定量测定黑鲷生长激素受体mRNA的液相杂交/RNase保护法

目的　建立液相杂交 核糖核酸酶保护测定 (RibonucleaseProtectionAssay,RPA)技术定量检测黑鲷(Sparusmacrocephalus)生长激素受体mRNA水平。方法　将黑鲷生长激素受体cDNA片断亚克隆至pGEM T载体 ,制备特异性的放射性反义RNA探针及正义RNA ,将反义RNA探针与正义RNA及样品总RNA进行液相杂交 ,用RNaseA和RNaseT1 降解杂交产物的单链RNA ,双链杂交体得到保护 ,然后检测杂交体的分子大小及放射强度。结果　检测出了黑鲷生长激素受体反义RNA探针与正义RNA及样品总RNA的特异性杂交片断 ,由此建立了定量测定黑鲷生长激素受体mRNA的液相杂交 RNase保护法 ,并采用该方法在黑鲷的多种组织中检测出了生长激素受体基因的表达 ,表达水平在肝脏中最高。该结果与我们曾采用生长激素放射受体分析法对黑鲷生长激素受体所研究的结果相吻合。结论　为进一步深入研究鱼类生长激素受体分子内分泌的调控理论提供了有力手段。     

豚鼠心房存在苯环立啶受体

用氚标记苯环立啶([~3H]-pcp)与豚鼠心房匀浆蛋白作受体结合试验。结果表明豚鼠心房具有与[~3H]-PCP 相结合的部位,结合具有特异性、饱和性、可逆性和立体专一性。Scatchard 分析,豚鼠心房有两个不同亲和力的特异结合部位;高亲和力和低亲和力结合部位。两者的解离常数 K_(dl)和K_(d2)分别为12.15±0.414nmol/L 和561.23±121.36nmol/L,最大结合 B_maxl 为0.71±0.029 pmol/mg 蛋白,B_maxe 为1.047±0.099 pmol/mg 蛋白。竞争性抑制分析结果显示 PCP 受体和 sigma 受体的配基都可抑制[~3H]-PCP 的结合,PCP 受体的配基的抑制作用强于 sigma 配基,而广谱阿片激动剂埃托啡(etorphine)却无抑制作用。结果提示豚鼠心房存在 PCP 受体。豚鼠右心房的冰冻切片和[~3H]-PCP 进行体外受体结合放射自显影,结果显示,在心房肌层有与[~3H]-PCP 特异性结合部位,且呈比较均匀的散在分布。     

甲胎蛋白受体的性质及其所介导的cAMP-PKA信号转导途径

研究HeLa细胞膜上甲胎蛋白 (alpha fetoprotein ,AFP)受体的存在情况及其介导的信号转导 .先用Na[12 5I]标记AFP ;标记的AFP和培养的HeLa细胞结合 ,Scatchard法和受体 配体结合法分析受体数目 ;再用放射免疫结合法分析在百日咳毒素 (pertussistoxin ,PTX)预处理前后AFP对细胞内环腺苷酸 (cAMP)浓度及细胞内蛋白激酶A(proteinkinaseA ,PKA)活性变化的影响 .在HeLa细胞膜表面存在 2种不同解离平衡常数 (Kd)的AFP受体 ,Kd1=5 2pmol L(2 10 0位点 细胞 ) ;Kd2 =2 3nmol L (114 0 0位点 细胞 ) .在AFP(2 0mg L)作用下 ,HeLa细胞内cAMP浓度变化及PKA活性的改变为与对照组比较 ,用PTX预处理前cAMP浓度升高 2 6 7% ,PKA活性增高 10 3 2 % ;用PTX预处理后升高 86 % ,PKA活性增高 2 5 3% .抗甲胎蛋白单克隆抗体可阻断AFP对细胞cAMP浓度和PKA活性的影响 .结果证明 ,在HeLa细胞膜上有 2种不同解离平衡常数的甲胎蛋白受体存在 ,受体有可能通过cAMP PKA途径介导信号转导 .     

