化学诱变剂EMS对知母种子萌发的影响

以知母（Anemarrhena asphodeloides）种子为材料,分别采用1%、2%、4%、6%浓度的EMS处理6、8、12和24 h,在恒温培养箱内进行种子萌发实验,研究不同浓度的化学诱变剂甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）处理对知母种子萌发的影响,筛选适宜的诱变浓度和诱变时间。结果表明：随EMS浓度的增加和处理时间的延长,知母种子发芽率呈现逐渐降低的趋势,以相对发芽率达到半致死浓度为标准,6%EMS浸种12和24 h可作为EMS诱导知母建立突变体库的适宜条件。     

EMS处理对大白菜种子和幼苗活力的影响及M_2表型变异分析

大白菜突变体的获得是种质创新的有效途径,也是开展功能基因组研究的材料基础。本研究选取自交亲和、易进行小孢子培养的大白菜自交系‘A03’作为构建突变体库的野生型材料。分析EMS种子处理对M1、M2种子和幼苗活力及生理特性的影响,确定适宜诱变方案并构建突变体库,并针对突变体库M2群体结球期、收获期和生殖生长阶段表型性状变异进行了分析。结果表明,以浓度0.4%的EMS浸泡种子16 h,以及连续对两代种子进行诱变处理,均可以构建大白菜突变体库。突变体库M2群体植株在结球期、收获期和生殖生长阶段表型变异丰富,变异频率分别为21.65%、22.40%和25.65%。     

优化易错PCR条件以提高毕赤酵母GAP启动子文库突变效率

高效的随机突变策略对于构建含有丰富突变体的启动子文库至关重要。为了建立一个突变率适中并能获得较多有益突变子的易错PCR(error-prone PCR,EP-PCR)条件,实现毕赤酵母GAP启动子的高效突变,对EP-PCR反应条件进行了优化。考察了模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度对EP-PCR的产物得率和突变率的影响后,确定了适于GAP启动子突变的EP-PCR条件:模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度分别为1 ng/μL、25和10 mmol/L。优化EP-PCR条件后,GAP启动子突变率为1.1%,连续进行3轮EP-PCR后突变率可达到4.0%。利用优化后EP-PCR对GAP启动子进行随机突变,筛选了250个突变子,获得5个启动子强度高于野生型GAP启动子的突变体,有益突变达到了2%,可用于构建GAP启动子文库。     

绿玉树试管苗物理化学诱变及其抗寒突变体的筛选

以已建立的微体繁殖体系为基础,对绿玉树再生丛芽进行Co^60γ射线不同剂量的辐射和不同浓度EMS诱变处理,以HYP为突变体选择压,筛选出抗HYP突变体小苗,并对突变体小苗进行抗寒测试。结果表明：辐射剂量影响丛芽的增殖、突变率及芽苗的生长,1．5KR为绿玉树丛芽辐射诱变比较适宜的剂量。0．2％的EMS亦能诱导绿玉树丛芽块产生突变芽,但与正常培养获得的再生小苗相比,诱变后产生的抗HYP芽苗生长缓慢,再生小苗矮小。抗HYP突变小苗的抗寒性比正常植物的抗寒性强。     

苦荞突变体库构建与突变体中芦丁合成相关基因表达分析

苦荞是重要的小杂粮作物之一,营养物质丰富,是天然芦丁的重要来源。突破苦荞育种难题,创制苦荞新种质是目前研究的重要方面。本试验利用甲基磺酸乙酯(EMS)构建了黑丰1号苦荞突变体库,明确了当EMS浓度为1.2%时,诱变效果较好。通过对M1突变株表型观察统计,共获得叶色、叶型、株型、粒型变异单株102株,突变率为3.85%;高效液相色谱技术(HPLC)测定1000株M3材料,获得高芦丁含量突变株系2个和低芦丁突变体株系5个;qRT-PCR对芦丁含量突变体株系中芦丁代谢关键酶基因(CHS、F3H、4CL、FLS、UFGT)进行表达量分析,发现不同株系中上述基因的表达量与芦丁含量相关性不明显,但个别基因如FtFLS基因表达量在高芦丁含量突变体中达到对照的4.55倍。通过突变体的筛选丰富了苦荞基因资源,创新了苦荞新种质,也为苦荞芦丁代谢的分子基础研究提供了材料保证与技术支持。     

