重组根瘤农杆菌葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶性质

目前已发现的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶均来源于真菌, 尚无原核细胞来源的相关报道。从根瘤农杆菌LBA4404中克隆β-葡萄糖苷酶基因bg1, 将其构建在表达载体pET-28b上, 转化Escherichia coli RP (DE3), IPTG诱导表达。重组β-葡萄糖苷酶的比活高达36.7 μmol/(min·mg)。对经过Ni柱纯化的重组酶进行酶学分析发现: 该酶是糖基水解酶家族1的成员, 底物亲和力高, 专一性低, 在温度为40°C和pH在5-8之间时具有较高的酶活, 在低于40°C和pH 5-10之间时可稳定保存。以pNP-β-Glc为底物, 该酶的最适pH为6.4, 最适温度为60°C, 在37°C和pH 6.4的反应体系中, 该酶的Km为0.09 mmol/L, 竞争性抑制剂葡萄糖酸-δ-内酯和葡萄糖的Ki分别为0.03 mmol/L和75 mmol/L, 具有很高的葡萄糖耐受性, 当金属离子Ag+和Zn2+存在时, 酶活被明显抑制。该酶对pNP-β-Gal和pNP-α-Glc的Km分别为3.61 mmol/L和14.31 mmol/L。     

极耐热性β-葡萄糖醛酸酶的高效表达和酶学性质及其应用

从海栖热袍菌克隆出编码热稳定性β-葡萄糖醛酸酶基因,以热激载体pHsh为表达质粒,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过一步热处理后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶酶学性质研究表明,β-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80℃,最适反应pH为5．0,pH5．8～8．2之间酶的稳定性较好,80℃的半衰期为2h,SDS—PAGE结果显示分子量为65.9kD,与理论推算值相吻合。以对硝基苯-β-葡萄糖醛酸苷（pN/PG）为底物时,其动力学参数Km值0.18mmol／L,Vmax值为312u／mg。初步的应用分析表明,该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸。     

极耐热性b-葡萄糖醛酸酶的高效表达和酶学性质及其 应用

从海栖热袍菌克隆出编码热稳定性b-葡萄糖醛酸酶基因, 以热激载体pHsh为表达质粒, 在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过一步热处理后, 酶纯度达电泳均一。纯化重组酶酶学性质研究表明, b-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80oC, 最适反应pH为5.0, pH 5.8~ 8.2之间酶的稳定性较好, 80oC的半衰期为2 h, SDS-PAGE结果显示分子量为65.9 kD, 与理论推算值相吻合。以对硝基苯-b-葡萄糖醛酸苷(pNPG)为底物时, 其动力学参数Km值0.18 mmol/L, Vmax值为312 u/mg。初步的应用分析表明, 该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸。     

代谢工程改造黑曲霉生产葡萄糖二酸

葡萄糖二酸是葡萄糖的一种二元羧酸衍生物,是重要的平台化合物,被应用于医药、化工等领域。本研究以黑曲霉为底盘细胞,通过表达来自恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440的糖醛酸脱氢酶基因ppudh,成功在黑曲霉中实现了葡萄糖二酸的合成,产量为18.74 mg/L;在此基础上通过共过表达黑曲霉自身来源的肌醇加氧酶(anmioxA)和肌醇-1-磷酸合酶(aninoA)、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C来源的羧酸转运蛋白(scJEN1),强化了合成通路和外泌途径,将产量提高至102.10 mg/L;通过表达来自乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.cremoris MG1363的NADH氧化酶(llnox),建立NAD⁺辅因子循环系统,使产量进一步提高至115.65 mg/L;利用RNA干扰技术对竞争支路中的关键酶磷酸果糖激酶(pfkA)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)进行弱化表达,葡萄糖二酸最终的产量达到313.65 mg/L。本研究为微生物高效生产葡萄糖二酸和下游相关产品生产奠定基础。     

代谢工程改造酿酒酵母合成葡萄糖二酸

葡萄糖二酸是一种高附加值的有机酸,广泛用于食品、医药和化工领域。为获得生产葡萄糖二酸的微生物细胞工厂,通过共表达小鼠来源的肌醇加氧酶(MIOX)及恶臭假单胞菌来源的醛酸脱氢酶(Udh),在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C中构建了葡萄糖二酸合成途径,产量为(28.28±3.15)mg/L。在此基础上,通过调控前体肌醇的合成途径,发现肌醇-1-磷酸合成酶(INO1)是葡萄糖二酸合成途径的限速酶,过量表达INO1,葡萄糖二酸产量达到(107.51±10.87)mg/L,提高了2.8倍。进一步弱化竞争支路中磷酸果糖激酶(PFK1)的表达,最终葡萄糖二酸的产量达到(230.22±10.75)mg/L,为进一步获得高产葡萄糖二酸细胞工厂提供基础。     

