鸡血清与卵黄中抗中华眼镜蛇毒IgY动态变化研究

目的探索特异性IgY的产生和变化规律。方法用眼镜蛇毒原毒免疫产蛋母鸡,ELISA定期检测卵黄中的抗体效价变化,小鼠体外中和实验检测其生物活性。第1次免疫40周后,眼镜蛇毒攻击已免疫母鸡,检测攻击前后鸡血清中抗体效价变化情况,未经眼镜蛇毒免疫的母鸡作阴性对照。结果经免疫后第7天蛋黄中即可检测到抗体,经多次加强免疫,40周时蛋黄中还能保持高效价的抗体,通过分离纯化,此抗体可保护实验小鼠免受4 LD50眼镜蛇毒的攻击;同时,鸡血清中也保留着较高效价的抗体,可中和4 LD50以上的眼镜蛇毒。结论用眼镜蛇毒免疫鸡,经多次加强免疫,卵黄和鸡血清中可持久保持高效价的特异性抗体,初步检测此抗体可中和4 LD50的蛇毒。     

中华眼镜蛇蛇毒因子(CVF)对补体系统的作用及与人补体C[3]和其他蛇毒抗原性关系

中华眼镜蛇蛇毒经DEAE-Sepharose CL-6B、HPLC等多次柱层析分离出有抗补体及溶血活性的眼镜蛇蛇毒因子（Cobra venon factor,CVF)，纯化后的CVF在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上呈单一区带，分子量为225000—230000，等电点为6.20。用二硫苏糖醇还原经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得三类亚基，其分子量总和为237000。体外抗补体及溶血试验表明，CVF的作用是通过补体旁路途经使总补体活力下降。双向免疫电沪鉴定，发现CVF与人血清作用后，其中补体成分C[3]分子的抗原性发生改变，则表明CVF的作用是通过激活补体成分C[3]而发挥的。给豚鼠腹腔注射CVF（0.15 μg/g体重）后，其血清总补本水平下降到正常值的3%以下，7天后回升，13天后恢复到正常水平。单相免疫电泳表明，CVF与人补体C[3]抗血清间无任何交叉免疫反应，但人血清与CVF抗血清间有微弱的免疫沉淀反应。另外，CVF的氨基酸组成与人补体C[3]也较为相似。鉴定还表明眼镜蛇科中四种蛇毒与CVF抗血清有强烈的免疫沉淀反应，蝰蛇毒及海蛇毒也有免疫沉淀反应，但只有眼镜蛇毒具有抗补体活性。     

中华眼镜蛇蛇毒因子(CVF)对补体系统的作用及与人补作C_3和其他蛇毒抗原性关系

中华眼镜蛇蛇毒经DEAE-Sepharose CL-6B。HPLC等多次柱层析分离出有抗补体及溶血活性的眼镜蛇蛇毒因子(Cobra venom factor,CVF),纯化后的CVF在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上呈单一区带,分子量为225000—230000,等电点为6.20。用二硫苏糖醇还原经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得三类亚基,其分子量总和为237,000。 体外抗补体及溶血试验表明,CVF的作用是通过补体旁路途经使总补体活力下降。双向免疫电泳鉴定,发现CVF与人血清作用后,其中补体成分C_3分子的抗原性发生改变,则表明CVF的作用是通过激活补体成分C_3而发挥的。给豚鼠腹腔注射CVF(0.15ug/g体重)后,其血清总补体水平下降到正常值的3％以下,7天后回升,13天后恢复到正常水平。 单相免疫电泳表明,CVF与人补体C_3抗血清间无任何交叉免疫反应,但人血清与CVF抗血清间有微弱的免疫沉淀反应。另外,CVF的氨基酸组成与人补体C_3也较为相似。鉴定还表明眼镜蛇科中四种蛇毒与CVF抗血清有强烈的免疫沉淀反应,蝰蛇毒及海蛇毒也有免疫沉淀反应,但只有眼镜蛇毒具有抗补体活性。     

