肌酸激酶同工酶MB的原核表达、纯化及冻干品制备

目的:制备稳定性好、特异性强、灵敏度高的肌酸激酶同工酶质控品。方法:将密码子优化后的肌酸激酶M亚基和B亚基序列合成后构建表达载体PET28-M、PET28a-B;将其分别转入BL21(DE3)后,用0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导表达得到肌酸激酶同工酶MM和BB;MM和BB分别经Ni2+纯化后按一定比例混合处理、完成后期折叠得到MB;研究蛋白MB最佳冻干工艺,并跟踪冻干品稳定性。结果:目的蛋白M亚基和B亚基分子量大小均为45 kD左右,1:1混合25℃静置16 h后具有较高的灵敏度和较强的特异性。蛋白冻干后形态良好,37℃可以稳定保存11d;25℃、4℃可以稳定保存4个月以上。结论:该蛋白的冻干制品成本低、稳定性好、特异性强、灵敏度高,可用于定性定量肌酸激酶同工酶CK-MB检测试剂盒的质控品。     

人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的原核表达、纯化和冻干品的制备

目的：获得重组人心型脂肪酸结合蛋白,分析其活性及制备冻干品。方法：从GenBank中检索人源H-FABP CDs 序列,合成基因后构建原核表达载体pET-28a（+）-H-FABP。将表达载体转入E.coli BL21（DE3）,摸索pET-28a（+）-H-FABP最佳诱导条件,表达并纯化重组蛋白。使用检测试剂检测纯化后的重组H-FABP活性,研究最佳冻干方案并考察冻干品的稳定性。结果：经过优化诱导条件,重组H-FABP在BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达。诱导条件为OD₆₀₀≈0.6,IPTG终浓度0.4mmol/L,30℃诱导4h。通过Ni²⁺亲和层析纯化可得到纯度大于95%的重组H-FABP蛋白。重组H-FABP冻干品可以在37℃稳定保存12d,25℃、4℃稳定保存至少4个月。结论：本项研究中的重组H-FABP表达体系成熟、蛋白活性高,冻干品稳定性好,为后续研究提供了稳定高效的生物原材料。     

人D-二聚体的制备及其冻干性质的分析

以人源纤维蛋白原为原材料制备D-二聚体,将其制成冻干品并分析其冻干性质。使用凝血酶、Factor XIIIa酶解纤维蛋白原,获得交联纤维蛋白。经纤溶酶降解交联纤维蛋白,生成纤维蛋白降解产物。超滤除去纤维蛋白降解产物中的小分子物质,可获得较高纯度的D-二聚体。通过筛选和优化冻干方案,将D-二聚体制备成冻干品。经检测可知,D-二聚体冻干品可在37℃稳定保存12 d;复溶后在25℃稳定保存8 d;复溶后在4℃稳定保存30 d;复溶时,常用复溶溶剂对其复溶后的活性检测无明显影响。     

分枝杆菌噬菌体生物学特性探讨

为了确定不同分枝杆菌噬菌体的宿主菌以及扩增方法和最佳保存方法,观察了七种分枝杆菌噬菌体对结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的裂解情况,并分别于感染后 24、48小时采用离心 过滤、孵育 过滤方法收集噬菌体比较扩增效率,采用不同稳定剂对分枝杆菌噬菌体进行液体和冻干保存,在不同时间段采用琼脂双层法检测其效价。结果显示:①D29分枝杆菌噬菌体能同时较高效地裂解结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌;②感染 48小时后采用孵育 过滤方法收集的噬菌体效价高,方法简单;③液体 4℃保存的噬菌体稳定性好, 70℃液体保存和冻干后 4℃、室温、37℃保存依据不同稳定剂而相差较大。因此,在 48小时后采用孵育 过滤方法收集噬菌体具有高效率特性并且简单易行,噬菌体液体 4℃保存简单、有效,值得推荐。     