碳源和氮源对5-酮基-葡萄糖酸生成的影响

氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并进一步氧化成2-酮基-葡萄糖酸(2KGA)和5-酮基-葡萄糖酸(5KGA),其中5KGA在催化剂的作用下能够转化为L(+)-酒石酸。为了提高5-酮基-葡萄糖酸产量,以仅生成5KGA的氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans HGI-1为出发菌株,研究不同碳源(蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、葡萄糖)和有机氮源(酵母浸粉、鱼粉、玉米浆、黄豆饼粉、棉籽饼粉)对5KGA产量的影响。500 mL摇瓶试验结果表明,当葡萄糖浓度为100 g/L时,5KGA产量最高为98.20 g/L;当有机氮源为酵母浸粉、鱼粉和玉米浆,其添加量的蛋白含量为1.60%时,5KGA产量分别为100.20 g/L、109.10 g/L和99.83 g/L,其中,使用鱼粉的5KGA产量最高,使用玉米浆的5KGA产量比酵母浸粉略低。出于经济考虑,文中选择玉米浆作有机氮源,并在5 L发酵罐中进行分批发酵放大试验,5KGA的产量为93.80 g/L,最大生成速率为3.48 g/(L·h),平均生成速率为1.56 g/(L·h)。结果表明,葡萄糖和玉米浆分别为Gluconobacter oxydans HGI-1规模化生产5KGA的最适碳源和氮源,可利用葡萄糖几乎全部(85.93%)转化为5KGA。     

高等植物葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶与6- 磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的不同进化起源

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶是植物戊糖磷酸途径中的两个关键酶。在克隆了水稻质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH2和质体6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因Os6PGDH2基础上,分析比较了水稻胞质和质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的基因结构、表达特性和进化地位。结合双子叶模式植物拟南芥两种酶基因的分析结果,认为高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因在进化方式上截然不同,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的胞质基因与动物和真菌等真核生物具有共同的祖先;6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的胞质酶和质体酶基因都起源于原核生物的内共生。讨论了植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因可能的进化模式,为高等植物及质体的进化起源提供了新的资料。     

酶法一步生产葡萄糖酸-δ-内酯的研究

从全国各地采集到的400多份土壤和谷物样品中分离到501株黑曲霉菌株,经筛选后得一株葡萄糖氧化酶活力较高的黑曲霉Y19菌株,以该菌株为出发菌株,经UV、γ-射线及硫酸二乙酯(DES)等诱变筛选后,获得一株酶活较出发菌株高15倍多的黑曲霉UCD 69菌株。通过正交试验确定了几个影响菌体生长和产葡萄糖氧化酶的主要因素水平,并选出了该菌的最适培养条件。用上述条件培养出的菌丝来直接发酵葡萄糖生产葡萄糖酸-δ-内酯。产品收率可达所用葡萄糖重量的50%。     

普通生酮基古龙酸菌中山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的纯化及酶学性质分析

【目的】对源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare WSH-001)的山梨糖脱氢酶(Sorbose dehydrogenase,SDH)和山梨酮脱氢酶(Sorbosone dehydrogenase,SNDH)的酶学性质进行分析。【方法】以K.vulgare WSH-001基因组DNA为模板,PCR扩增得到山梨糖脱氢酶基因(sdh)和山梨酮脱氢酶基因(sndh),构建重组表达质粒p ET28a-sdh、p ET28a-sndh,并分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中。利用镍柱亲和层析和凝胶过滤层析得到纯化的SDH和SNDH。【结果】成功构建产SDH和SNDH的大肠杆菌BL21(DE3)并对目的酶进行纯化。SDS-PAGE分析结果表明,SDH和SNDH的大小分别为64 k Da和48 k Da,与理论预测值一致。显色法测得SDH酶活为3.15 U/mg,最适反应温度为30°C,最适反应pH为8.0左右;SNDH酶活为6.12 U/mg,最适反应温度为35°C,最适反应pH为8.0左右。在pH 3.0、4.0、5.0的偏酸性条件下,2个酶的酶活受到显著影响。【结论】表达并纯化了来源于普通生酮基古龙酸菌来源的SDH、SNDH,并进行了酶学性质分析,为利用SDH、SNDH实现维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的一步法发酵生产提供了必要的参考。     

