利用Bac-to-Bac系统表达棉蚜的乙酰胆碱酯酶

Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统是一种高效真核表达系统。采用重组DNA技术构建棉蚜乙酰胆碱酯酶1(AChE1)表达质粒,应用该系统在昆虫Sf9细胞系中成功表达了棉蚜的AChE1。表达的AChE以可溶性形式释放于细胞培养液中,对其自然底物类似物ATChI的Km值为(144·5±28·6)μm;对抗蚜威、唑蚜威、氧化乐果和灭赐松等4种杀虫剂的敏感性指数(Ki值)分别为513、1883、5和23(mM·min)-1,与文献报道的测定结果基本一致。昆虫细胞被重组病毒感染后第2~3天所得产物的活性最高;该产物在-20℃保存90d后活性没有明显下降,4℃保存60d后下降40%,室温(22℃)保存7d后即下降70%。     

纤维连接蛋白细胞结合区功能多肽在杆状病毒表达系统中的表达与纯化

目的：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纤维连接蛋白（FN）细胞结合区功能多肽（CBD）,并对其进行纯化和鉴定。方法：经PCR获得人血浆FN-CBD基因,酶切后定向克隆到T载体上,经测序正确后插入pFastBacHTB载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞;用抗生素平板筛选重组杆粒,脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞并进行蛋白表达;经Ni-NTA层析柱对重组多肽进行纯化,对纯化的多肽行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果：得到融合6个组氨酸残基的FN-CBD,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为36000,Western-blot表明该多肽能与FN的多克隆抗体结合。结论：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能成功表达出人血浆FN-CBD,且表达产物具有良好的免疫原性,为后续结构、功能研究奠定了基础。     

不同区段HIV-1 env基因在Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统中的表达及检测

利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,将从一株HIV-1阳性克隆质粒中获得的几个HIV包膜蛋白基因片段,克隆入转移载体中得到重组病毒.用此重组病毒感染昆虫细胞后表达出3种HIV包膜蛋白,即GP120-41P、GP41T、GP41P,分别含有HIV-1包膜糖蛋白GP120及部分GP41,删除了N端12个疏水氨基酸的GP41和仅有主要表位约240个氨基酸的GP41.收获后分别以Western-blotting和EIA检测,有较好的免疫学活性,其中GP41T的活性最强.该实验为HIV包膜蛋白的结构研究提供了依据,加以改进后可能有免疫检测的价值.     

重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定

PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着极其重要的作用。近年来,体外大量表达和纯化有活性的PLCζ蛋白用于结构生物学研究一直未能获得成功。本研究首次在杆状病毒表达系统中表达和纯化重组人PLCζ蛋白,首先将人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA质粒构建重组载体,转化DH10Bac发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9昆虫细胞进行蛋白表达;利用Ni~(2+)亲和柱及分子筛来纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blotting及飞行时间质谱对蛋白进行鉴定,并进行酶活性测定。结果显示重组蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒后72 h达到峰值并以分泌形式表达在细胞培养基中,Ni~(2+)亲和柱及分子筛纯化后的重组蛋白经Western blotting及电离飞行时间质谱鉴定为PLCζ蛋白,酶活性可达326.8 U/mL。该实验结果为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究提供了可参考利用的技术。     

人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备

旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性。将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100 mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100 000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10 000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础。     