糜子EMS突变体库构建和突变体筛选北大核心CSCD

糜子(Panicum miliaceum L.)具有抗旱、耐瘠、适应性广、生育期短等特点,是我国北方地区的杂粮作物。糜子高产品种不耐水肥、易倒伏,锄草、间苗费时费工的问题严重影响着农民对糜子生产的积极性和收入。EMS(甲基磺酸乙酯)化学诱变方法成本低,操作简单,诱变率高,是作物育种的重要方法。本试验选用糜子品种伊选大红糜进行EMS化学诱变而构建突变体库,对获得的2333个M2材料进行突变频率和全生育期表型多样性等特征的分析。结果显示,所构建的糜子突变体库材料变异类型非常丰富,共发现104个形态性状突变株系,突变频率为4.5%,包括叶色、叶型、株高、生育期、育性、穗型、种皮颜色等性状,该突变体库的构建将为糜子功能基因组学研究和育种提供丰富的突变体资源和新型种质。     

糜子EMS突变体库构建和突变体筛选

糜子(Panicum miliaceum L.)具有抗旱、耐瘠、适应性广、生育期短等特点,是我国北方地区的杂粮作物。糜子高产品种不耐水肥、易倒伏,锄草、间苗费时费工的问题严重影响着农民对糜子生产的积极性和收入。EMS(甲基磺酸乙酯)化学诱变方法成本低,操作简单,诱变率高,是作物育种的重要方法。本试验选用糜子品种伊选大红糜进行EMS化学诱变而构建突变体库,对获得的2333个M2材料进行突变频率和全生育期表型多样性等特征的分析。结果显示,所构建的糜子突变体库材料变异类型非常丰富,共发现104个形态性状突变株系,突变频率为4.5%,包括叶色、叶型、株高、生育期、育性、穗型、种皮颜色等性状,该突变体库的构建将为糜子功能基因组学研究和育种提供丰富的突变体资源和新型种质。     

罗布麻EMS突变体库构建及黄酮变异突变体筛选

罗布麻(Apocynum venetum L.)突变体的获得是人工创新种质资源的有效途径,也是开展品种选育、功能基因组研究的基础。本研究以采自东营野生罗布麻种子作为材料,预试验结果表明0.7%的甲基磺酸乙酯(EMS,ethylmethylsulfone)溶液诱变罗布麻种子13 h能够达到半致死剂量。在此浓度和处理时间下构建了一个1452株的突变体群体,对获得的M1植株进行农艺性状和总黄酮含量性状筛选,初步获得125份农艺性状突变材料,其中包括8株白化植株、23株叶型变异株、16株叶色黄纹突变体、32株苗期分枝植株以及46株叶位变异突变体,突变频率分别为0.55%、1.6%、1.1%、2.2%和3.2%。此外,还筛选到2株总黄酮含量明显高于野生型和1株低于野生型的材料。在突变群体中对黄酮代谢途径中编码黄烷酮-3-羟化酶的基因(F3H,flavanone 3-hydroxylase gene)进行测序鉴定,结果鉴定到3株F3H基因的突变体。本研究构建的罗布麻突变体库表型丰富且突变位点可以鉴定,是罗布麻新种质筛选、品种选育以及基因功能研究的良好材料。     

陆地棉EMS诱变体系的优化及种子和纤维发育异常突变体的鉴定

突变体是进行基因功能研究的遗传学材料。本研究利用浓度为0～1.5%EMS溶液处理已萌发露白的陆地棉(Gossypium hirsutum L.)鲁6269种子4～12 h,分析不同浓度的EMS溶液处理不同时间对棉花出苗率和生长的影响,并在M_2和M_3对突变体进行了初步的形态学鉴定。结果表明,1.0%EMS溶液处理10 h,鲁6269的出苗率为49%,为该材料的半致死浓度,诱变效果最佳。为了获得大量的突变体,利用该浓度,处理鲁6269萌发的种子(约10000粒)10 h,在M_2发现一株纤维发育异常(纤维成熟脱水后不蓬松)的突变体,收获该突变体自交种子,M3跟踪调查,发现该突变体纤维发育异常表型与M_2相同,种子解剖观察发现,该突变体种胚与外种皮之间存在一个大空腔,种胚弱小且扁瘪,影响种子的出土。本研究优化建立了陆地棉品种鲁6269种子EMS诱变体系,在M_3筛选获得一个种子与纤维发育异常的突变体sfm-1,为研究棉花种子及纤维发育提供了遗传学材料。     