甘蔗高粱花叶病毒间接ELISA检测方法的建立和应用

利用人工合成的高粱花叶病毒P3蛋白的多肽片段作为抗原,制备多克隆抗体,利用免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,表明抗体具有高度特异性。通过方阵滴定法确定抗原和抗体的最佳工作浓度,并分别对包被时间、二抗工作浓度、孵育条件、底物显色时间等进行优化,从而建立了高粱花叶病毒(Sr MV)的间接ELISA高通量检测方法。通过测试确定了阴阳性结果判定的临界值,评估了该方法的灵敏度以及与RT-PCR检测法的符合度。所建立的间接ELISA检测方法的抗原、一抗、二抗最佳稀释度分别为1:4、1:600和1:5 000;最佳抗原包被条件为4℃、12 h;抗原抗体最佳孵育条件为37℃、60 min;二抗最佳孵育条件为37℃、45 min;最佳显色条件为37℃、12 min;此检测方法检测速度快、灵敏度高、特异性强,与RT-PCR法的符合度为87.00%。     

汉逊酵母重组表达的人胃蛋白酶原Ⅱ校准品研制

目的：探索一种高效制备人胃蛋白酶原Ⅱ（pepsiongenⅡ,PGⅡ）体外诊断试剂用校准品的方法。方法：以汉逊酵母ATCC26012作为宿主菌,以携带Zeocin及G418双重筛选标记的pRMHP2.1质粒为载体,以遗传密码子优化设计后的PGⅡ序列为目的基因,通过电转化及后续多轮次的传代与稳定,筛选获得高水平分泌表达PGII蛋白的重组菌株26012/PGⅡ。采用Ni柱亲和层析的方法从200L发酵罐大量制备的培养液中纯化出高纯度的重组PGⅡ蛋白,将该蛋白质进行校准定值后配制成6种不同浓度的成套PGⅡ校准品,并对该系列校准品的实时稳定性、加速破坏性及开瓶稳定性展开评价。结果：筛选获得的重组汉逊酵母菌株26012/PGⅡ外源基因整合拷贝数高于40个且整合于染色体的rDNA位置,该菌株以分泌形式表达重组PGⅡ蛋白,表达量超过50mg/L,发酵培养液经Ni柱亲和层析纯化后,重组PGⅡ蛋白纯度达93.8%。通过免疫比浊试剂盒定量检测,该PGⅡ蛋白的活性定值与实际蛋白质量之间的比值达0.85,配制后的PGⅡ校准品在4℃实时保存1年、37℃加速破坏2周及4℃开盖保存2周后,校准品定值的平均下降幅度都不超过10%,其稳定性能不逊色于商品化的校准品。结论：汉逊酵母重组表达的PGⅡ蛋白可用作体外诊断试剂的校准品。     

装载戊型肝炎病毒核酸片段的重组MS2噬菌体衣壳的制备及其特性研究

为制备一种可以实际应用于戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)核酸检测的质控品,即装载戊型肝炎病毒核酸片段的重组MS2噬菌体衣壳(rHEPC)。根据装甲RNA技术原理,设计将MS2噬菌体基因组的5’端部分非编码区、成熟酶蛋白、衣壳蛋白以及部分复制酶起始位点等编码基因与HEV ORF2保守区部分基因序列串联并合成目标基因MS2-HEV。随后将MS2-HEV基因克隆、插入原核表达载体pET-28b中构建pET-28b-MS2/HEV重组质粒,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),经过1mM/L IPTG诱导培养4h后,SDS-PAGE鉴定表达情况;将验证的表达菌体超声破碎、离心、取上清、去除核酸杂质后再经超滤离心纯化、浓缩,电镜分析回收浓缩的rHEPC形态;梯度稀释rHEPC进行稳定性鉴定包括DNase I、RNase A抗性以及保存期三方面的稳定性试验检测。SDS-PAGE分析结果表明重组MS2-HEV基因获得有效表达,重组rHEPC纯度高无杂带;RT-PCR鉴定结果表明设计的HEV保守基因序列成功地被包装到重组rHEPC中。进一步的病毒颗粒稳定性试验结果表明制备的rHEPC能够有效抵抗高浓度的DNase I和RNase A的降解作用,并且在-20℃条件下可以持续保存7个月而无明显降解。上述结果表明制备的rHEPC达到了作为RNA病毒核酸检测阳性质控品的基本要求。     