人骨形成蛋白3在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化及其诱骨活性检测

为了在昆虫杆状病毒系统中表达人骨形成蛋白 3(humanbonemorphogeneticproteoin3,hBMP3) ,检测表达产物的诱骨活性 .将hBMP3全长cDNA 1416bp克隆入转移载体K8中 ,再与病毒DNA经脂质体包裹后转染昆虫细胞Sf9.重组病毒经蓝白筛选后 ,用PCR方法扩增目的基因片段进行初步鉴定 .收集重组病毒的转染上清 ,肝素亲和层析纯化目的蛋白 .SDS PAGE和Western印迹进一步鉴定此蛋白 .体外培养MC3T3 E1细胞 ,经目的蛋白刺激后 ,检测细胞内碱性磷酸酶 (ALP)活性 .并将目的蛋白进行小鼠体内肌肉包埋实验 ,检测其异位诱骨活性 .结果显示 ,肝素亲和层析可以收集 1个高的洗脱峰 .SDS PAGE显示 ,非还原型样本为 32kD的二聚体蛋白带和少量 16kD单体蛋白带 ;还原型样本仅有相应大小的单体蛋白带 ,纯度达 80 % .Western印迹在相应位置呈阳性染色 .此蛋白刺激小鼠成纤维细胞 4 8h后 ,胞内ALP的活性增高 ,经rhBMP3作用后的细胞MTT染色减弱 .在小鼠股部肌肉内包埋蛋白样品 2～ 3周 ,组织学检测有成骨组织生成 .说明hBMP3在此套系统中获得了表达 .表达产物在体外可以刺激成骨细胞的分化 ,却抑制细胞的增殖 .小鼠体内异位诱骨实验进一步证实表达产物具有成骨活性     

亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用

亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具,具有结合特异性高、洗脱条件温和、通用性强、纯化倍数高等显著优点。概述了亲和标签对融合蛋白表达的影响,可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠;回顾了在重组蛋白表达与纯化中广泛使用的几种亲和标签,以及近年来相继出现的几种比较新颖的纯化标签;介绍了亲和标签的组合使用策略,His6-MBP组合标签集合了两个标签的优点,串联亲和纯化可以纯化获得生理条件下的蛋白质复合体;展望了亲和标签未来的发展趋势,认为仍需继续开发性能更加优越、纯化效果更加显著的纯化标签系统。     

拟南芥生长素结合蛋白ABP1 的原核表达及蛋白纯化

目的:鉴于生长素结合蛋白(Auxin Binding Protein,ABP)能与生长素特异性结合,因而探讨研究其直接用于生长素信号转导机理和生物传感器的可能性与可行性。方法:通过RT-PCR获得拟南芥生长素结合蛋白1(Auxin bing protein 1,ABP1)的全长CDS,将其克隆到原核表达载体pGEX4T-1中,成功构建pGEX4T-1-ABP1重组表达载体。经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化表达受体菌BL21(DE3)。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导后,取样进行SDS-PAGE分析。结果:成功表达出一个分子量约为43 kD的可溶性融合蛋白,并利用GST亲和柱纯化方式得到了ABPl。结论:通过原核表达并经GST柱纯化后获得ABP1,为生长素生物传感器的研制开辟新的途径。同时为进一步研究ABP1与生长素的信号转导机制和生长素在生物传感测定技术中的研究和应用奠定基础。     

裂殖酵母Pmt3蛋白的原核表达纯化与结晶研究

[目的]克隆裂殖酵母pmt3基因,利用大肠杆菌过量表达Pmt3重组蛋白,并进行Pmt3蛋白的纯化及晶体培养。[方法]利用PCR体外扩增pmt3基因的编码序列,通过NdeⅠ和Bam HⅠ限制性酶切和SolutionⅠ连接技术将其克隆至p ET28a载体,利用大肠杆菌Rosetta(DE3)表达Pmt3重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析柱His Trap(5 m L)和分子筛层析柱Superdex 75(16/60)依次纯化目的蛋白,利用超滤离心管进行蛋白质的浓缩,采用48孔板坐滴气相扩散法进行蛋白晶体初筛。[结果]在16℃恒温条件下经0. 3 mmol/L IPTG诱导后Pmt3蛋白过量表达。经Ni-NTA亲和层析和Superdex 75分子筛层析纯化得到了高纯度的Pmt3蛋白,最终蛋白浓缩至9. 5 mg/m L。经96条件蛋白结晶条件筛选,在18℃恒温稳定条件下获得了Pmt3蛋白晶体。结晶条件为:0. 1 mol/L sodium acetate trihydrate,p H 4. 6,8%polyethylene glycol 4 000。[结论]裂殖酵母Pmt3蛋白在16℃条件下...     

