小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21蛋白表达及定位的影响

初步探讨在小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21 蛋白表达及定位的影响。通过显微操作技术注射野生型、持续激活型及激酶失活型的PKB的mRNA,用免疫荧光方法检测p21蛋白的细胞定位、Western blot 方法检测p21蛋白的表达。结果显示在注射不同形式的PKB mRNA 后p21蛋白的表达无明显差别,但是细胞定位发生改变,PKB被激活后,p21蛋白滞留在胞浆中。因而初步认为在小鼠受精卵中,PKB/Akt通过影响p21 的细胞定位而影响细胞周期的进程。     

PKB/Akt通过Girdin蛋白调控小鼠受精卵微丝聚集

通过研究PKB/Akt与Girdin蛋白之间的关系,目的在于揭示Girdin蛋白在PKB/Akt调控小鼠受精卵微丝聚集中的作用。研究中首先结合软件(http://scansite.mit.edu//)预测了PKB/Akt对Girdin蛋白的磷酸化位点,并制定特定位点磷酸化抗体,通过蛋白免疫印迹检测经PKB/Akt m RNA或PKB/Akt si RNA处理后的小鼠受精卵中Girdin蛋白磷酸化改变情况。同时检测了磷酸化的Girdin蛋白亚细胞定位及同微丝骨架的定位关系。进一步通过显微注射PKB/Akt m RNA再注射Girdin si RNA检测小鼠受精卵微丝骨架的聚集。结果显示经持续激活型PKB/Akt m RNA、野生型PKB/Akt m RNA处理后的小鼠受精卵中p-Girdin-1 417分布位置更加集中在2-细胞分裂沟处。经野生型和持续激活型PKB/Aktm RNA注射组p-Girdin-1 417表达增强,但是并不影响Girdin蛋白的总的表达。说明si RNA介导的PKB/Akt表达敲低非常明显地降低了Girdin蛋白的磷酸化。激光共聚焦研究显示在Akt m RNA和Girdin si RNA共注射组微丝骨架分布明显散乱。本研究结果充分说明Girdin蛋白在小鼠受精卵中受到PKB/Akt的调节,PKB/Akt通过磷酸化Girdin蛋白改变微丝骨架的聚集。     

激光共聚焦显微镜观察小鼠早期胚胎中PKB/Akt对微丝聚合的影响

在本实验中我们用优化的免疫荧光化学法结合激光共聚焦显微技术,观察了微丝在小鼠卵细胞不同期的分布情况及PKB/Akt对小鼠卵母细胞和早期胚胎的微丝聚合的影响。结果显示,在小鼠卵母细胞及早期胚胎中均有微丝的表达,且主要集中在纺锤体处的质膜处、极体及分裂沟处。注射激活型PKB/Akt mRNA能够增强微丝的聚集。相反,注射激酶失活型的PKB/AktmRNA减弱了微丝的聚合。因而我们认为PKB/Akt可以影响小鼠卵细胞和早期胚胎的微丝聚集。     

Aurora 激酶A调节小鼠受精卵早期发育

Aurora激酶是参与细胞周期调节的重要激酶,已成为肿瘤研究领域的热点．近年来有研究表明, Aurora激酶A(Aurora kinase A,AURKA)对卵母细胞减数分裂也起到重要的调节作用,但对其在哺乳动物早期胚胎发育中的研究鲜有报道．本研究利用显微注射向受精卵中导入干扰AURKA表达的质粒,观察了AURKA表达敲低对小鼠受精卵早期发育的影响,并检测丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）通路抑制后,小鼠受精卵卵裂及AURKA表达与活性变化．实验结果表明,干扰AURKA的表达可导致受精卵发育停滞和异常分裂．MAPK通路的抑制亦可破坏受精卵正常卵裂,并下调AURKA的蛋白表达及活性．实验结果提示,AURKA是小鼠受精卵早期发育所必需的,并与MAPK通路的激活相关．     

小鼠受精卵早期发育过程中PKA在M/G1期进程中的作用

为研究小鼠体内l-细胞期受精卵蛋白激酶A(PKA)对M/G1期进程的影响,应用热稳定性抑制剂PKI显微注射入l-细胞期受精卵内,观察M期促进因子(MPF)及PKA活性变化以及MPF调节亚基Cyclin B含量情况。发现PKI显微注射后PKA活性低,而MPF活性在hCG后27．5h即达高峰,较对照组提前30分钟。PKI达一定浓度则MPF活性不下降,出现M/G1阻滞;与此同时Western blotting法显示PKI注射后Cyclin B含量在M末期相当于M中期水平。结果表明,PKI显微注射抑制PKA活性后MPF活性呈高峰值,高浓度PKI显微注射可引起M/Gl阻滞,其机制与PKI干扰了Cyclin B降解有关。     