细胞骨架蛋白4荧光免疫层析检测方法的建立

采用基于免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合的方式,建立一种快速、简单的定量检测肝癌肿瘤标记物的方法。依据双抗体夹心原理,将细胞骨架蛋白4(CKAP4)配对抗体分别作为标记与包被抗体,羊抗兔多抗作为质控线包被抗体,制备CKAP4荧光免疫层析试纸条,并对试纸条的线性、精密性、稳定性等各项性能指标进行评价。结果表明,采用时间分辨荧光微球所制备的CKAP4免疫层析试纸条灵敏度高,特异性好,精密性在15%以内,回收率在85%–115%之间,线性范围为25–1 000 pg/mL,可在37℃稳定保存20 d,与商业化的ELISA试剂盒的相关性良好。结论:初步建立了CKAP4荧光免疫层析方法,能够定量检测血清中CKAP4的含量,且具有快速、灵敏、简便、经济、可单人份操作等优点,有望成为肝癌辅助诊疗的新方法。     

胰岛素原C肽多聚体基因在大肠杆菌中的表达及重组C肽在水溶液中的稳定性

合成了胰岛素原C肽三聚体的基因,并在大肠杆菌中得到高效表达。表达的融合蛋白质通过设计的特异性位点的酶切得到重组的人胰岛素原C肽单体。融合蛋白质以可溶性蛋白质的形式表达,表达量约为80mg／L。Ni—NTA亲和柱可有效地从细胞裂解的上清液中分离纯化融合蛋白质,得到纯度大于70％的融合蛋白质37．5mg／L。融合蛋白质可经胰蛋白酶/羧肽酶B双酶切有效释放天然的C肽。释放的C肽经氨基酸组成分析、与标准对照的RP—HPLC分析和免疫发光法定量证实与天然人C肽完全相同。C肽经RP-HPLC纯化后可得,总的收率为1．5mg/L,纯度大于95％。考察了C肽在冻干过程中及在水溶液中的稳定性。结果表明C肽在冻干过程中稳定,在水溶液中其稳定性受pH和温度的影响。在pH3和pH7．4缓冲液中,37℃或70℃下,C肽的降解符合一级动力学。C肽冻干品直接溶解于pH9的缓冲液中,立即降解,降解产物在37℃和70℃下基本稳定。C肽冻干品直接溶解于pH3的缓冲液中,立即发生降解反应,随后可观察到随温度升高和时间延长,降解反应的进行,37℃、10h,可观察到约80．3％的C肽保持,而在70℃、10h,只有43％C肽保持。C肽在pH7．4最稳定,37℃、6h或10g／L BSA存在下,70℃、3h,未观察到降解产物。PH7．4、37℃、10h,在有和没有10g／L BSA存在的情况下,C肽的保持率分别为99％和96％,从而显示了BSA的保护作用。     

麻疹减毒活疫苗国家参考品长期稳定性评价

目的 评价麻疹减毒活疫苗国家参考品的长期稳定性。方法 对保存于-20℃的冻干麻疹减毒活疫苗国家参考品进行外观、水分含量、病毒滴度检测,并对2011—2021年的麻疹参考品滴度进行趋势分析。对2家企业的使用结果进行分析,与参考品的协作标定结果进行对比。结果 经检测,参考品的外观检查符合规定,参考品中水分含量为1.48%;使用10余年的滴定结果显示,麻疹疫苗国家参考品的滴度在4.70～5.20 lgCCID₅₀/mL之间,均在质控范围内。年度均值在4.95～5.10 lgCCID₅₀/mL之间,年度检测的标准差在0.09～0.15 lgCCID₅₀/mL。趋势分析显示,参考品滴度稳定,以标示值为中心上、下波动,未出现明显下降趋势。2家疫苗企业的检测结果显示出相同趋势。结论 麻疹减毒活疫苗国家参考品具有良好的长期稳定性,能够为国内相应疫苗的质控、签发提供保障。     