高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的不同进化起源

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶是植物戊糖磷酸途径中的两个酶.在克隆了水稻质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH2和质体6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因Os6PGDH2基础上,分析比较了水稻胞质和质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的基因结构、表达特性和进化地位.结合双子叶模式植物拟南芥两种酶基因的分析结果,认为高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因在进化方式上截然不同,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的胞质基因与动物和真菌等真核生物具有共同的祖先;6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的胞质酶和质体酶基因都起源于原核生物的内共生.讨论了植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因可能的进化模式,为高等植物及质体的进化起源提供了新的资料.     

酶法一步生产葡萄糖酸-δ-内酯的研究

从全国各地采集到的400多份土壤和谷物样品中分离到501株黑曲霉菌株,经筛选后得一株葡萄糖氧化酶活力较高的黑曲霉Y19菌株,以该菌株为出发菌株,经UV、γ-射线及硫酸二乙酯(DES)等诱变筛选后,获得一株酶活较出发菌株高15倍多的黑曲霉UCD 69菌株。通过正交试验确定了几个影响菌体生长和产葡萄糖氧化酶的主要因素水平,并选出了该菌的最适培养条件。用上述条件培养出的菌丝来直接发酵葡萄糖生产葡萄糖酸-δ-内酯。产品收率可达所用葡萄糖重量的50%。     

VC二步发酵产酸菌氧化葡萄糖酸杆菌的选育

实验通过紫外线两轮诱变的方法诱变选育氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）,以实现提高2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）产量的目的,获得1株高产2-KLG的菌株G5。结果证明该突变菌株在pH6．5—6．7的发酵培养基中与蜡质芽孢杆菌（Bcillus cereus）混合发酵,G5的平均糖酸转化率提高了13．49％,酸量达到83．6mg／mL,发酵周期缩短了2—3h。经连续10代转接发酵实验,证明其产酸稳定性较好。结论：氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）的突变体G5提高了糖酸转化率,缩短了发酵周期。     

5-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产的工艺条件优化

葡萄糖酸氧化杆菌可将葡萄糖转化为5-酮基-D-葡萄糖酸(5-KGA),而5-KGA是重要食品添加剂L(+)-酒石酸的合成前体。为提高5-KGA产量及其对葡萄糖的转化率,对5-KGA发酵生产的工艺条件进行优化。在摇瓶水平最适的培养基和培养条件下,5-KGA最高产量为19.7 g/L,较优化前提高43.8%。在5 L发酵罐上控制恒定pH值5.5、溶氧浓度15%条件下,5-KGA产量达到46.0 g/L,较摇瓶最高产量提高1.3倍,应用葡萄糖流加工艺,5-KGA最高产量达到75.5 g/L,转化率超过70%,与已见报道的最高水平相比提高了32.0%,为实现微生物发酵生产5-KGA、进而合成L(+)-酒石酸的工业化提供了切实有效的途径。     

代谢工程改造Gluconobacter suboxydans生产2-酮基-D-葡萄糖酸

2-酮基-D-葡萄糖酸是重要的抗氧化剂和食品添加剂——D-异抗坏血酸的重要前体。弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)具有丰富的周质空间氧化还原酶类,可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸再氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸。以提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量和减少副产物为目标,采用同源重组染色体修饰策略,将编码甘油脱氢酶的基因gldh置换为编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh,将编码山梨醇脱氢酶的基因sdh置换为编码2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶的基因ga-2-dh。经PCR、酶活性显色及发酵产物HPLC检测验证表明:构建的工程菌株gdh和ga-2-dh基因被强化而gldh和sdh被敲除;使用10%的葡萄糖复合培养基,摇瓶发酵72h,工程菌2KGA3发酵液中没有副产物5-酮基-葡萄糖酸,2-酮基-D-葡萄糖酸的含量终浓度达到72.3 g/L,比野生菌株提高42.2g/L,工程菌和野生菌的2-D-KGA质量转化率分别为72.3%和30.1%,工程菌比野生菌提高1.4倍。构建获得的工程菌,不需要外加抗生素,可以保持稳定遗传,对于工业化规模生产具有一定优势,为获得可产业化显示的优势遗传资源打下了基础。     