裸燕麦EMS突变体库筛选与分析

燕麦是重要的粮饲兼用作物,构建燕麦EMS突变体库对燕麦功能基因组学研究和遗传改良有重要意义。本试验利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS,ethyl methane sulfonate)处理燕麦品种花早2号,获得了4083株M1材料;对其中2000个单株种植了M2株行,进行全生育期调查,鉴定其表型变化;对2份黄化苗突变材料种植了M3家系,进行相关突变性状的稳定性验证。结果表明,燕麦经EMS处理后代变异巨大,在M2发现表型突变材料196份,变异率为9.8%,变异类型非常丰富,包括幼苗习性、叶片性状、分蘖、株高、穗部形态及成熟期等突变株系。M3证实突变的黄化苗特性可以稳定遗传。本研究建立了燕麦EMS诱变体系,获得的燕麦变异类型丰富,为燕麦功能基因组学研究和燕麦遗传改良奠定了材料基础。     

EMS诱变西瓜突变体库的构建及表型分析

采用1.0%诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理西瓜品系W1-17种子9h,然后对M1和M2代群体单株在叶、花、茎、育性、分支习性等方面进行表型变异观察,同时选取M2代典型变异株系,利用23对西瓜SSR引物进行分析鉴定,构建西瓜突变体库。结果表明:(1)EMS诱变使M1代幼苗形态呈现出叶畸形、叶褶皱、部分黄化、花畸形、雄花不散粉、卷须畸形、矮小、生长缓慢、不育等特异性状,获得由1 252个单株组成的西瓜突变体M1群体,群体总变异频率为18.33%。(2)M2代共筛选到205个突变植株,40种表型变异,表现在子叶性状(黄化、扭曲不对称、折叠等)、叶和茎性状(叶黄化、变小、裂刻变深,茎变细,节间变短,分支少等)、花性状(花变大,花色变浅,两性花,花瓣皱缩、部分退化、数目突变,柱头畸形,雄蕊不成熟等)和其他性状(生长缓慢、不育等)等方面,总的表型突变率达到了19.59%。(3)针对M2代10个典型变异植株,通过SSR引物分析发现有9份材料在DNA水平上有变异。本研究初步构建了含有120个M1代家系及1 051株M2代植株、40种表型变异的西瓜突变体库。     

甲基磺酸乙酯（EMS）对萝卜早期发育性状的诱变效应

甲基磺酸乙酯(EMS)诱变育种有着诱变频率高、突变性状多及破坏性小等优点被广泛用于多种作物诱发突变育种。本研究利用不同浓度的EMS对不同品种的萝卜种子进行浸种处理后,发现EMS对萝卜的种子发芽率、萝卜苗根部长度及田间性状等指标上的诱变效应。研究结果表明随着EMS浓度(0.2%~2%)的增加,种子发芽率急剧降低且萝卜苗期根长明显变短,整体呈显著的抑制生长作用。不同品种间对EMS的敏感度依次顺序为短叶-13>夏抗40>春白11-58>双红一号。以半致死浓度为EMS浓度选择标准,确定了EMS处理不同品种萝卜间的适宜浓度为0.4%~0.6%。通过田间性状调查发现0.5%EMS处理短叶13萝卜种子下播大田后,相比对照处理品种表现子叶卷曲及撕裂、真叶增厚及黄化等情况,进一步表明EMS对短叶13萝卜存在的诱变效应。本研究确定了化学诱变剂EMS对萝卜诱变的半致死剂量,初步确认EMS对萝卜早期生长发育性状的诱变效应,将为后期的萝卜诱变育种研究提供研究材料和参考。     