雌二醇受体在兔子宫内膜染色质蛋白中的分布

本文利用不连续HAP层析法解离兔子宫内膜染色质蛋白,共分离出四个主要组分:(1)疏松结合的非组蛋白组分(0.25M NaCl解离的),(2)组蛋白组分(2M NaCl解离的),(3)紧密结合的非组蛋白组分(2M NaCl/5M尿素解离的)和(4)很紧密结合的非组蛋白组分(5M尿素/4M盐酸胍解离的)。在离体条件下使部分纯化的雌二醇受体复合物(RE)与兔子宫内膜染色质结合,然后进行羟磷灰石层析,用四种溶剂解离四种染色质蛋白组分,此时RE也随同被解离下来,后者与染色质蛋白第1、2、3和4组分结合的相对结合量分别为0.33±0.10,0.10±0.03,0.32±0.03和0.21±0.05,表明RE主要与非组蛋白组分结合,占86%。当己烯雌酚受体复合物存在时,RE与染色质蛋白的结合受到抑制。又初步比较了雌三醇和雌二醇受体复合物与染色质蛋白的结合量,观察到雌三醇受体复合物的结合量小得多,这种现象符合于雌三醇作为一种较弱的雌激素的特性。     

放射受体分析法

放射受体分析(Radioreceptor assay.RRA)是竞争性蛋白结合分析的一种.1970年Lefkowitz最先应用于促肾上腺皮质激素的测定,以后逐步推广到生长激素、促甲状腺激素、催乳素、促性腺激素、下丘脑释放激素、生长抑素、胰岛素等多种激素的测定,亦可进行去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、乙酰胆碱等各种神经介质以及一些药物(如     

SMMC-7721肝癌细胞67kD层粘连蛋白受体的分离纯化

分离纯化肝癌细胞的 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7LR) ,以便进一步研究 6 7LR的结构、功能及其在肝癌浸润、转移过程中的作用 .以SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞为材料 ,采用13 1I标记的层粘连蛋白测定其与细胞的结合能力 ;亲和层析法分离纯化层粘连蛋白受体 ,用SDS PAGE、放射自显影及体外竞争结合实验进行鉴定 .在相同条件下SMMC 772 1肝癌细胞与层粘连蛋白特异结合量为 17 5 4± 0 4 9ng 10 5细胞 ,而L 0 2正常肝细胞与层粘连蛋白的特异结合量为 8 36± 0 4 8ng 10 5细胞 .经过亲和层析 ,从SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞均可获得纯化受体 ,SDS PAGE显示为单一条带 ,分子量为 6 7kD ,放射自显影及体外竞争结合实验表明其具有较强的与层粘连蛋白结合的活性 .体外竞争结合实验表明 ,SMMC 772 1肝癌细胞层粘连蛋白受体 (772 1LnR)的抑制率可达到 96 2 7± 2 2 9% ,而L 0 2正常肝细胞层粘连蛋白受体 (L 0 2LnR)的抑制率为 4 8 71± 3 79% ,这说明 772 1LnR与层粘连蛋白的亲和力明显高于L 0 2LnR(P <0 0 0 1) .结果表明 ,与L 0 2肝细胞比较 ,SMMC 772 1肝癌细胞具有与层粘连蛋白较强结合能力的特异受体 ,并从肝癌细胞膜上分离纯化到与层粘连蛋白有较强亲和力的 6 7LR     