6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶的纯化与结晶条件

【目的】在大肠杆菌中克隆表达尼古丁降解关键的6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶基因hspB,纯化重组HspB蛋白并进行结晶条件的初步研究。【方法】从恶臭假单胞菌S16基因组中PCR扩增hspB基因,构建重组表达载体pET28a-hspB,并在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组蛋白。利用悬滴扩散法对HspB蛋白进行结晶条件筛选和优化。【结果】本文成功构建重组质粒pET28a-hspB并纯化获得达到结晶纯度的HspB蛋白。结晶条件初筛和优化后获得可培养HspB蛋白晶体的条件为0.2 mol/L NaCl、0.1 mol/L HEPES pH 7.5、1.1 mol/L(NH4)2SO4、4°C、加晶种。【结论】HspB蛋白纯化体系的构建和结晶条件的初步研究为从结构生物学的角度进一步研究HspB结构与功能的关系、定向进化提高HspB催化效率奠定了基础。     

鼠脑驱动蛋白的表达、纯化和结晶

驱动蛋白是一类利用水解ATP为ADP和磷酸的过程中释放的能量沿微管系统运动的蛋白。为了研究ATP中储存的化学能是如何转化为驱动蛋白的机械动能,鼠脑驱动蛋白的相关N-端区域在BL21-Codon Plus(DE3)-RP感受态大肠杆菌细胞中大量地表达。通过SP-强阳离子交换色谱和分子筛色谱的两步骤纯化,蛋白最终产量高达10 mg/L细胞培养液,蛋白纯度可以达到95%以上。纯化的蛋白具有水解ATP酶的活力,并与驱动蛋白抗体有特异性的反应。驱动蛋白可以在如下条件结晶:1.7 mol/L(NH4)2SO4,500 mmol/L NaCl,20%glycerol。晶体衍射的分辨率可以达到2.0。     

重组芋螺毒素GeXIVAWT的表达、纯化和鉴定

芋螺毒素GeXIVAWT是来自食虫将军芋螺(Conus generalis Lonnaeus)毒管中,具有两对二硫键的28肽.通过化学合成这种芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化.利用简单快速的重组表达来生产富含二硫键的芋螺毒素有可能成为有效的新途径.通过对芋螺毒素GeXIVAWT的基因进行密码子优化,人工合成引物来构建表达载体pET22b(+)/pelB-GeXIVAWT.融合了信号肽的重组芋螺毒素以包涵体的形式在大肠杆菌中获得了高效表达.利用低浓度尿素洗涤和超滤管进行纯化无组氨酸标签的重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT,再利用稀释复性的方法将无活性的包涵体转变成具有活性的重组芋螺毒素.复性后的重组蛋白采用反相高效液相色谱进一步纯化后进行了质谱鉴定.活性实验表明重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT具有抑制昆虫细胞Sf-9的生长,为研究芋螺毒素作为生物杀虫剂奠定基础.     

6-羟基烟酸3-单加氧酶NicC的纯化与结晶

【背景】含氮杂环吡啶化合物是重要的环境污染物之一,在人体内长期积累会导致肿瘤/畸胎等疾病,利用微生物降解含氮杂环化合物是一种非常有效的途径。【目的】在大肠杆菌中克隆表达6-羟基烟酸3-单加氧酶基因nic C,纯化重组Nic C蛋白并进行结晶条件的研究。【方法】以恶臭假单胞菌KT2440为模板对nicC基因进行PCR扩增,构建重组表达载体p ET28a-nic C,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组蛋白。利用悬滴扩散法对NicC蛋白进行结晶条件筛选和优化。【结果】成功构建重组质粒p ET28a-nic C并纯化获得达到结晶纯度的NicC蛋白。通过结晶条件初筛和正交优化实验发现,NicC蛋白的最佳结晶条件为:0.2mol/LNH₄Cl,0.01mol/LCaCl₂·2H₂O,31%PEG4000,0.05mol/LTris-HClp H8.0,4°C;Se Met-NicC蛋白和NicC与6-HNA共晶的最佳结晶条件为:0.2 mol/L NH4C...     