EMS对D6-2转基因小鼠骨髓组织细胞内lacⅠ靶基因的诱变率和诱变谱

对D6 -2转基因小鼠骨髓组织细胞内lacⅠ靶基因的自发突变率以及甲基磺酸乙酯 (ethylmethanesulfonate ,EMS)诱发的突变率和突变谱进行了研究 .将带有lacⅠ靶基因的pSPORT1质粒通过酶切、环化和转化DH1 0B宿主菌的方式从经和未经诱变处理的D6- 2转基因小鼠骨髓组织基因组DNA中回收出来 ,lacⅠ靶基因突变体用M9/L选择性平板进行正向选择 .结果从经EMS诱变处理的小鼠基因组DNA中回收出的约 1 1 935个pSPORT1质粒中筛选到 6个lacⅠ-突变体 (EMS诱发的突变率为 5 0× 1 0 ^-5 ) ,而从对照组小鼠基因组DNA中回收出的约 1 1 6 4 9个质粒中没有检测到lacⅠ^-突变体 (自发突变率则小于 8.6× 1 0 ^-5 ) .对 6个突变体的 2个突变高发区进行了序列分析 ,共检测出 1 6个点突变 .其中 ,碱基置换突变为主要突变类型 ,占 87.5 % ( 1 4) ,其余 1 2 .5 % ( 2 )的突变为缺失突变 .在碱基置换突变中 ,颠换占6 4 % ;而转换仅占 36 % ,这既不同于用BigBlue 转基因小鼠所测到的lacⅠ基因在小鼠体内的自发突变谱 ,又不同于用穿梭载体 /哺乳动物细胞系统所测到的EMS在体外的诱变谱 .而突变发生的位点则与其他的研究报道相同 ,主要出现在CpG二核苷酸 ,占全部点突变的 45 % .这些结果表明 :( 1 )基于含 pSPORT1质粒的D6- 2转基因小鼠是一个能用于研究体内基因突变的分子机理和评估化学物质的遗传毒性作用的有效模型 ;( 2 )EMS在体内和体外的诱变特性似有本质的不同 ,但这有待于进一步的研究证实     

谷氨酸依赖型氨基转移酶的高通量筛选方法及其应用

目的:建立谷氨酸依赖型氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96孔板高通量筛选方法,并用于大肠杆菌氨基转移酶Wec E突变库的筛选。方法:通过优化偶联指示酶-谷氨酸脱氢酶、信号分子NADH浓度及双酶偶联反应时间,建立了光学法测定氨基转移酶活性的氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应方法;通过定点饱和突变技术构建了大肠杆菌氨基转移酶WecE的突变库;采用96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了高活性的转氨酶突变体,并对纯化的突变体进行催化活力分析。结果:建立了谷氨酸依赖型氨基转移酶目标反应与0.5 U/ml L-谷氨酸脱氢酶和0.4 mmol/L NADH信号指示反应相偶联的筛选方法;构建了氨基转移酶WecE Tyr 321饱和突变库,通过96孔板高通量筛选,获得了催化活性比野生型提高3.4倍的突变体Y321F。结论:所建立高通量筛选方法背景干扰小,准确性高,为谷氨酸依赖型氨基转移酶分子进化提供了可行性方案。     

梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变筛选模型的初步研究

本文通过梅岭霉素 (Meilingmycin)产生菌南昌链霉菌NS 4 1 80菌株孢子对 6种抗生素敏感性测定 ,采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含致死浓度链霉素的高氏平板上。然后从抗药性突变标志菌株中进一步筛选梅岭霉素高产菌株。在 150 0多个抗药性突变株中通过初筛获得了比诱变出发菌株的产素能力提高 50 %以上菌株。通过诱变剂量分别与抗药性突变率和突变株产素产量的变势统计分析表明 ,菌株抗药性突变与产素突变密切相关 ,产素突变的EMS诱变剂量高于抗药性突变诱变剂量 ,在 0 .0 3mol/LEMS剂量作用下 ,菌株致死率为 99.4 3% ,抗药性突变率为 0 .0 4 4 0 % ,建立了梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变推理性筛选模型。为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试 ,并有助于其它链霉菌属的抗生素产生菌育种研究。     

重叠PCR 法构建XLRS1 三种不同类型突变体

目的:构建X连锁视网膜劈裂(XLRS)三种不同类型突变体(点突变、缺失突变、插入突变),以便进一步构建不同类型的突变细胞模型。方法:根据NCBI gene数据库中XLRS1基因的CDS设计三对不同类型的引物,使用重叠PCR法获得突变片段,然后克隆入载体pLJM1-EGFP。结果:经测序验证,成功构建了三种不同类型突变体。结论:使用重叠PCR法构建三种不同类型突变体,为进一步研究XLRS1不同类型突变的致病机制奠定了基础。     