抗眼镜蛇毒血清对中华眼镜蛇伤大鼠保护的时效性研究

目的观察中华眼镜蛇伤后不同时期应用抗蛇毒血清对机体保护作用的差异,为探索临床抗蛇毒血清使用的最佳有效时段提供依据。方法将SD大鼠随机分成6组(蛇毒组、40、60、80、100、120 min血清保护组),每组30只。动物经戊巴比妥腹麻,于单侧背部皮下及双侧小腿腓肠肌注射眼镜蛇毒以制备中华眼镜蛇毒挑战剂量(4×LD50)大鼠模型,分5个不同时段分别注射抗蛇毒血清,于注毒后连续观察3 h,统计各组平均存活时间、成活率及保护率。结果蛇毒组大鼠注入挑战剂量的眼镜蛇毒后,平均存活时间为(148.8±11.4)min,成活率仅为20%;其他血清保护组分别于注毒后40、60、80、100、120 min经腹腔注射精制抗眼镜蛇毒血清(125 u血清/mg蛇毒),40 min血清组保护率达80%;60 min血清组存活率及保护率分别达到70%、50%,平均存活时间为(172.8±7.2)min,与蛇毒组相比有明显差异(P<0.01);而801、00 min血清组保护率依次下降,分别为40%、30%,但仍较蛇毒组显著提高(P<0.01);120 min血清组存活时间及保护率与蛇毒组比较差异无显著性。结论利用中华眼镜蛇毒挑战剂量大鼠模型,通过不同时段施予同剂量抗血清,可显示出明显的机体保护时效性,该研究为探讨临床正确使用抗蛇毒血清提供了新的实验依据。     

三种鸡形目雉科禽类卵黄抗体的纯化及二抗的制备

目的 纯化三种鸡形目雉科的禽类孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY,并且免疫家兔制备抗血清。方法 采用了水稀释法,HiTrap IgYPurification HP免疫亲和层析法和硫酸铵沉淀法纯化IgY。免疫家兔制备抗血清,免疫双扩散法测定效价。Protein-A亲和纯化兔抗IgY血清IgG。结果 经亲和纯化和盐析纯化,得到了孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY,经SDS-PAGE检测为电泳纯,孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY的相对分子质量约为180×10^3。免疫后经Protein-A亲和纯化后获得了兔抗IgY的IgG。结论 证实了孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY的存在及其特性。雉科鸡形目禽类卵黄抗体的纯化方法 相似,可以推广到鸡形目其它禽类的卵黄抗体的纯化中,获得的抗血清可以进一步进行标记和今后抗原的检测。     

鸡卵黄抗眼镜王蛇毒抗体IgY的理化特性

目的 研制抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体并研究该抗体的理化特性。方法 拟用减毒后的眼镜王蛇毒免疫母鸡后,从卵黄中制备抗眼镜王蛇毒抗体IgY。采用间接ELISA法对此抗体的理化特性进行研究。结果 ELISA显示免疫后12天开始出现特异性抗体,且抗体滴度逐渐升高,约在免疫后60天左右,最高可达1：100000,此最高滴度可维持30天,以后滴度逐渐降低,至免疫后100～110天,滴度仍可维持在最高滴度的一半(1：50000)。此抗体在10～65℃温度范围内活性保持稳定;在pH为4～12范围内,抗体活性稳定;此抗体经胰蛋白酶处理1h内,活性下降不明显,但1h以后活性迅速下降。结论从卵黄中制备抗眼镜王蛇毒抗体IgY,是可行的,稳定的。     

中华眼镜蛇伤大鼠模型多项电生理指标的动态观察

目的建立中华眼镜蛇毒挑战剂量的大鼠模型,通过对多项电生理指标的动态观察,为蛇毒毒理及抗蛇毒制剂的研究提供实验数据。方法将SD大鼠分为蛇毒组、血清保护组和对照组,戊巴比妥腹麻,连续记录心率、血压、呼吸频率及心电图等电生理指标的动态变化,观察眼镜蛇毒的毒性反应及抗蛇毒血清对动物的保护作用。结果腹腔注入挑战剂量(4×LD50:4×0.636 mg/kg)的中华眼镜蛇毒后,大鼠平均生存时间为(3±0.33)h。蛇毒组给药30~60 min后,心率及呼吸频率均有轻度加快,Ⅱ导联ST段抬升幅度超过同期正常对照0.1 mV以上(P<0.05);130~150 min后,心率、呼吸频率及动脉血压均直线下降;达180 min时,心率、呼吸频率及动脉血压均已降到同期正常对照的30%以下,差异非常显著(P<0.01)。血清保护组给药后各指标相对平稳,与对照组比较无明显差异。结论以4倍LD50为挑战剂量造模的中华眼镜蛇伤大鼠模型,心率、血压、呼吸频率及心电图等电生理指标的动态变化与临床症状基本相符。眼镜蛇毒抗血清可有效地中和、保护眼镜蛇毒对机体的伤害。     