融和蛋白GST-SUMO-MT在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

将编码融合蛋白GST-SUMO-MT的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-GS-MT并转化到大肠杆菌Origami（DE3）中。20℃,1mM的IPTG诱导20h后,获得分子量约为43Kd的融合蛋白,表达量占菌体上清总蛋白的38.4％。利用谷胱甘肽交联琼脂糖（Glutathione Sepharose 4B）凝胶柱和Sephardex G-25分子筛联用可以得到纯度为95%以上的融合蛋白,得率约为70mg/L。该融合蛋白可与GST抗体产生阳性反应。融合蛋白GST-SUMO-MT可以显著提高宿主对Cd2+、Zn2+和Cu2+离子聚积的能力,其耐受能力比对照组分别提高4.2倍、4倍及1.6倍。此外,原子吸收光谱法测定,每分子GST-SUMO-MT可以结合2-3个Cd2+离子。     

幽门螺杆菌VacA重组蛋白表达、纯化及鉴定

目的研究幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）编码基因在大肠埃希菌中的表达及纯化重组蛋白的抗原性。方法将PET32a-vacA-E.coli BE21（DE3）工程菌株常规培养,碱裂解法小量提取重组质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定,基因测序法进行插入基因序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达,镍亲和层析原理提纯,ELISA法检测其抗原性。结果经酶切鉴定表明,插入的基因片段全长约2240bp,测序分析及与Genebank比较,可以肯定插入片段为vacA基因,ELISA法检测重组蛋白具有良好的抗原性。结论VacA重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白具有良好的抗原性。     

耐有机溶剂果糖苷酶的胞外表达、纯化和结晶

【目的】克隆表达一种Arthrobacter arilaitensis NJEM01来源的耐有机溶剂β-呋喃果糖苷酶(β-FFase),纯化并进行结晶条件的研究。【方法】构建pelB信号肽与β-FFase融合表达质粒pET22b-pelB-bff,将其导入Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达,硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换色谱两步纯化重组蛋白,采用坐滴式气相扩散法对β-FFase进行结晶条件筛选和优化。【结果】构建重组质粒pET22b-pelB-bff,通过优化诱导表达条件,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导温度30 °C,诱导时间10 h,比活力高达108 U/mg,实现了果糖苷酶的胞外可溶性表达,纯化获得达到结晶纯度的β-FFase。结晶条件初筛和优化后获得可培养β-FFase晶体的条件为0.15 mol/L氯化钙,0.1 mol/L HEPES pH 6.7,26%聚乙二醇400。晶体衍射分辨率可以达到2.1 ?。【结论】高糖苷合成能力β-FFase表达纯化体系的构建和结晶条件的初步研究,为从结构生物学角度进一步研究果糖苷酶结构与功能的关系,定向进化提高糖苷酶转糖基活性奠定了基础。     

新型载体蛋白P64K在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化

用常规PCR方法从脑膜炎球菌中克隆出P64K基因,构建重组质粒pET28a-P64K转化BL21(DE3)宿主菌,经眦诱导表达筛选P64K蛋白的高表达菌株。结果证实P64K蛋白为胞内可溶性表达,表达量约占胞内总蛋白的30％。重组P64K蛋白经Butyl疏水柱、G200分子筛柱和Q阴离子柱三步层析后纯度达到95％以上,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。     

乙肝表面抗原结合蛋白SBP在毕赤酵母中的表达纯化及功能鉴定

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein,SBP)是本实验室发现的一种人源蛋白,该蛋白与人乙型肝炎病毒HBV表面抗原HBsAg存在特异性的结合能力。此前的研究证实SBP具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用。为进一步研究该蛋白的生理功能和作用机制,利用毕赤酵母表达系统进行了SBP的表达菌株构建,筛选得到了SBP的高效表达菌株。发酵产物经过分离纯化,最终得到了大量高纯度的真核来源的目的蛋白。通过SDS-PAGE、高效液相色谱、Western blotting和质谱鉴定,证实所得到的蛋白具有较高的纯度和完整性。通过ELISA方法初步证实了其与乙肝表面抗原具有较好的结合能力。该研究为进一步进行SBP的体内外功能研究及免疫增效研究打下了基础。     

膜蛋白KCNN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化

目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果。结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1。结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法。