非洲爪蟾卵母细胞GABA_B和GABA_C受体介导的电流反应

实验应用双电极电压箝技术 ,在具有滤泡膜的非洲爪蟾 (Xenopuslaevis)卵母细胞上记录到γ 氨基丁酸(γ aminobutyricacid ,GABA) 激活电流。此GABA 激活电流的特点及有关GABA受体类型的研究和分析如下 :( 1)在 3 5 5 % ( 5 5 / 15 5 )的受检细胞外加GABA可引起一慢的浓度依赖性的外向电流。 ( 2 )GABAA 受体的选择性拮抗剂bicuculline ( 10 -5mol/L)对GABA ( 10 -5mol/L)引起的外向电流无阻断作用 (n =6)。 ( 3 )GABAB 受体的选择性拮抗剂2 hydroxysaclofen ( 10 -4mol/L)能将GABA ( 10 -5mol/L)引起的外向电流可逆性地转变为内向电流 ,后者又可被GABAC 受体的选择性拮抗剂I4AA ( 10 -5mol/L)所消除 (n =6)。 ( 4 )GABAB 受体的特异性激动剂baclofen可引起部分 ( 2 0 % ,12 / 60 )受检细胞产生一慢的浓度依赖性的外向电流。 3× 10 -6 、3× 10 -5及 3× 10 -4mol/L 2 hydroxysaclofen分别阻断baclofen ( 10 -5mol/L) 激活电流 ( 6 3± 3 2 ) % ,( 4 4 1± 2 2 ) %及 ( 86 0± 1 6) % (n =6)。 ( 5 )baclofen激活电流的I V曲线显示逆转电位在 - 96 8± 7 2mV左右 ,此电流可分别被TEA ( 5mmol/L)和BaCl2 ( 2mmol/L)所阻断。以上结果提示 :在非洲爪蟾的卵母细胞上存在内源性GABAB 和GABAC 受体 ,GA     

蟾蜍心肌肾上腺素能受体的类型和含量

用放射配基结合分析法,研究了不同温度条件下蟾蜍心脏各部位肾上腺素能受体的类型和含量。结果表明,常温蟾蜍心肌膜在37℃同β-受体的特异性标记配基~3H-双氢心得舒(~3H-DHA)的最大结合(B_(max))及Kd值分别为:全心,55.11±6.22fmol/mg蛋白及2.15±0.42nmol/L;窦房,55.80±7.03fmol/mg蛋白及2.65±0.37 nmol/L;心室,54.27±3.06 fmol/mg蛋白及1.84±0.14 nmol/L,同样温度条件下,窦房及心室心肌膜同α-受体的特异性标记配基~3H-双氢麦角隐亭(~3H-DHE)没有特异性结合,经过5—8℃,10d以上低温服习的蟾蜍,在10℃测试,其α-,β-受体的结合量和亲和力无异于常温蟾蜍。上述结果提示,蟾蜍心肌只有β-受体,温度对受体的类型和含量无明显影响,这种受体类型和含量在相当大的温度范围内保持不变。     

兔子宫内膜染色质蛋白与雌二醇受体的结合作用

本文应用亲和层析技术,使兔子宫内膜染色质蛋白偶联于琼脂糖Sepharose 4B,并证明分离的兔子宫内膜染色质蛋白组分C与雌二醇受体复合物有高亲和力的结合作用。先分离纯化的核,然后用2M NaCl提取染色质蛋白,并对25mM磷酸缓冲液透析,得到可溶的组分A和不溶的组分B,后者再用0.1NHCl抽提,得到酸可溶的组分C。将各组分偶联于琼脂糖凝胶,测定与雌二醇受体复合物的结合量。结果表明组分C的结合活力最大,故本文主要对它的结合特性进行了研究。固定化组分C的主要结合特性是:(1)与雌二醇受体复合物有高亲和力的结合作用,其解离常数K_d=2.20×10~(-9)M,(2)其结合活力对离子浓度是敏感的,当增加离子浓度时则减弱,(3)与雌二醇受体复合物的结合作用能被过量的R·DES复合物有效地抑制,(4)对25℃温育活化的雌二醇受体复合物有较大的结合量,(5)经胰蛋白酶处理后即失去结合活力,但不受DNase I和RNase的影响,提示在其结合作用中没有核酸参与。     