十六种鸟类二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗16种鸟类的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为鸟类血清学检测系统的建立提供工具。方法采用水稀释法粗纯抗体后,再利用改良的饱和硫酸铵分级沉淀法,或亲和层析结合饱和硫酸铵沉淀法,或饱和硫酸铵沉淀法结合SDS-PAGE凝胶切胶纯化的方法进一步纯化鸟类的IgY,利用纯化的IgY免疫大耳白兔制备抗血清,用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鸟类的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鸟类的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blots考察标记抗体的特异性。结果纯化了灰雁、鸬鹚、鸵鸟、小鹈、鸽子、鹅、孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、草鹭、夜鹭、赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭等16种鸟类的IgY,免疫双扩散法测定兔抗这16种鸟类的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗灰雁IgY、兔抗鸬鹚IgY、兔抗鸵鸟IgY、兔抗小鹈IgY、兔抗鸽子IgY、兔抗鹅IgY、兔抗孔雀IgY、兔抗鹌鹑IgY、兔抗贵妃鸡IgY、兔抗草鹭IgY、兔抗夜鹭IgY、兔抗赤嘴潜鸭IgY、兔抗燕鸥IgY、兔抗长脚鹬IgY、兔抗虎皮鹦鹉IgY、兔抗翘鼻麻鸭IgY等16种兔抗鸟类IgY的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶800～80000左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了辣根过氧化物酶标记的兔抗16种鸟类的二级抗体,为鸟类血清学检测体系的建立提供了工具。     

抗蛇毒血清滴眼治疗眼镜蛇毒致眼外伤

目的观察单价抗眼镜蛇毒血清溶液滴眼治疗中华眼镜蛇毒(Naja naja atra,Chinese cobra)不慎进人眼睛引起外伤中毒性急性角膜炎的临床效果。方法观察1992～2002年我院急诊救治眼镜蛇喷毒或加工蛇毒时不慎蛇毒进人眼睛引起外伤性急性角膜炎8例男性病人,从受伤到就诊时间最快15min,最慢50min。就诊后立即用生理盐水冲洗受伤眼睛,紧接着给予单价抗眼镜蛇毒血清溶液滴人患眼0．5h后,用氯霉素眼药水、可的松(或地塞米松)眼药水交替滴眼,直至痊愈。结果使用抗蛇毒血清滴眼后局部疼痛、异物感等症状在20min内得到缓解,3天内眼睑红肿、结膜充血等角膜炎症状消失。8例病人均治愈,未留有后遗症。结论：单价抗眼镜蛇毒血清滴眼治疗中华眼镜蛇毒致眼外伤是非常方便有效的方法,可能与其能迅速中和眼睛内残留的蛇毒有关。     

抗蝰蛇毒IgY灌胃对蝰蛇伤小鼠保护作用的研究

目的 探讨抗蝰蛇蛇毒鸡卵黄抗体(immunoglobulin yolk,IgY)经腹腔注射或灌胃对蝰蛇伤小鼠保护作用,为其口服制剂的应用奠定理论基础.方法 用蝰蛇原毒单一抗原免疫母鸡,收集第12天以后的鸡蛋,用水稀释法提取抗蝰蛇毒IgY;间接法ELISA检测IgY的效价和灌胃小鼠体内IgY的吸收时间;以胃排空率实验确定蛇伤前灌胃IgY的最佳时间,以腹腔注射和不同浓度IgY灌胃实验分别检验IgY对蝰蛇伤小鼠的保护作用.结果 初次免疫后第12天开始收集抗体,水稀释法提取的IgY效价为1∶6400;不同浓度IgY灌胃后,2.5～3.5 h胃排空率均达61.8%以上,血浆中抗体效价亦相应达高峰;腹腔注射和IgY灌胃实验对蛇伤小鼠的保护作用明显,小鼠的存活时间与阴性IgY组小鼠相比差异显著(P＜0.05);同等效应下,灌胃IgY的有效剂量大约为腹腔注射的10～15倍.结论 抗蝰蛇蛇毒IgY经腹腔注射和灌胃实验均能有效保护蝰蛇伤小鼠.     

