified more than 1000 phosphorylation sites on protein kinases. Intriguingly, half of all kinase phosphopeptides were upregulated in mitosis. Our data reveal numerous unknown M phase-induced phosphorylation sites on kinases with established mitotic functions. We also find potential phosphorylation networks involving many protein kinases not previously implicated in mitotic progression. These results provide a vastly extended knowledge base for functional studies on kinases and their regulation through site-specific phosphorylation.