脂肪细胞上的半夏蛋白受体

本文对分离的大鼠附睾脂肪细胞与半夏蛋白结合的若干性质进行了探讨。脂肪细胞与半夏蛋白的结合是专一的,非标记半夏蛋白可完全地置换~(125)Ⅰ-半夏蛋白。脂肪细胞上半夏蛋白受体与半夏蛋白的结合对半夏蛋白而言是一饱和过程,饱和曲线呈反曲形,但Scatchard图形则是一不规则的曲线,提示脂肪细胞上可能存在不止一种半夏蛋白受体。根据饱和曲线计算,每个脂肪细胞可结合大约6～7×10~7个分子半夏蛋白。当反应液中~(125)Ⅰ-半夏蛋白浓度对细胞而言足够高时,半夏蛋白与其受体的结合随溶液中细胞浓度的增高而增加。半夏蛋白与其受体的结合随温度的升高而减少,37℃的结合量仅为0℃的10%左右。在24℃时,半夏蛋白与其受体的结合很快达到平衡,但自然解离则极慢。在0℃达到平衡的半夏蛋白-受体复合物,当移置到37℃时,则很快解离,达到新的平衡,提示复合物在0℃比在37℃稳定。反应液中α-甲基甘露糖苷浓度为0.1M或甘露聚糖浓度为2毫克/毫升时,均观察不到它们有促使复合物解离的作用。伴刀豆球蛋白A具有显著的但不完全的抑制半夏蛋白与其受体结合的能力,它也能使半夏蛋白-受体复合物部分解离。胰岛素即使浓度高达2.5×10~(-5)M亦不抑制~(125)Ⅰ-半夏蛋白与其受体的结合。     

脂肪细胞上的半夏蛋白受体

本文对分离的大鼠附睾脂肪细胞与半夏蛋白结合的若干性质进行了探讨。脂肪细胞与半夏蛋白的结合是专一的,非标记半夏蛋白可完全地置换~(125)I-半夏蛋白。脂肪细胞上半夏蛋白受体与半夏蛋白的结合对半夏蛋白而言是一饱和过程,饱和曲线呈反曲形,但Scatchard图形则是一不规则的曲线,提示脂肪细胞上可能存在不止一种半夏蛋白受体。根据饱和曲线计算,每个脂肪细胞可结合大约6～7×10~7个分子半夏蛋白。当反应液中~(125)I-半夏蛋白浓度对细胞而言足够高时,半夏蛋白与其受体的结合随溶液中细胞浓度的增高而增加。半夏蛋白与其受体的结合随温度的升高而减少,37℃的结合量仅为0℃的10%左右。在24℃时,半夏蛋白与其受体的结合很快达到平衡,但自然解离则极慢。在0℃达到平衡的半夏蛋白-受体复合物,当移置到37℃时,则很快解离,达到新的平衡,提示复合物在0℃比在37℃稳定。反应液中α-甲基甘露糖苷浓度为0.1M或甘露聚糖浓度为2毫克/毫升时,均观察不到它们有促使复合物解离的作用。伴刀豆球蛋白A具有显著的但不完全的抑制半夏蛋白与其受体结合的能力,它也能使半夏蛋白-受体复合物部分解离。胰岛素即使浓度高达2.5×10~(-5)M亦不抑制~(125)I-半夏蛋白与其受体的结合。     

受体介导式入胞的分子机理(1)

受体介导式入胞是一种与细胞膜受体有关的入胞过程。这一过程可概括为：1)膜受体识别介质中的特异性配体并与之结合,形成受体一配体复合物;2)该复合物在细胞膜中横向移动．逐渐向膜表面的衣被凹陷处集中,衣被凹陷是细胞膜上一个特殊的区域,其胞质侧富含网格蛋白;3)衣被凹陷进一步向胞质侧凹入,并最终与细胞膜脱离,在胞内形成一个囊泡,称衣被囊泡。衣被囊泡的形成过程称内移(internalization)：4)衣被囊泡与胞浆中的内体融合,内体可以发出和接受囊泡,与细胞膜、高尔基体和溶酶体有着广泛的交通往来．并通过内体的周转实现膜受体的循环利用和胞内物质的转运(如图1);5)内体与溶酶体融合,内容物被降解,受体与配体分离,配体进入胞内．膜受体回到胞膜。对于这样一个复杂的过程,人们的认识水平正不断深入,仅就受体介导式入胞各个环节的分子机理作一综述。     