蛋白激酶C_ζ对小鼠受精卵发育早期基因组转录活化的影响

为研究蛋白激酶Cζ (proteinkinaseCζ ,PKCζ)在小鼠受精卵细胞早期发育过程中对胚胎基因组活化影响 ,采用免疫印迹和细胞免疫荧光的方法 ,观察PKCζ的抑制剂对小鼠受精卵 1 细胞期G1和G2 不同时期小鼠受精卵基因组活化的影响 .小鼠 1 细胞期受精卵蛋白激酶C (PKC)的活性不断增加 ,并在G2 期达到最高 .PKC的抑制剂calphostinC可以明显抑制PKC的活性达 4 7% .同时calphostinC对受精卵 1 细胞期基因组的早期活化具有显著的抑制作用 (P <0 0 1) .在小鼠 1 细胞期受精卵的G2 期 ,具有活性的磷酸化PKCζ的含量明显多于G1期和卵母细胞MⅡ期 ,分别比它们高2 7%和 110 % .PKCζ的特异性抑制剂可以抑制受精卵 1 细胞期基因的转录和活化 (P <0 0 5 ) .实验结果表明 ,PKCζ参与了小鼠受精卵基因组早期转录的调控     

蛋白激酶A对小鼠受精卵早期发育过程中M期促进因子活性的影响

为研究小鼠体内 1 细胞期受精卵M期蛋白激酶A(PKA)对M期促进因子 (MPF)活性的影响 ,应用PKA激动剂cAMP及热稳定性抑制剂PKI显微注射入 1 细胞期受精卵内 ,观察MPF及PKA活性变化 .未经注射的对照组MPF活性在分裂期增高 ,分裂间期下降 ;而PKA活性在进入分裂期下降 ,分裂间期升高 .cAMP组PKA活性维持高峰值 ,直至注射HCG后 2 8h ,MPF活性高峰延迟 30min出现 ;PKI显微注射组PKA活性低 ,而MPF活性在注射HCG后 2 7 5h即达高峰 ,且维持高峰时间达1 5h .结果表明 ,PKA活性在细胞周期中也呈波动性 ,间期活性高 ,分裂期活性低 ;PKA高活性抑制MPF活性 ,而抑制PKA活性则MPF活性高峰提前出现 .     

AURKB与MAPK参与调控小鼠受精卵早期发育

Aurora 激酶是肿瘤研究领域的热点, 近年来有研究表明该激酶家族在卵母细胞减数分裂中也起着重要的调节作用, 但对于其在哺乳动物早期胚胎发育中的研究鲜有报道. 本研究通过实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫荧光检测了Aurora 激酶 B(Aurora kinase B, AURKB)在小鼠受精卵中的表达和定位, 运用RNA 干扰技术观察了AURKB 功能缺失后对小鼠受精卵发育早期的影响, 并检测丝裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路抑制后小鼠受精卵卵裂及AURKB 表达、 活性变化. 结果表明, 在小鼠受精卵第一次卵裂进程中, G2/M 期为AURKB 的稳定表达时相, 其蛋白在G1/S 期少量分布于细胞浆, G2 期聚集于染色质周围, 进入有丝分裂后分布于全细胞. AURKB 的功能缺失可导致受精卵发生异常分裂. MAPK 通路的抑制亦可破坏受精卵的正常卵裂, 并下调AURKB的蛋白表达及活性. 结果提示, Aurora 激酶B 是小鼠受精卵早期发育所必需的, 并与MAPK 通路的激活相关.     