Preparation and characterization of immunoglobulin yolk against the venom of Naja naja atra

Chinese Cobra (Naja naja atra) bite is one of the leading causes of snake-bite mortality in China. The traditional anti-cobra venom serum therapy was found to be expensive and with high frequency of side effects. Therefore attempts were made to generate a high titer immunoglobulin from egg yolk (IgY) of crude cobra-venom immunized Leghorn hens, and to standardize an effective method for producing avian antivenom in relatively pure form. The IgY was isolated first by water dilution method to remove the lipid, then extracted by ammonium sulfate precipitation, and purified through anion exchange chromatogram. The different purities of IgY from different isolating stages were submitted to enzyme-linked immunosorbent assay and SDS-PAGE to determine their titers. Immunoblotting showed that the purified IgY (ion exchange chromatography fraction, IECF) recognized several antigenic fractions of cobra venom, and presented with the character of polyclonal antibody. IECF on SDS-PAGE under reducing conditions migrated as a 65 kDa heavy chain and a 35 kDa light chain, respectively. The LD50 of the N. naja atra venom was 0.62 mg/kg body weight in mice. Four times the LD50 dose of venom was selected as challenge dose, and the ED50 of IgY was 3.04 mg IECF/mg venom. The results indicate that the activity of anti-snake venom IgY could be obviously elevated by ion exchange chromatography, thus possessing therapeutic significance for snakebite envenomation.     

抗肺炎支原体卵黄抗体的制备及其免疫特性

目的制备抗肺炎支原体卵黄抗体,并研究其免疫特异性。方法以超声粉碎法制备肺炎支原体抗原;以ELISA法测定卵黄抗体的效价及免疫特异性;以水稀释法联合疏水层析的方法分离纯化卵黄抗体;应用SDS-PAGE法测定分子量及鉴定抗体纯度;改良Lowry法测定蛋白含量。结果低、高剂量组均诱导母鸡产生有效免疫应答,高剂量组免疫效价高于低剂量组。高剂量组于初免疫后约50d抗体效价达高峰,持续约2个月;而低剂量组在初免疫后约60d抗体效价达高峰,持续约1个月。之后效价逐渐下降,在免疫约120d,高剂量组由13log2下降到10log2;而低剂量组则由11log2下降到7log2。以水稀释法联合疏水层析法制备了电泳纯抗肺炎支原体IgY,分子量约178KD,平均每1ml卵黄液可获得较纯抗体6.4mg。制备的IgY与肺炎支原体具有较高特异性,与解脲支原体和人型支原体无明显交叉反应,与生殖支原体有轻度的交叉反应。结论本研究初步制备了抗肺炎支原体卵黄抗体,为肺炎支原体的防治与检测提供新的途径。     

抗中华眼镜蛇毒鸡卵黄抗体IgY的动物保护作用研究

目的通过连续观察蛇伤大鼠多项生理指标的动态变化,探讨不同时段施予血清（125u血清／mg蛇毒）同等效价但量加倍的抗蛇毒IgY对其心、肺功能保护的时效性。方法SD大鼠分为80、100、120min IgY保护组和蛇毒组共4组,戊巴比妥钠腹麻,按2倍LD50（1．272mg／kg）的剂量注入舟山眼镜蛇毒。连续3h记录呼吸频率、心电图和肌电等生理指标的动态变化,于注毒后80、100、120min分3个时段注入抗眼镜蛇毒IgY,比较各组大鼠的平均存活时间、保护率及心、肺、腓肠肌功能的差异。结果蛇毒组大鼠注入2倍LD5。的眼镜蛇毒后,平均存活时间为124．4min,存活率为0;80、100min IgY的存活率均达到或超过50％。但120minIgY组的保护作用不明显。与生理盐水组相比,各组心电图异常（心率减慢、ST段抬高）、呼吸频率减慢及肌电减弱多出现在100min以后。大鼠死亡前均出现潮式呼吸直至呼吸衰竭。结论应用与血清（125u血清／mg蛇毒）同等效价但量加倍的抗蛇毒IgY,可有效地减低蛇毒对机体心、肺、骨骼肌功能的损伤,提高生存率;与抗血清（125u血清／mg蛇毒）对蛇伤大鼠保护作用的结果相比,加量后保护作用更强．保护的有效时段有一定的延长。     

