过程优化提高解脂亚洛酵母积累α-酮戊二酸

目前,应用解脂亚洛酵母发酵生产α-酮戊二酸由于产量和底物转化率低、生产周期长等问题,仍未大规模工业化生产。为了解决这些问题,以研究室诱变选育获得的1株高产α-酮戊二酸的解脂亚洛酵母Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3为出发菌株,考察了该菌株在50 L发酵罐中转速、碳酸钙浓度、溶氧以及补料方式(多节点补料、恒速补料)等因素对α-酮戊二酸积累的影响。结果表明,当转速为300 r/min时,α-酮戊二酸和丙酮酸的产量分别为32.4 g/L和19.66 g/L;碳酸钙质量浓度为20 g/L时,α-酮戊二酸的产量提高至38.55 g/L,丙酮酸降低至8.28 g/L;控制溶氧水平在50%时,α-酮戊二酸产量为42.39 g/L,此时丙酮酸为6.22 g/L。比较高初始甘油浓度和不同的补料发酵策略,发现恒速补料效果最好,发酵144 hα-酮戊二酸产量达到66.27 g/L,丙酮酸产量为20.82 g/L。通过上述发酵过程参数的优化,α-酮戊二酸的产量和底物的转化率比未优化前分别提高了67.3%和4.56%,为解脂亚洛酵母工业化生产α-酮戊二酸提供一定参考。     

1,3-丙二醇产生菌的诱变育种及培养基优化

以实验室自然筛选的克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)为出发株,采用紫外诱变及亚硝基胍和超声波协同处理获得一株1,3-丙二醇高产突变株。在摇瓶发酵中,其产1,3-丙二醇产量由17.39 g/L提高到24.11 g/L,提高38.64%。变异株经10次传代培养,发酵能力稳定。对发酵培养基成分进行了优化,优化后1,3-丙二醇产量为30.05g/L,为优化前的1.25倍。     

米根霉乙醇脱氢酶(ADH)突变菌株的诱变选育

米根霉发酵生产L-乳酸过程中,由于丙酮酸在丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶(ADH)催化下生成乙醇,使得丙酮酸向乳酸转化的流量减少。采用亚硝基胍(NTG)诱变米根霉AS3．3462孢子液,诱变剂量为0．15 mg/ mL时,致死率为70%～80%。在含丙烯醇的YPD筛选培养基上筛选获得两株ADH活力降低的突变株mut-1和mut-2,检测突变株mut-1和mut-2的最大ADH活力分别为35．67和43．09U/mL,是原始菌株的41．63%和50．29%。发酵72h后,原始菌株的乙醇与乳酸浓度分别为28．9g/L和40．31g/L,而mut-1和mut-2突变株的乙醇产量分别为4．87g/L和6．56g/L,乳酸产量为54．45g/L和44．07g/L。在相同的发酵条件下,米根霉ADH突变株mut-1和mut-2对还原糖的利用速率高于出发菌株,其生物量积累亦高于出发菌株。     

阿维菌素生产菌的常压室温等离子体诱变育种及培养基优化

【目的】通过诱变筛选技术选育阿维菌素高产突变株,对其发酵培养基进行响应面优化,提高阿维菌素产量。【方法】采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,结合链霉抗性和卡那霉素抗性筛选法及96深孔板高通量筛选法,筛选阿维菌素高产株。在单因素实验的基础上,应用响应面分析法对其发酵培养基进行优化,最后确定最佳培养基配方。【结果】获得一株遗传性状稳定的阿维菌素高产株K-1A6,其阿维菌素产量达到4.22 g/L,比出发菌株9-39提高了23.4%,在最佳培养基中阿维菌素产量达到5.36 g/L,较优化前提高了27.01%。【结论】通过对阿维链霉菌9-39菌株进行ARTP诱变筛选及发酵培养基优化研究能显著提高阿维菌素的产量。     

磷霉素产生菌的定向诱变育种

目的:提高出发菌的磷霉素产量.方法:采用紫外(UV)+亚硝基胍(NTG)复合诱变的方法处理出发菌株(Bacillus fusi-formis),以分别含2.0和2.5mg/mL磷霉素的分离培养基来筛选UV诱变和NTG诱变后的菌株.结果:从大量突变菌中选育出一株高产、稳定的磷霉素生产菌株.当底物浓度为10mg/mL时,其磷霉素产量由1.15mg/mL提高至2.30mg/mL,转化产量提高了100%,转化率提高了10.16%.结论:采用UV+NTG诱变结合含FOM的分离平板进行定向筛选可以获得FOM高产菌株.     

