蛋白质定向进化的研究技术及应用

蛋白质定向进化是在人类改造蛋白质的过程中产生的。蛋白质定向进化通常分三步进行,即随机诱变、体外重组和筛选。每一步都有多种研究技术。蛋白质定向进化大大加速了人类改造蛋白质的步伐,在实际应用研究和基础理论研究中都具有重要意义。     

酶的定向进化研究及其在工业生物催化中的应用

综合概括了各种蛋白质改造与微生物代谢途径改造的非理性定向进化技术的原理、特点,介绍了这些技术在高性能工业生物催化剂改造中的应用。     

蛋白质定向进化的研究进展及其应用前景

定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略.它不需要了解蛋白质的空间结构,主要通过在实验室里模拟自然进化过程,采用错误倾向PCR等方法对编码蛋白质的基因进行随机突变,经DNA改组、交错延伸等技术进行体外重组,设计高通量筛选方法来选出需要的突变体.本综述了定向进化技术的发展及应用.     

蛋白质定向进化技术的研究进展

蛋白质定向进化技术是蛋白质分子改造的一个重要策略.重点介绍了易错PCR、DNA改组等对编码蛋白质的基因进行随机突变和重组的技术,以及构建突变体库和高通量筛选的方法,并探讨了定向进化技术在蛋白质工程中的应用及前景.     

酶的分子定向进化及其应用

酶的分子定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略,是一种在生物体外模拟自然进化过程的、具有一定目的性的快速改造蛋A质的方法.该方法引起了生物催化技术领域的又一次革命.目前分子定向进化技术已被广泛应用于工业、农业及制药业等的相关领域.本文详细综述了酶的分子定向进化的概念、过程、基本策略及其核心技术,并着重介绍了酶的分子定向进化技术在提高酶的活力、稳定性、底物特异性和对映体选择性等几方面的应用及取得的相关成果.     

酶技术发展与酶定向进化

在分子水平改良酶的结构和功能是对工业微生物菌种传统诱变育种的发展和扬弃。采用ＤＮＡ改组,酶定向进化,分子孵化技术改良产酶编码基因可大大提高产酶基因在宿主中的表达,从而提高酶的活力,增加酶的稳定性并产生其它附加功能。本文除了分析酶学研究和应用的一些最新观点和实施技术,还对当前酶制品的国际市场,传统酶与特殊酶的市场份额等作了介绍。     

改进酶稳定性的定向进化技术

酶作为一种生物催化剂,以其独特的优良特性,在绿色化学和清洁生产中得到了广泛的应用。随着酶定向进化技术的建立和发展,通过定向进化改进酶稳定性的研究越来越多。详细综述了各种定向进化方法的特点及在提高酶稳定性方面的应用,并从结构和功能的角度进一步解释了相关机理。     

D-泛解酸内酯水解酶的定向进化

易错PCR结合DNA改组方法向D-泛解酸内酯水解酶基因中引入突变,并构建突变体库。利用酶的催化特点和产物特性建立了基于平板初筛和高效液相复筛的两步法D-泛解酸内酯水解酶活性筛选系统。用该筛选系统以酶活力和pH稳定性为指标对突变体库进行筛选,最终获得一株酶活力高且在低pH条件下稳定性好的突变体Mut E-861。该突变体的酶活力是野生型酶的5.5倍。对突变体和野生型酶在pH 6.0和pH 5.0条件下的残余酶活进行对比,在这两种pH条件下,突变体酶的酶活残留分别为75%和50%,而野生型酶只能保持原来的40%和20%。通过软件对突变体Mut E-861酶基因和野生型酶基因进行分析对比,发现突变体Mut E-861酶基因发生了三处点突变,其中突变使两处氨基酸取代,另一处为沉默突变,未引起氨基酸的变化。     

基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化

运用定向进化-易错PCR方法,提高黄曲霉毒素解毒酶的活力及稳定性,并结合辣根过氧化物酶 (HRP)-隐性亮绿 (RBG) 快速高通量筛选系统,构建了库容约为104的突变体库。经过两轮易错PCR,最终分别获得了耐高温70 ℃突变酶A1773、pH 4.0稳定性的突变酶A1476,pH 4.0和pH 7.5均表现稳定性的突变酶A2863,其酶活力比野生酶分别提高了6.5倍、21倍和12.6倍。经序列分析表明,发现突变酶A1773发生了Glu127Lys和Gln613Arg突变;突变酶A2863发生了Gly73     

过氧化氢酶基因定向进化文库的构建及其评价

采用易错聚合酶链反应和DNA改组技术构建野生型梅花鹿过氧化氢酶(CAT)基因的突变体文库,并随机对两种方法所得产物各5个样品做序列测定。序列分析结果表明突变率分别为0.329%和27.58%,易错聚合酶链反应体系的错配率可以比普通PCR体系提高约10倍,DNA改组的突变率则更高,但是难以避免由于突变率太高造成的目的基因无法正确翻译这一情况。另外,应用邻接法(neighbor-joining, NJ)对随机选择的过氧化氢酶基因突变体序列和野生型序列做核酸和蛋白质序列的NJ进化树,进化关系与突变率分析基本一致。     

