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1.
人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
从诱导的人胚肺细胞HFL株中提取总RNA.经RT-PCR反应获取了人GM-CSFcDNA,DNA序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用PCR改造了人GM-CSF的cDNA5’端核苷酸序列,并将改造的人GM-CSF基因插入含T7启动子的质粒pET-11d构建成表达质粒pETC-5,将此质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)得到表达菌株BLEC4。表达菌株用0.5mol/LIPTG诱导2小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。SDS—PAGE电泳图谱扫描结果表明,rhGM-CSF产量占菌体总蛋白量的16%。ELISA和TF-1细胞培养测定表明,初步纯化和复性的rhGM-CSF具有天然的hGM-CSF生物活性。 相似文献
2.
用BamHI和HindII将丙肝病毒C+E1DNA片段从其克隆载体pGEM3zf-HCV/C+E1上切下,经Taq酶补齐3’末端后插入到载体pSVL-T中,构建成丙肝病毒C+E1真核表达载体pSVL-HCV/C+E1。本实验中重组效率达64.7%(11/17),正向插入为50%(2/4)。 相似文献
3.
用PCR法扩增出编码人FAS分子胞外区的cDNA片段,直接克隆到pGEM-T载体上,经DNA序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-KG的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间,构成重组质粒pKG-hFAS,将此质粒导入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得GST-hFAS重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B经亲合层析获得纯化的GST-hFAS蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除GST部分,得到纯化的FAS蛋白.用纯化的FAS抗原免疫家兔制备了抗FAS抗体,经检测发现抗FAS抗体能诱导U937细胞发生细胞凋亡 相似文献
4.
复制缺陷型腺病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在体内外的高效转移和表达 总被引:1,自引:0,他引:1
为了构建含人凝血因子Ⅷ基因的重组腺病毒载体系统,首先构建了含FⅧ(B结构域缺失型)的载体质粒pAd-hFⅧ和插入内含子结构的pAdI-hFⅧ,经脂质体介导,证明两质粒的目的基因均能在COS-7细胞中表达有凝血活性的FⅧ因子,其中经纯化的载体质粒pAd-hFⅧ与pBHG10经脂质体介导,共转染至293包装细胞,经同源重组和E1蛋白反式互补,形成E1/E3缺失型重组腺病毒载体颗粒Ad-hFⅧ.PCR检则到病理293培养液上清的病毒DNA中具有目的基因扩增片段,证明病毒DNA含有FⅧ基因.经扩增、纯化、滴度测定,用于感染离体细胞COS-7、A549、L929、293.证实该病毒能在上述细胞中高效转移和表达目的基因,其表达量具有一定范围内的剂量依赖性.COS-7细胞中,MOI>1000时,有细胞毒效应,表达量反而下降.经耳缘静脉注射Ad-hFⅧ至家兔后,1~4周能测到一定水平的FⅧ蛋白,1周内升至最高峰.免疫组化研究表明感染的离体细胞和家兔肝等组织均有FⅧ表达,其中肝脏表达最高.为甲型血友病的基因治疗开辟了新途径 相似文献
5.
利用PCR扩增得到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆pGEM-T构建成GM-CSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对72RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴 相似文献
6.
利用PCR技术和DNA体外重组方法,把作为导向效应细胞到靶部位的单核细胞趋化激活因子(MCAF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行基因融合,置于pBV220载体的λPRPL串联启动子下游,构建了SD序列与ATG之间含有不同核苷酸组成的重组质粒pMG01、pMG02和pMG03。pMG01、pMG02和pMG03的翻译起始区都不存在稳定的二级结构,但DH5α(pMG02、DH5α(pMG03)的表达水平远远高于DH5α(pMG01),DH5α(PMG01)几乎没有表达。表达产物经Westernblot检测表明,它能分别与MCAF和GM-CSF抗体发生特异反应。生物学活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性和维持hGM-CSF依赖的TF1细胞生长的特性,说明MCAF和GM-CSF的生物学功能是相容的. 相似文献
7.
8.
将编码丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白417~750位氨基酸的DNA片段 克隆到真核表达载体pcDNA 3.1(-)中的CMV IE启动子下游,构建成HCV E2重组真核表达质粒 pcE2。ELISA法检测pcE2 DNA免疫兔血清中的E2抗体变化和维持规律,结果显示免疫20d已有 抗体产生,30d后开始进入高峰,40d时达到最高值,至第90d抗体水平保持平稳,抗体滴度 达到1∶1600左右。流式细胞计数仪(FACS)检测pcE2 DNA免疫鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞变 化情况,与注射空载体pCDNA3.1(-)的阴性鼠相比,CD4+淋巴细胞水平略有上升,CD8+ 细胞水平有较大升高,增幅达35.46%。免疫组化检测结果显示注射pcE2的小鼠组织中有明显 的阳性着色,而注射pcDNA3.1(-)的对照组小鼠免疫组化结果为阴性。以上结果表明:pcE2 在实验动物内表达出的HCV E2蛋白可以引起免疫动物的体液免疫应答和细胞免疫应答,尤其 是MHC-1限制性杀伤性CD8+T淋巴细胞水平的提高对清除 病毒是十分有利的,因此HCV E2 DNA免疫有可能成为预防和治疗HCV感染的一条新途径。 相似文献
9.
天花粉蛋白Y14F/R22L定点突变及其活性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
利用多聚酶链式反应(PCR)技术,对天然天花粉蛋白(nTCS)基因在Tyr14和Arg22两个保守残基处同时进行定点突变,即Tyr14变成Phe,Arg22变成Leu,然后克隆到pET-8c高效表达载体上,构建成重组质粒pETY14F/R22L.经序列分析,定点突变的结果与预先设计的完全一致,突变后的天花粉蛋白命名为Y14F/R22LTCS.将pETY14F/R22L转化到E.coliBL21(DE3,pLysS)中,进行表达.经CM-SepharoseCL-6B柱纯化,SDS-PAGE鉴定,纯度可达90%.RIP活性测定显示,Y14F/R22LTCS的活性比nTCS降低了7.5倍,活性变化不显著,因此,TCS的Try14和Arg22对维持其活性部位构象并不是必需的.但由于Y14F/R22LTCS在E.coli中的表达量与nTCS相比明显下降,因此,Tyr14和Arg22可能与TCS翻译后的折叠有关. 相似文献
10.
缩短的人巨噬细胞集落刺激因子(M—CSF)在大肠杆菌中… 总被引:1,自引:1,他引:0
本文用聚合酶链反应(PCR)获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子cDNA基因,并克隆在质粒pAET3d中,在T7启动子指导下,在大肠杆菌BL2LysE中获得了和一个6组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合M-CSF表达量占菌体总蛋白的12%,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合(His)6-M-CSF在还原型SDS-PAGE上基 相似文献