海洋枯草芽孢杆菌产纤溶酶的诱变育种与发酵工艺优化*

目的:对海洋来源的具有产纤溶酶能力的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LC6-1进行紫外诱变,得到高产且稳定的突变株PW6-3,对该突变株发酵产酶的条件进行优化。方法:采用单因素和正交试验进行发酵培养基组分和培养条件的优化。结果:突变株PW6-3的酶活力为(6 960.21 ± 85.51)U/mL,较原始菌株提高了30.48%。以PW6-3为出发菌株,采用单因素及正交试验的方法对菌株进行发酵培养基组分与培养条件优化,最终得到的最佳培养基组分是:玉米淀粉30 g/L,玉米浆干粉40 g/L,CaCl₂ 3 g/L;最佳发酵培养条件是:32℃,转速200 r/min,接种量3%,pH 6.5,种龄18 h,发酵培养时间66 h,最终菌株的酶活力稳定在(9 203.63 ± 67.85)U/mL。结论:发酵工艺优化后,菌株PW6-3纤溶酶产量较诱变之前的菌株LC6-1提高72.53%,且发酵工艺成本较低,具有较好的经济效益。     

高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7诱变株的筛选

【目的】对野生菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变育种,筛选高产DHA突变株。【方法】采用UV诱变和化学药物胁迫筛选方式,以菌株的生物量、油脂产量、DHA产量作为筛选指标,获得高产DHA突变株。【结果】经鉴定获得一株DHA高产突变株PKU#PM003,该菌株传代4次后仍保持较好的遗传稳定性。摇瓶发酵后,PKU#PM003生物量产量高达6.62 g/L,比原始菌株5.95 g/L提高了11.26%,脂肪酸含量高达4.01 g/L,比原始菌株3.18 g/L提高了26.1%,DHA在脂肪酸中所占比例由29.97%增加到33.43%,产量提高了41.01%,油脂突变效果显著。【结论】突变株PKU#PM003可作为性状优良的工业化发酵生产菌种,并在DHA产量提升上仍具有巨大的空间。     

氦氖激光和亚硝基胍复合诱变选育高产乙醇的休哈塔假丝酵母

木糖的乙醇发酵一直被视为木质纤维原料生物转化产生乙醇的关键因素,休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)是木糖发酵性能较好的天然酵母之一。对Candida shehatae HDYXHT-01进行了氦氖激光诱变和NTG诱变,力求选育出发酵木糖产乙醇能力强的菌株。氦氖激光诱变得到的突变株HN-3乙醇产量为17.03g/L,乙醇得率达到0.3393g/g,相比原始菌株提高20.36%。再对HN-3进行NTG诱变,得到的突变株NTG-2乙醇产量为24.20g/L,相比HN-3提高42.10%。进而对NTG-2菌株进行了摇瓶48h连续发酵试验,测得其乙醇产量、木糖利用率、乙醇得率和乙醇产率分别达到24.16g/L,69.26%,0.4360g/g和0.7075g/(L·h)。     

Breeding of ε-poly-L-lysine producing strain using succinic acid as sole carbon source

本文旨在通过诱变和耐受性筛选的手段提高放线菌ε-PL的产量.以稠李链霉菌Streptomyces padanus LS-L5为出发菌,经紫外诱变,在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上筛选快速生长的菌株,测定突变株的ε-PL发酵水平和遗传稳定性.经初筛和复筛,获得突变株H3,其摇瓶发酵ε-PL产量为0.68 g/L,较出发菌提高了41％,传代4次产量基本稳定.H3在5L发酵罐中分批发酵,ε-PL产量达到2.0 g/L,较出发菌提高了一倍.在固定二氧化碳的能力方面,突变株H3的PEP羧化酶酶活较出发菌株LSL5的PEP羧化酶酶活提高了1.67倍.     

聚γ-谷氨酸高产菌的选育与培养基优化

利用合成培养基为筛选培养基,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B6-1为出发菌株,经过三轮紫外线诱变和一轮硫酸二乙酯诱变得到了聚γ-谷氨酸高产突变株枯草芽孢杆菌W003,摇瓶液体发酵的聚γ-谷氨酸产量由出发菌株的10.9 g/L提高到20.5 g/L.单因素实验结果表明,该菌产聚γ-谷氨酸的合适碳源为葡萄糖,氮源为硫酸铵.通过正交实验得到了优化的培养基配方,经36h液体发酵,聚γ-谷氨酸产量可达到45.3 g/L.     