委内瑞拉马脑炎病毒重组抗原的制备纯化及其胶体金免疫层析检测方法的建立

目的:表达委内瑞拉马脑炎病毒E2重组蛋白,并结合胶体金免疫层析技术建立一种简便检测委内瑞拉马脑炎病毒特异性抗体的方法。方法:利用已经构建的表达E2抗原的工程菌, 用IPTG诱导, 表达蛋白主要以包涵体的形式存在。通过一系列条件的变性、复性、透析,所制抗原用以包被硝酸纤维素膜,利用胶体金标记和免疫层析技术,建立委内瑞拉马脑炎病毒快速检测方法。对该方法的敏感性、特异性和稳定性作出评价。结果:重组工程菌可表达分子质量为 40 kDa的目的蛋白, 纯化后的蛋白质经SDS-PAGE显示纯度达95%以上。建立的检测方法可在20 min内完成检测。对症状相似及近缘的其他病毒进行检测,均无非特异反应。试纸条在37℃下保存2周,检测结果不变。该方法与R&;D公司商品化的ELISA试剂盒灵敏度检测无明显差异;对92份阴性血清进行检测,两种检测方法的符合率为96.7%。结论:重组委内瑞拉马脑炎病毒蛋白产生的包涵体变性复性后生具有良好的重复性和稳定性, 可作为委内瑞拉马脑炎病毒多种检测方法的抗原原料。胶体金免疫层析法具有快速、灵敏、特异、稳定的特点,适用于现场检测。     

猪嵴病毒结构蛋白VP0与VP1原核表达及间接ELISA方法的建立

分别建立基于猪嵴病毒(PKV)结构蛋白VP0与VP1的间接ELISA检测方法。对PKV结构蛋白VP0与VP1的基因进行合成并连接至原核表达载体pET-32a后,转入感受态细胞BL21中,用IPTG诱导表达的重组蛋白经Ni柱纯化后,分别以重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1作为包被抗原,采用棋盘滴定法建立两种间接ELISA检测方法,并进行重复性、敏感性、特异性实验和临床检测。结果显示重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1抗原的最佳包被浓度分别为2 mg/mL和2.5 mg/mL,反应条件均为37℃、1 h;封闭液最佳条件为5%脱脂乳,37℃、2 h;血清最佳孵育条件为1∶200,37℃、1 h;二抗最佳孵育条件分别为1∶20 000和1∶15 000,37℃、1 h;最佳显色时间为10 min,两种间接ELISA检测方法临界值分别为0.306和0.277。试验结果表明本研究成功建立了能够有效检测PKV血清特异性抗体的间接ELISA方法,且方法具有重复性好、敏感性高、特异性强、稳定性好等特点,对今后PKV的临床诊断及抗体检测试剂盒的开发奠定了重要基础。     

ELISA检测抗-HIV室内质控血清的制备和应用

为了提高抗-HIV的检测质量,进行室内质控以鉴别诊断试剂的质量和控制操作误差,试制了抗-HIV室内质控血清,收集抗-HIV诊断试剂盒中阳性对照血清,采用不同品牌、不同批号的诊断试剂检测后,稀释、分装成低值弱阳性,即为室内质控血清,将质控血清放不同温度下保存,考核其稳定性和精密性,并应用于两厂家各3批试剂的检测,结果试制的室内质控血清在-20℃条件下存放5个月,在4℃条件下存放29天稳定性良好,检测结果稳定,该质控血清适宜作抗-HIV检测室内质控使用。     

高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备

高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)是世界上分布最广的侵染甘蔗的病毒之一,引起甘蔗花叶病,对甘蔗产业危害很大。根据SrMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列合成一对引物,以海南(SrMV-HN)染病植株总RNA为材料,采用RT-PCR方法克隆了长约987 bp的目的片段。将CP基因与质粒pET32a(+)连接,构建了含SrMV CP基因的融合蛋白原核表达载体pET32a-SrMVCP。然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测出一条约36kD的特异融合蛋白表达谱带。融合蛋白主要以可溶性蛋白形式稳定表达。通过优化诱导条件,确立了CP基因表达的最佳条件:IPTG终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为30℃。用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清。通过酶联法(ID-ELISA)测定本试验制备的SrMV CP抗血清工作浓度为1∶1 000,Western blotting检测结果表明,抗血清与SrMV-HN诱导表达的CP蛋白发生特异性反应。对田间25个甘蔗样品进行检测,结果表明该抗血清的效价高、灵敏度高、特异性强,可以应用于田间样品的检测。     

抗绿脓杆菌鸡卵黄色免疫蛋白的冷冻干燥研究

介绍了冷冻干燥技术的原理、抗绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,简称PA)鸡卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk,IgY)的冷冻干燥工艺过程及其参数.通过实验,获得了抗-PA IgY的冻干曲线;经间接血球凝集实验检测,抗-PAIgY的冻干品的活性为1128;在4℃和25℃下,抗-PAIgY的冻干品保存6个月,其活性不变.     