单克隆抗体检测糖皮质激素受体的方法

利用两种糖皮质激素受体(GR)的单克隆抗体(Mab)建立了免疫活性糖皮质激素受体(GR_1R)的ELlSA检测法。5只大鼠肝胞液GR_1R/mg蛋白为1.0875±0.0257(扫描值)。本法特异性好,适用于没有GR纯品,而Mab数量不多条件下GR_1R的检测,其原理也适用于其他受体蛋白的测定。     

人转铁蛋白受体及其特异性抗体的制备

目的:从胎盘中提取转铁蛋白受体并获得抗转铁蛋白受体的抗体。方法:人新鲜胎盘组织被破碎后,用去污剂TritonX-100裂解细胞膜,释放膜蛋白。利用膜蛋白中的转铁蛋白受体能与铁-转铁蛋白复合物特异性结合的特性对其进行亲和纯化。对纯化得到的目的蛋白,经脱盐后进行ELISA及肽质量图谱分析,证明为所需的转铁蛋白受体后,以其包被免疫管,从全合成人源噬菌体抗体库中筛选抗体。结果:从人源噬菌体抗体库中筛选到5个能够与转铁蛋白受体特异性结合的噬菌体单链抗体。结论:以人源转铁蛋白受体为抗体,可从全人源噬菌体抗体库中筛选到其特异性的抗体。     

一个约30kD膜蛋白作为汉坦病毒候选受体的筛选

目的:筛选汉坦病毒包膜糖蛋白G2可能的候选受体或受体辅助分子,方法:根据汉坦病毒76～118株M基因序列设计引物,PCR扩增和基因重组获得G2全长及各功能片段的GST融合表达质粒,SDS-PAGE检测它们在BL21菌中诱导表达及纯化的效果.生物素标记汉坦病毒易感细胞Vero E6和非允许细胞CHO的细胞膜蛋白.将在BL21裂解上清中有表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81-140)纯化后与含有生物素标记的Vero E6细胞膜裂解液进行孵育,同时以非允许细胞CHO和无关蛋白GST-TLM做为阴性对照.通过GST Pull-down分离与G2蛋白特异性结合的细胞膜蛋白.结果:一个约30kD的Vero E6细胞膜蛋白与G2N81-140片段之间存在着特异性的相互作用.结论:该30kD蛋白可能是汉坦病毒细胞膜候选受体或受体辅助分子之一,是病毒入侵细胞的一个相关分子.     

肝脏去唾液酸糖蛋白受体及其应用

去唾液酸糖蛋白受体 (ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ,简称ＡＳＧＲ)是数量丰富的一种异源低聚物的内吞受体 ,主要存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面[1] ,具有对糖的特异性 ,并有特定的生物学功能 ,所以又称为肝糖凝集蛋白或肝凝集素。由于各种糖蛋白在用酶水解或用酸解除去末端唾液酸后 ,暴露出的次末端是半乳糖残基 ,所以ＡＳ ＧＲ的糖结合特异性实际上在于半乳糖基 ,故又称半乳糖特异性受体。ＡＳＧＲ的主要功能是去除去唾液酸糖蛋白和调亡细胞、清除脂蛋白 ,同时又是肝病毒的侵入位点[2 ] 。ＡＳ Ｇ…     

雌激素对兔子宫内膜细胞EGF受体和细胞周期的调控

 由受体放射配基结合分析证明家兔子宫内膜细胞的EGF受体Kd值为0.53nmol/L,每个细胞的最大结合容量为1.11×10~4结合位点。10~(-10)mol/L雌二醇处理24h,细胞的最大结合容量增至2.75×10~4结合位点数/细胞,而Kd值无明显变化,可是,当10~(-5)mol/L雌二醇处理24h,细胞的EGF受体结合率,DNA合成速度率均下降。G_0/G_1期细胞比值明显下降,而G_2+M期和S期细胞明显上升。     