小鼠受精卵中蛋白激酶C底物的鉴定

为研究蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）在小鼠早期发育中的调节作用,运用超排卵和体外受精技术,采用体外磷酸化和放射自显影的方法,鉴定小鼠1-细胞期受精卵中PKC的底物。经特殊的反复冻融处理,消除卵中内源性蛋白激酶活性。55个受精卵的样品中加入部分纯化的PKC,结合应用较强的PKC抑制剂H-7和星形孢菌素以及促分裂原活化蛋白激酶抑制剂PD098059作为对照,观察到12条PKC底物蛋白的放射自显影带,根据标准蛋白质对值绘制的标准曲线计算,这些磷酸化蛋白的相对分子量分别约为120kDa、100kDa、79kDa、63kDa、59kDa、47kDa、40kDa、34kDa、32kDa、26kDa、24kDa和22kDa。实验结果表明,PKC可通过底物蛋白活性的调节,在小鼠早期发育中发挥重要作用。     

Cdc25B在小鼠受精卵的表达和定位

为阐明细胞分裂周期(Cdc)25B调控小鼠受精卵发育的机制,利用Western印迹检测小鼠受精卵各时期Cdc25B的表达及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。利用间接免疫荧光技术观察Cdc25B在小鼠受精卵的定位。构建pEGFP-Cdc25B融合表达载体并显微注射到受精卵中,观察Cdc25B在受精卵M期的定位变化。结果表明Cdc25B在G1和S期被磷酸化,在G2和M期去磷酸化。Cdc2-Tyr15在G1和S期处于磷酸化状态,G2期只检测到Cdc2-Tyr15轻微的磷酸化信号,M期未检测到任何Cdc2-Tyr15的磷酸化信号。Cdc25B在G1期定位于细胞质和细胞核中,S和G2期定位于细胞质的皮质部分,M期由细胞质转向核区。证明Cdc25B核输出后激活有丝分裂促进因子,从而启动小鼠受精卵的有丝分裂。     

蛋白激酶B在小鼠1-细胞期受精卵中活性及表达变化

蛋白激酶B(proteinkinaseB ,PKB)发现于 1991年 ,属于丝 苏氨酸蛋白激酶 .因其激酶活性区的氨基酸序列与蛋白激酶C (proteinkinaseC ,PKC)和蛋白激酶A (proteinkinaseA ,PKA)同源性分别为 73%和 6 8% ,因此命名为PKB ,或PKA和PKC相关激酶(relatedtheAandCkinase ,RACK) [1] .另外 ,PKB被证明为逆转录病毒的癌基因v akt编码的蛋白产物 ,因此PKB又称AKT[2 ] .PKB分子量 6 0kD ,目前已知分为PKBα、β、γ三种 .PKBα广泛存在于机体各组织中 ,其活性受多种信息物质调节 .PKBβ在卵巢癌、胰腺癌细胞中过表达 ,PKBγ在大…     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA影响U251细胞中p21稳定性的机制

目前已开发的组蛋白去乙酰化酶抑制剂如SAHA表现出了广泛的临床应用前景。然而,其作用机制有待进一步阐明。该研究旨在探明SAHA对p21蛋白稳定性的影响。运用Real—timePCR、免疫共沉淀、泛素化降解实验、免疫印迹和流式细胞技术分析了SAHA对p21mRNA和蛋白水平、稳定性和泛素化水平的影响：并分析了SAHA通过调节GSK-3β的活性影响p21蛋白稳定性及细胞周期的进程。结果发现,SAHA不但可以上调Np21mRNA水平,还可以稳定其蛋白水平;而且SAHA通过影响GSK-3β的活性降低p21蛋白泛素化水平,从而抑制其降解,并因此改变细胞周期进程,这表明SAHA可以通过抑制GSK-3β的活性增加p21蛋白的稳定性,维持其蛋白水平从而发挥SAHA的生物学效应。该研究结果将为脑胶质瘤的临床研究提供实验依据。     

p21活化激酶的生物学活性及其与肿瘤的关系

p21活化激酶(p21-activatedkinase,PAK),为一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PAK在许多组织中广泛表达,作为小G蛋白Rho家族Cdc42和Rac1的下游靶蛋白,可以被生长因子及其他胞外信号通过GTP酶依赖的信号通路或非GTP酶依赖的信号通路活化,发挥多种生物学效应。PAK作为一种重要的生物学调节因子,在哺乳动物一系列细胞功能中具有重要作用,如:细胞运动、细胞生存、细胞周期、血管生成、基因转录调节及癌细胞的侵袭转移。通过对PAK家族成员信号转导机制的研究,为癌症治疗提供分子靶标。     