高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的分枝杆菌诱变选育及工艺优化

以实验室前期筛选得到的分枝杆菌(Mycobacterium sp.LY-1)为出发菌株,采用等离子诱变(ARTP)技术选育出能高效转化植物甾醇为重要甾体药物中间体9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的菌株,并对其转化工艺进行优化。经过ARTP诱变选育得到遗传稳定性较好的分枝杆菌突变株Mycobacterium sp.C33,当底物植物甾醇投料浓度为15 g/L时,转化生成9α-OH-AD的摩尔得率达到15.5%,较原始菌株提高34.8%。继而采用正交实验设计方法,对突变菌的发酵培养基组分进行优化,并建立了油水双相转化体系,进一步提高了突变菌株C33的产物摩尔得率,最高达到47.0%,较优化前(15.5%)提高了2倍。     

脱落酸高产菌的激光诱变筛选

对脱落酸产生菌分别进行了紫外诱变和紫外 -激光复合诱变筛选 ,结果表明紫外 -激光复合诱变正变率较高 ,正变幅度较大。从紫外 -激光复合诱变得到的突变株中筛选到一株遗传性状稳定的高产菌株 ,将其传代 5代 ,各子代发酵脱落酸的平均产量均在 2 .1mg·g-1 以上 ,比原始出发菌株产量提高了 32 %。     

产γ-聚谷氨酸菌株的诱变选育及其种子液工艺优化

以已筛选的1株产γ-多聚谷氨酸解淀粉芽胞杆菌C1为出发菌株,对其进行紫外线-亚硝基胍(NTG)复合诱变,并运用单因素试验和正交试验设计对诱变菌株的种子培养工艺进行优化。通过复合诱变选育得到1株能够稳定遗传的正突变菌株C1-6,其摇瓶发酵生产γ-PGA的产量由18.4 g/L提高到24.2 g/L,增加了31.5%,且传代8次后仍能保持稳定。通过单因子试验筛选到玉米粉和黄豆粉作为C1-6生长的C源和N源。正交试验后,C1-6在成分为K2HPO41.0 g/L、Mg SO40.5 g/L、黄豆粉15.0 g/L、玉米粉5.0 g/L,p H 6.5的培养基中,37℃、装液量1/5(150 m L三角瓶装液30 m L)的培养条件下可获得较大的生物量,OD600达到6.31。     

戊糖乳杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育

戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)是能利用木质纤维素水解液发酵产乳酸的潜力菌株,发酵条件优化与高产菌株的选育是提高乳酸产量的重要手段。通过单因素试验、Plackett-Burman设计与响应面试验,对戊糖乳杆菌ATCC 8041产乳酸的发酵培养基及发酵条件进行了优化。结果表明,该菌株发酵培养基的最佳组合为葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸钙29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、Mg SO4 0.20 g/L、Mn SO4 50 mg/L;最佳发酵条件为37℃、p H6.5、接种量6%、装液量80%。在此优化条件下,该菌株发酵产乳酸为54.12 g/L。进一步以戊糖乳杆菌ATCC 8041为出发菌株,通过原生质体进行紫外诱变,经多重筛选,最终获得一株遗传稳定性好的高产乳酸突变株,命名为戊糖乳杆菌Lactic UVC-02,由中国典型培养物保藏中心保存,注册号为CCTCC M 2013209。该突变株Lactic UVC-02经葡萄糖发酵,乳酸产量达64.17 g/L,比出发菌株ATCC 8041(54.12g/L)提高18.6%。     

花生四烯酸油脂高产菌株的选育

以高山被孢霉为出发菌株,抗氧化剂——没食子酸辛酯为筛选剂,经过紫外-LiCl复合诱变处理,筛选出抗脂肪酸脱氢酶抑制剂的菌株。将筛选出的菌株经过摇瓶发酵复筛,筛选到1株生产性能优于出发菌株的突变株R807。与原始菌株相比,该菌株的油脂组成脂肪酸分布中C18系列脂肪酸相对较少,花生四烯酸(ARA)占总脂肪酸的含量保持在40%(质量分数)以上。其菌体生物量达到39.2 g/L,油脂产量达到16.3 g/L,ARA占总脂肪酸含量为41.72%(质量分数),ARA产量达6.81 g/L。各数值比原始菌株分别提高了22.9%、3.2%、35.1%和39.8%。连续传代多次,其产量性状无显著变化。     