猴免疫缺陷病毒抗体免疫梳检测方法的建立及应用

目的以基因工程技术制备猴免疫缺陷病毒(SIV)的SIV30蛋白作为抗原诊断试剂,建立免疫梳方法(IC)用于特异性检测实验猴血清中抗SIV的抗体Ig G。方法应用原核表达载体p GEX-4T-1构建SIV SIV30基因的重组表达质粒,并在感受态细胞BL21中表达,将该重组蛋白纯化后作为诊断抗原,建立免疫梳标准化检测程序,并应用于临床检测。结果最佳抗原包被量为0.02 mg/m L;制备好的IC均能够特异性检测到相应的SIV阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应,表明该检测方法特异性强;敏感性分析结果表明,SIV30蛋白能够敏感地检测到1∶400倍稀释的SIV阳性血清;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法在对10份可疑猴血清样品进行检测,IC与ELISA检测结果一致率为100.0%,Kappa=1.000。结论原核表达了SIV30蛋白,制备了IC,并应用于临床检测。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

一种高效制备人乳酸脱氢酶LDH_5参考物质的方法及应用

[目的]研究高效、廉价制备人乳酸脱氢酶LDH5参考物质的方法。[方法]选取人乳酸脱氢酶基因(LDHA)CDS序列进行分析及优化,合成优化后的基因,克隆至表达载体pRSF-Duet中构建重组乳酸脱氢酶LDH5表达载体。使用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株对目的基因进行表达,异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导,镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定酶纯度,BCA法分析酶浓度,全自动生化仪分析酶活性、稳定性。[结果]经优化后的LDHA基因的大肠杆菌密码子适应指数为1;纯化蛋白达到电泳纯,比活性达19.01 U/mg,在4℃及25℃可稳定保存8 d。[结论]重组乳酸脱氢酶的表达效率为100 mg/L,酶活性、稳定性、纯度达到临床生化检测的参考物质的条件,可以作为血清乳酸脱氢酶检测的标准物质。     

含组氨酸标签的甲/乙型流感嵌合体假病毒颗粒的构建和表达

为了获得内含甲/乙型流感病毒部分序列的病毒样颗粒,本研究通过定点突变技术将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,建立通用表达载体D-pET32a-CP-his。并采用聚合酶链反应扩增甲/乙流病毒cDNA的部分保守区域,将两种病毒的嵌合体基因序列连接到表达载体,转化BL21细胞。经诱导表达和镍柱亲和层析纯化,获得了含有甲/乙型流感病毒部分序列的高浓度和纯度的病毒样颗粒。该病毒样颗粒在4℃和-20℃条件下可稳定保存。本研究构建带有组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体,可以作为以后构建和制备耐RNase的mRNA标准品和质控品的平台;构建的甲/乙型流感嵌合体假病毒可为实验室流感病毒的检测提供新的标准品及质控品。     

纯化眼镜蛇类毒素的稳定性的研究

已有一些科学工作者对眼镜蛇毒类毒素的纯化、失活和免疫进行了广泛的研究(Sawai等,1973;Fukuyama,1974;Fukuyama和Sawai,1974)。还有报道说,眼镜蛇毒类毒素,在37℃条件下保存20天后,给鼠腹腔注射,能致死;而保存在4℃或保存在37℃冻干的类毒素则无毒性(Fukuyama和Sawai,1975;Sawai和Fukuyama,1978)。本文是有关台湾眼镜蛇毒类毒素的纯化、稳定性及其免疫原性的研究。     

重组人尿激酶原冻干产品的稳定性

目的：探讨重组人尿激酶原（rhPro-UK）冻干产品的稳定性。方法：采用S-2444发色底物法测定贮存在4℃和-20℃的rhPro-UK冻干产品的活性、单链比例随时间的变化规律;用SDS-PAGE及RP-HPLC肽图分析贮存在-20℃的rhPro-UK冻干产品的结构与组成的变化。结果：4℃保存3年后的rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例基本没有变化,但随着贮存时间的延长,有部分产品降解,如贮存78个月的样品,总活性可降低13％～15％;-20℃保存78个月后,rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例未见明显变化。SDS-PAGE及RP-HPLC肽图图谱显示,-20℃贮存78个月后的rhPro-UK冻干产品的组成和结构没有变化。结论：rhPro-UK冻干产品在4℃的贮存寿命可达3年;长期贮存于-20℃的rhPro-UK冻干产品,其总活性、单链比例及结构组成非常稳定。