EMS处理对小麦种子萌发和幼苗生长的影响

甲基磺酸乙酯(EMS)是一种常用的诱变剂,在作物诱变育种上应用广泛。EMS在诱变种子的同时也是一种非生物胁迫,能显著降低种子的发芽率。该实验以小麦‘扬麦15’种子为实验材料,设置了7个EMS浓度处理梯度(0%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%),每个浓度设置3个处理时间(10 h、12 h、14 h),在种子萌发后测定发芽势和发芽率,并对种子进行生物量测定和形态结构观察,探讨EMS处理对小麦种子萌发和幼苗生长的影响机制。结果表明：(1)随着EMS浓度的提高和处理时间的延长,小麦种子的萌发率逐渐降低;幼苗的生长逐渐变得缓慢,根长和叶长明显变短。(2)随着EMS处理浓度的升高和处理时间的延长,小麦种子胚乳内淀粉体的降解速率变缓。(3)同一处理时间下,EMS的浓度越高,小麦根系越短,根部横截面积、维管束面积以及皮层面积也越小。研究发现,EMS处理会明显降低小麦种子的发芽率,减缓种子贮藏物质的降解速度,抑制小麦根系的生长。     

蝴蝶兰EMS离体化学诱变及再生植株RAPD检测

用EMS对离体培养的蝴蝶兰类原球茎薄切片进行化学诱变,研究了不同浓度、不同时间诱变处理对类原球茎薄切片生长、类原球茎再生及再生苗生长的影响,并对再生苗DNA进行了RAPD检测。结果表明,诱变剂EMS对类原球茎薄切片生长产生重要影响,部分薄切片褐化死亡,再生类原球茎生长受到抑制,再生苗数量减少,表现出明显的伤害作用,这种伤害作用随诱变剂浓度的加大和处理时间的延长而加重。诱变剂EMS使部分再生苗畸变,叶片皱缩、变厚。并产生2株叶形、叶色突变体。部分再生苗表现出RAPD图谱带型的多态性,暗示DNA序列发生了一定的变异。EMS适合诱变剂量为浓度0．4％处理2d～4d。     

快速筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因的方法

阐明拟南芥受精和早期胚胎发生过程对理解被子植物生殖发育有着重要的指导意义,而利用正向遗传学方法研究拟南芥突变体的表型及其分子机理是探究植物基因功能最常用的一种方法。基于常规的插入突变(包括T-DNA和转座子)、化学诱变(如ethylmethane sulfonate,EMS)和高能射线方法构建的突变体库中假阳性突变体多,难以高效筛选到受精和早期胚胎发生相关基因的突变体。为解决这一难题,本研究建立了一种构建T-DNA插入突变体文库的新方法。即在载体p CAMBIA1302的T-DNA元件上增加花粉特异荧光标记基因(p LAT52∷EGFP),并遗传转化具有四分体花粉的Columbia野生型拟南芥突变体qrt1-2;对获得的突变体库可利用花粉荧光快速排除假阳性突变体,并采用反向PCR(inverse-PCR)扩增技术确定突变位点。此方法在筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因突变体上的成功应用表明,其是一种效率高、针对性强、操作相对快捷方便的拟南芥突变体筛选方法。     

甜瓜突变体库的构建及M2群体表型变异的研究

利用8种不同浓度的甲基磺酸乙酯（EMS）,4种不同的浸种时间,处理甜瓜品系“3-2-2”种子,根据M1代植株发芽率,筛选出适宜的诱变剂量为浓度1.2%,诱变时间为24 h。采用这种方法构建了含有67个M1家系及相应自交M2代种子的甜瓜突变体库。对M1代群体541个单株的表型变异进行了全生育期初步调查,总的表型变异频率达71.53%。对M2代群体603个单株的节间长度、主蔓粗度、叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、叶柄粗度共6个表型性状进行形态学调查表明:除节间长度外,其它5个性状和野生型相比均差异显著;不同性状的变异系数不同,叶柄长度的变异系数最大,达15.37%,节间长度的变异系数最小,为7.10%;在M2代中,编号为25的家系叶片出现了黄色和绿色的性状分离。