PKC对小鼠受精卵发育的调控作用

为研究 TPA及 PKC的反义寡核苷酸对 1 -细胞期鼠受精卵发育的影响 ,采用免疫细胞化学法标记 PKC(α及 β亚型 ) ,并用激光扫描共聚焦显微镜测定卵内 PKC荧光强度 ;同时利用显微注射法注射 PKC的反义寡核苷酸 ,观察其对受精卵分裂的影响 . 1 0 0 μg/ L TPA对 1 -细胞期受精卵的发育具有完全抑制作用 .TPA处理 1 2 h后 ,对照组受精卵停留在 1 -细胞期 ,而未经 TPA处理的1 -细胞期卵可以分裂到 2 -细胞期 .共焦激光显示实验组与对照组相比 ,PKC(α、β亚型 )荧光强度均有下降 (P<0 .0 1 ) .显微注射 PKC antisenseα及 antisenseβ的受精卵 ,分别只有 1 4 .2 %和 3.33%的卵可以发育到 2 -细胞期 .与对照组 (注射 M2培养液 )差异显著 (P<0 .0 1 ) .结果表明 ,(1 ) TPA长期处理 1 -细胞期受精卵 ,抑制 1 -细胞期卵分裂到 2 -细胞期 ;(2 ) PKC的反义寡核苷酸 (α及β亚型 )可以抑制小鼠 1 -细胞期卵的发育     

Cyclin B1和p21在妊娠期高血压产妇胎盘组织中的表达及其临床意义

目的:观察CyclinB1和p21在妊娠期高血压产妇胎盘组织中的表达并探讨其临床意义.方法:采用免疫组化MaxVision法检测正常胎盘组织(20例)、妊娠期高血压胎盘组织(30例)、轻度子痫前期胎盘组织(30例)和重度子痫前期(30例)产妇胎盘组织中的cyclin B1和p21蛋白表达,并分析其与妊娠期高血压病情严重程度的相关性.结果:妊娠期高血压、轻度子痈前期、重度子痈前期胎盘组织中cyclinB1蛋白的表达均显著低于正常胎盘组织,差异均有统计学意义(P＜0.05),妊娠期高血压、轻度子痈前期、重度子痈前期胎盘组织中p21蛋白表达均显著高于正常胎盘组织,差异有统计学意义(P＜0.05).妊娠期高血压患者病情的严重程度与其胎盘组织中cyclinB1的蛋白表达呈显著负相关(r=0.641,P=0.000);而与其胎盘组织中p21蛋白的表达呈显著正相关(r=0.635,P=0.000).结论:Cyclin B1蛋白的表达下调和p21蛋白的表达上调可能参与了妊娠期高血压的发生发展,且二者在胎盘组织中的表达水平与妊娠期高血压病情的严重程度显著相关.     

温阳化瘀法对月经周期紊乱患者p53,p21,MDM2蛋白表达的影响

目的:通过对月经周期紊乱患者的细胞周期相关基因的表达水平进行分析,得出温阳化瘀法在此病上的治疗效果。方法:选取我院妇科收治的月经周期紊乱患者120例,参照随机原则共分为2组,其中西医治疗组59例,给予醋酸甲羟孕酮片和克罗米芬口服;实验组61例,在西医治疗基础上给予温阳化瘀中药治疗,每日1剂;另外随机选取同期体检健康的60名女性作为正常对照组,在治疗结束后,应用免疫组化方法对全部受试者进行p53、p21以及MDM2蛋白表达检测,同时应用统计学软件对相关结果进行分析。结果:1p53和p21蛋白的阳性表达主要在细胞核,MDM2蛋白阳性表达定位在细胞核和(或)胞质;2正常子宫内膜组织中p53蛋白阳性表达率为(36.67%),p21表达率为(33.33%),显著高于月经周期紊乱患者,中药治疗组的p53蛋白阳性表达率为(19.67%),p21达率为(18.03%),显著高于西医治疗组,P0.05,差异有统计学意义;3正常子宫内膜组织中MDM2蛋白阳性表达率为(1.67%),显著低于月经周期紊乱患者,中药治疗组的MDM2蛋白阳性表达率为(32.77%),显著低于西医治疗组(50.85%),P0.05,差异有统计学意义。结论:与健康妇女相比,月经周期紊乱患者的p53和p21蛋白阳性表达率显著降低,MDM2蛋白阳性率显著升高,应用温阳化瘀法能够显著改善月经周期紊乱患者细胞周期相关基因的表达水平。