胞苷生产菌的选育

目的：筛选得到胞苷发酵单位较高的菌株,并对发酵过程作初步研究。方法：以胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌DOS7为出发菌株,对其进行紫外诱变、5-氟胞苷（5FCR＋）和2-杂氮尿嘧啶抗性（2AU＋）抗性筛选。结果：通过紫外诱变和抗性筛选得到突变株DOS7-2-1000-15,抗5-氟胞苷和2-杂氮尿嘧啶的临界浓度分别为800mg/L和1 000mg/L。同时检测了抗5-氟胞苷突变株中CTP合成酶的活性,比原始菌株提高了12.4%,突变株DOS7-2-1000-15发酵过程结果为：36℃发酵72h能积累胞苷最高为3.5g/L。结论：筛选得到的突变株DOS7-2-1000-15的遗传稳定性较好,可稳定发酵。     

睾酮转化菌的筛选及发酵条件优化

采用亚硝基胍(NTG)对主产雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)的菌株YHT-1进行诱变,获得了一株睾酮(TS)产量较高的菌株YHT-103。通过对发酵条件及发酵培养基的优化,获得最佳培养条件为转化培养基:葡萄糖15 g/L,硝酸铵4g/L,MgSO40.5g/L,K2HPO40.5g/L,植物甾醇2g/L,tween80 6g/L,pH值6.5。种子培养时间30h,接种量10%,培养温度28℃。最佳转化条件下,获得最高TS转化率为46.20%。     

耐铵型产琥珀酸放线杆菌的选育

以Actinobacillus succinogenes NJ113为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)诱变,在含8～20 g/L硫酸铵平板中筛选到一株耐铵型突变株YZ25,该菌株在含8 g/L硫酸铵培养基中厌氧发酵,琥珀酸产量达32.68 g/L,比出发菌提高了180.5%,对葡萄糖收率达65.4%,副产物乙酸、甲酸产量分别下降3.5%、28.7%,琥珀酸/乙酸比值由0.63提高到2.5。在7.5 L发酵罐中,用氨水调节pH分批实验,发酵34 h琥珀酸产量达27.13 g/L,较出发菌株提高了85.3%。     

L-异亮氨酸高产菌选育及其培养基优化

旨在诱变选育L-异亮氨酸高产菌,并探索突变株最佳发酵条件。利用传统化学诱变结合常压室温等离子体生物诱变体系对实验室保藏的Brevibacterium flavum I-12进行逐级诱变,选育2-噻唑丙氨酸(2-TA)和磺胺胍(SG)高抗性和在琥珀酸平板上能快速生长的突变菌株。随后,在单因素实验的基础上,利用响应面设计优化出目的突变株摇瓶发酵培养基组分的最佳参数水平。结果显示,经过一系列诱变和筛选,成功选育出一株在40 g/L的2-TA和5 g/L的SG,且以琥珀酸为唯一碳源的培养基上快速生长突变株,命名为B. flavum TA-6,该菌株产酸达26.2±0.5 g/L,比出发菌株提高了44.75%,而副产物L-缬氨酸和L-亮氨酸积累量明显降低。经响应面法优化发酵条件后,突变株产酸可达27.8±0.5 g/L,比优化前提高了6.1%。通过传统化学诱变结合ARTP生物诱变体系,成功选育出一株杂酸降低的L-异亮氨酸高产菌TA-6,该菌株具有潜在生产应用价值。     

UV与NTG复合诱变选育咪唑立宾高产菌

为选育咪唑立宾的高产菌株,对咪唑立宾产生菌Eupenicillum sp.E-0509-2的孢子分别进行了紫外线照射(UV)、亚硝基胍(NTG)和UV+NTG复合诱变处理筛选突变株。结果表明试验所确定的咪唑立宾产生菌的孢子诱变适宜条件为:将孢子悬液在电磁搅拌下,经紫外线照射处理60s后,以3.0g/L NTG处理20min。经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产咪唑立宾的诱变菌株Eupenicillum sp.E-UN41,其咪唑立宾产量较出发菌株提高13倍。