Simultaneous optimization of enzyme activity and quaternary structure by directed evolution

Natural evolution has produced efficient enzymes of enormous structural diversity. We imitated this natural process in the laboratory to augment the efficiency of an engineered chorismate mutase with low activity and an unusual hexameric topology. By applying two rounds of DNA shuffling and genetic selection, we obtained a 400-fold more efficient enzyme, containing three non-active-site mutations. Detailed biophysical characterization of the evolved variant suggests that it exists predominantly as a trimer in solution, but is otherwise similarly stable as the parent hexamer. The dramatic structural and functional effects achieved by a small number of seemingly innocuous substitutions highlights the utility of directed evolution for modifying protein-protein interactions to produce novel quaternary states with optimized activities.     

Directed enzyme evolution

Laboratory evolutionists continue to generate better enzymes for industrial and research applications. Exciting developments include new biocatalysts for enantioselective carbon-carbon bond formation and fatty acid production in plants. Creative contributions to the repertoire of evolutionary methods will ensure further growth in applications and expand the scope and complexity of biological design problems that can be addressed. Researchers are also starting to elucidate mechanisms of enzyme adaptation and natural evolution by testing evolutionary scenarios in the laboratory.     

分段DNA shuffling: 一种大分子海藻糖合酶有效的定向进化方法

[目的]红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)海藻糖合酶(Trehalose synthase,M-TreS)将麦芽糖转化生成海藻糖只需一步反应,且具有很好的热稳定性及pH耐受性,是潜在的工业生产海藻糖的酶源.为了提高该酶的性能,有必要对其进行定向进化.[方法]M-TreS基因(M-treS)大小为2 889bp.该蛋白质分子本身具有很大的进化空间,但是却不宜进行全长基因Shuffling.分段DNA shuffling是为大分子蛋白质(基因≥2 000 bp)的进化而设计的一种方法.该方法分为三步:(1)用两对引物分别扩增目的基因的上游片段和下游片段;(2)上下游片段各自进行Shuffling; (3)利用重叠延伸PCR连接上下游突变群,建立完整基因的突变文库.[结果]结合易错PCR,通过该方法经一轮进化获得一株酶活力是野生型1.6倍、催化效率是野生型2倍的突变株.序列分析表明,该突变株共有6个位点发生了氨基酸的替代,其中一个来自易错突变,2个来自同源重组,3个为随机突变.[结论]分段DNA shuffling是进化大分子蛋白质的有效方法.     

DNA重排及体外分子进化

ＤＮＡ重排是目前为止最简便、最有效的体外定向进化技术,可以对单一基因、质粒、代谢途径、部分甚至整个基因组进行改造。本综述了ＤＮＡ重排的基本原理、特点、与其它体外进化技术的不同,着重介绍了其在体外分子进化上的广泛应用,并对应用前景进行了展望。     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化

以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的5株CDR3突变体为基础,利用致错PCR和DNA重排方法对其进行了突变和重排,然后克隆重组装的突变单链抗体至载体pHB-1HSCFV而构建了库容为10^5的抗体库,利用噬菌体表面呈现技术对构建的人源化抗体突变库进行了富集,并利用单链抗体-碱性磷酸酶系统进行了阳性克隆的筛选和鉴定。随后以鉴定的5株阳性克隆为基础进行了第二轮的致错PCR、DNA重排、抗体库的构建和富集,并筛选到4株亲和力较亲本鼠抗体All更好的人源化抗体,该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制奠定基础。     

A comparison of directed evolution approaches using the beta-glucuronidase model system

Protein engineers can alter the properties of enzymes by directing their evolution in vitro. Many methods to generate molecular diversity and to identify improved clones have been developed, but experimental evolution remains as much an art as a science. We previously used DNA shuffling (sexual recombination) and a histochemical screen to direct the evolution of Escherichia coli beta-glucuronidase (GUS) variants with improved beta-galactosidase (BGAL) activity. Here, we employ the same model evolutionary system to test the efficiencies of several other techniques: recursive random mutagenesis (asexual), combinatorial cassette mutagenesis (high-frequency recombination) and a versatile high-throughput microplate screen. GUS variants with altered specificity evolved in each trial, but different combinations of mutagenesis and screening techniques effected the fixation of different beneficial mutations. The new microplate screen identified a broader set of mutations than the previously employed X-gal colony screen. Recursive random mutagenesis produced essentially asexual populations, within which beneficial mutations drove each other into extinction (clonal interference); DNA shuffling and combinatorial cassette mutagenesis led instead to the accumulation of beneficial mutations within a single allele. These results explain why recombinational approaches generally increase the efficiency of laboratory evolution.     

脂肪酶和酯酶的定向进化及其应用

简单介绍了脂肪酶和酯酶的定向进化的方法和策略。重点介绍了脂肪酶和酯酶的高通量筛选方法及定向进化研究所取得的主要进展。