兔子宫内膜染色质蛋白与雌二醇受体的结合作用

本文应用亲和层析技术,使兔子宫内膜染色质蛋白偶联于琼脂糖Sepharose 4B,并证明分离的兔子宫内膜染色质蛋白组分C与雌二醇受体复合物有高亲和力的结合作用。先分离纯化的核,然后用2MNaCl提取染色质蛋白,并对25mM磷酸缓冲液透析,得到可溶的组分A和不溶的组分B,后者再用0.1NHCl抽提,得到酸可溶的组分C。将各组分偶联于琼脂糖凝胶,测定与雌二醇受体复合物的结合量。结果表明组分C的结合活力最大,故本文主要对它的结合特性进行了研究。固定化组分C的主要结合特性是:(1) 与雌二醇受体复合物有高亲和力的结合作用,其解离常数K_d=2.20×10~(-9)M,(2) 其结合活力对离子浓度是敏感的,当增加离子浓度时则减弱,(3) 与雌二醇受体复合物的结合作用能被过量的R·DES复合物有效地抑制,(4) 对25℃温育活化的雌二醇受体复合物有较大的结合量,(5) 经胰蛋白酶处理后即失去结合活力,但不受DNase Ⅰ和RNase的影响,提示在其结合作用中没有核酸参与。     

豚鼠生长激素受体及其突变体在哺乳动物细胞中的功能性表达

采用RT PCR克隆得到豚鼠生长激素受体cDNA。序列同源比较显示生长激素受体的一些功能性保守氨基酸在豚鼠生长激素受体中被其他氨基酸所取代。例如 ,哺乳动物生长激素受体中保守的第 170位组氨酸和第 333位酪氨酸分别是受体二聚化和生长激素刺激蛋白质合成及脂生成所必需的 ,但在豚鼠生长激素受体中分别被酪氨酸和丝氨酸所取代。为此 ,采用定点突变法得到了突变体gpGHRY16 8H和 gpGHRS332Y ,并构建了表达质粒 pcDNA3 gpGHR ,pcDNA3 gpGHRY16 8H和pcDNA3 gpGHRS332Y。借助COS 7和CHO细胞 ,研究了豚鼠生长激素受体及其突变体的生物活性。实验表明转染了pcDNA3 gpGHR的COS 7细胞对牛生长激素具有高亲和性 [Ka=1.3× 10 9(mol/L) -1],并且用鼠抗生长激素受体单克隆抗体mAb2 6 3可检测到一分子量约 92kD的蛋白质。在CHO细胞中 ,虽然两个氨基酸的定点突变不影响受体与配体的结合 ,但都提高了生长激素刺激的蛋白质合成而降低生长激素刺激的脂肪生成。蛋白质印迹实验揭示突变体 gpGHRY16 8和gpGHRS332Y分别降低和提高了生长激素诱导的JAK2酪氨酸磷酸化。因此 ,报道了豚鼠生长激素受体在生长激素代谢功能中的调节作用以及受体中保守氨基酸的取代导致配体结合后信号转导的变化。     

生物感受器纳米体揭示源自核内体的G蛋白偶联受体的信号传导

<正>配体与位于细胞膜表面的G-蛋白偶联受体(GPCR)如β2肾上腺素受体(β2-ARs)结合,促进异源三聚体G蛋白解离,这代表了GPCR介导的信号转导的起始,是调控细胞生化反应的关键步骤。激活的β2-ARs磷酸化并与β-抑制蛋白结合,经网格蛋白包被的衣被小泡内吞,由此认为经典的β2-ARs信号局限于细胞膜上。作者构建了两种纳米粒,Nb80能选择性与配体β2-ARs复合体结合并能稳定激活的受体构象,可作为受体激活的生物感受器;Nb37能特异性识别刺激性G蛋白Gαs,是活化Gαs的生物感受器。采用全内反射荧光显微镜(TIRF),作者观察到β2-ARs位于静息状态的HEK293细胞膜上,而Nb80-GFP