眼镜蛇毒对大鼠弓状核nNOS表达的影响

目的探讨眼镜蛇毒对大鼠弓状核神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)表达的影响。方法采用免疫组织化学方法分别显示眼镜蛇毒组、生理盐水组和正常对照组弓状核的nNOS表达。结果与生理盐水组和正常对照组相比,眼镜蛇毒组弓状核nNOS阳性神经元数量明显减少,细胞平均灰度值明显升高(P0.05)。结论眼镜蛇毒能够使大鼠弓状核nNOS表达降低。     

眼镜蛇毒对成年大鼠下托Nestin表达的影响

目的 探讨眼镜蛇毒对成年大鼠下托巢蛋白（Nestin）阳性神经细胞表达的影响.方法 采用免疫组织化学方法,观察并比较Nestin阳性细胞在眼镜蛇毒组、生理盐水组、正常对照组大鼠下托的表达.结果 眼镜蛇毒组大鼠下托Nestin阳性神经细胞比生理盐水组、正常对照组表达明显增强（P〈0.01）.结论眼镜蛇毒对大鼠下托Nestin表达有上调作用.     

眼镜蛇毒对大鼠延髓c-fos表达的影响

目的 探讨眼镜蛇毒对大鼠延髓c-fos表达的影响.方法 采用免疫组织化学方法,观察并比较c-fos阳性细胞在眼镜蛇毒组、生理盐水组、正常对照组大鼠延髓中的表达.结果 眼镜蛇毒组大鼠延髓外侧网状核c-fos阳性细胞明显多于生理盐水组和正常对照组(P＜0.01).结论 眼镜蛇毒对大鼠延髓c-fos表达有上调作用.     

眼镜蛇毒对成年大鼠齿状回Nestin表达的影响

目的探讨眼镜蛇毒对成年大鼠齿状回巢蛋白（Nestin）免疫反应阳性表达的影响。方法将24只成年SD大鼠随机分为正常对照组、生理盐水组、眼镜蛇毒组,每组8只。采用SABC免疫组织化学染色法观察齿状回Nestin的表达。结果与正常对照组、生理盐水组相比较,眼镜蛇毒组齿状回Nestin免疫反应阳性表达明显增强（P〈0.01）。结论眼镜蛇毒对成年大鼠齿状回Nestin的表达有上调作用,可能与促进内源性神经干细胞增殖有关。     

Inhibition of the Nicotinic Acetylcholine Receptors by Cobra Venom α-Neurotoxins: Is There a Perspective in Lung Cancer Treatment?

Nicotine exerts its oncogenic effects through the binding to nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) and the activation of downstream pathways that block apoptosis and promote neo-angiogenesis. The nAChRs of the α7 subtype are present on a wide variety of cancer cells and their inhibition by cobra venom neurotoxins has been proposed in several articles and reviews as a potential innovative lung cancer therapy. However, since part of the published results was recently retracted, we believe that the antitumoral activity of cobra venom neurotoxins needs to be independently re-evaluated.We determined the activity of α-neurotoxins from Naja atra (short-chain neurotoxin, α-cobrotoxin) and Naja kaouthia (long-chain neurotoxin, α-cobratoxin) in vitro by cytotoxicity measurements in 5 lung cancer cell lines, by colony formation assay with α7nAChRs expressing and non-expressing cell lines and in vivo by assessing tumor growth in an orthotopic Non-Obese Diabetic/Severe Combined Immunodeficient (NOD/SCID) mouse model system utilizing different treatment schedules and dosages.No statistically significant reduction in tumor growth was observed in the treatment arms in comparison to the control for both toxins. Paradoxically α-cobrotoxin from Naja atra showed the tendency to enhance tumor growth although, even in this case, the statistical significance was not reached.In conclusion our results show that, in contrast with other reports, the nAChR inhibitors α-cobratoxin from N. kaouthia and α-cobrotoxin from N. atra neither suppressed tumor growth nor prolonged the survival of the treated animals.     

眼镜蛇毒对成年大鼠海马CA3区Nestin表达的影响

目的探讨眼镜蛇毒对成年大鼠海马CA3区巢蛋白(Nestin)阳性细胞表达的影响。方法采用免疫组织化学方法,观察并比较Nestin阳性细胞在眼镜蛇毒组、生理盐水组、正常对照组大鼠海马CA3区的表达。结果眼镜蛇毒组大鼠海马CA3区Nestin阳性细胞较生理盐水组、正常对照组表达明显增强(P0.01)。结论眼镜蛇毒对成年大鼠海马CA3区Nestin表达有上调作用。