嗜酸古菌Cuniculiplasma divulgatum来源的GH1家族中温β-葡萄糖苷酶CdBglA的原核表达及酶学性质分析

葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究的热点。本文对尚未报道的来源于嗜酸古菌(Cuniculiplasmadivulgatum)GH1家族的葡萄糖苷酶进行了克隆表达和酶学性质测定,以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。从NCBI数据库中获取了C. divulgatum来源的GH1葡萄糖苷酶氨基酸序列,然后制备重组质粒pET-30a(+)-CdBglA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白,对纯化后的CdBglA进行酶学性质研究。结果发现,重组酶CdBglA的分子量为56.0 kDa,最适pH为5.5,最适温度为55℃。该酶具有良好的pH稳定性,在pH 5.5-11.0范围内处理1 h,仍维持92.33%以上的酶活力。以p NPG为底物时的酶促反应动力学参数Km、Vmax和Kcat/Km分别为0.81 mmol、291.99μmol/(mg·min)和387.50s-1mmol-1。其在终浓度5mmol/L重金属离子的影响下均能保持90.33%以上的酶活力;在15%的乙醇溶液中酶活力被提高了28.67%,在2...     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 Ⅲ.SCB3058对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化

棒状杆菌(Corynebactcrium sp.)突变株SCB 3058将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸。含2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的发酵液经表面活性剂SDS处理可直接用作菌株SCB3058的转化底物。D-葡萄糖为最佳碳源,同时作为还原的氢供体。培养基中加入NH.Cl对2-酮基-L-古龙酸的生成有明显的促进作用。转化的最适pH为7.5。摇瓶发酵64小时后,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化率为50mol%。     

蔗糖-葡萄糖双功能酶传感器的研究

结合蔗糖转化酶(INV)酶管与葡萄糖氧化酶(GOD)-葡萄糖变旋酶(MUT)双酶电极构成一种新的蔗糖传感器。该传感器可以分别用于蔗糖及葡萄糖的测定。蔗糖经酶管作用产生α-D-葡萄糖,再用COD-MUT双酶电极定糖。若是样品中蔗糖和葡萄糖共存,比较样品流经不同路径(Ws和Wg)时传感器的响应值,可以排除葡萄糖对蔗糖测定的干扰。传感器的最适pH和温度范围分别为:5.0—6.5和30—40℃。在稳态法实验中,传感器的线性范围为:2.5×10~(-4)—5×10~(-3)mol/L。传感器的重复性很好,CV<1％。该传感器在用于测定发酵培养基(含葡萄糖)的蔗糖含量,平均回收率为97.9％。传感器与糖度计法测定的相关系数为0.997。传感器至少可以稳定使用8天以上。     

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌（Paenibacillus macerans）的α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT）基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b（＋）中,构建了表达载体pET-20b（＋）／cgt,并将其转化表达宿主E.coli BL21（DE3）。对重组菌E．coli BL21／pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件：葡萄糖8g/L,乳糖0．5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO472mmol／L,KH2PO417mmol／L,CaCl2 2．5mmol／L;初始pH为7．0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22．1u／mL,与来源菌Pmacerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3L发酵罐中发酵,90h后胞外酶比活达到22．6U／mL,证实了工业化放大的可能性。     

高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为"最具价值的生物炼制产品之一".以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因...     

新型扁桃酸消旋酶的基因挖掘和性能表征

消旋酶是实现手性化合物去消旋化制备光学纯化学品的重要工具,来源于恶臭假单胞菌的扁桃酸消旋酶(MR),是目前唯一可以催化两种构型扁桃酸互相转换的消旋酶。通过基因组数据挖掘获得了9个新的扁桃酸消旋酶基因及活性蛋白,其中来源于放射性土壤杆菌Agrobacterium radiobacter的Ar MR酶对扁桃酸和邻氯扁桃酸具有较高的催化活力,而且该酶的异源表达水平也较理想。ArMR催化扁桃酸消旋反应的最适温度为50℃,最适pH为7.8。该酶在30℃、40℃和50℃下的半衰期分别为70.7、7.2、0.17 h。ArMR对(R)-和(S)-扁桃酸的K_M值分别为1.44 mmol/L和0.81 mmol/L,k_(cat)值分别为410 s~(–1)和218 s~(–1);对(R)-和(S)-邻氯扁桃酸的KM值分别为6.48 mmol/L和6.37 mmol/L,而k_(cat)值为0.22 s~(–1)和0.23 s~(–1)。Mg~(2+)和Mn~(2+)对该酶的活力有促进作用,而Zn~(2+)使其完全失活。新型扁桃酸消旋酶的发现和表征为今后此类酶的深入研究和开发提供了更多资源和数据参考。