非复制型痘苗病毒的生物学性状研究进展

痘病毒被广泛用于针对多种感染性疾病和癌症的疫苗研究,而非复制型痘苗病毒的发展又进一步提高了其安全性。来源于中国天花疫苗株的复制缺陷型痘苗病毒天坛株(NTV)正是一株非复制型痘苗病毒。为了促进未来NTV作为疫苗候选株在临床中的应用,我们对NTV与另外2株非复制型痘苗病毒,即改良痘苗病毒安卡拉株(MVA)和NYVAC的生物学性状做简要综述,主要讨论了它们的基因组结构、体外生长特性、病毒复制和形态发生、组织中的病毒分布和病毒-宿主细胞间的相互作用。     

表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒的初步应用

目的:制备表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒,并初步探讨其应用。方法:构建制备表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒RVJ11LacZ-I1LGFP;分别利用药物昔多福韦与抗痘苗病毒高效价免疫血清,建立基于该病毒的荧光生成抑制实验及荧光减数中和实验。结果:荧光生成抑制实验与传统的噬斑生成抑制实验相比,结果一致,但判读更直接快速;重组痘苗病毒RVJ11LacZ-I1LGFP亦可用于体外快速高通量评价正痘病毒疫苗的中和能力。结论:利用表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒建立了直接简便快速高通量的抗痘病毒药物筛选及体外中和评价技术。     

痘病毒载体构建及其在病毒疫苗研制上的应用

概述了痘苗病毒载体和禽痘病毒载体的构建及其在动物病毒疫苗与医学病毒疫苗研制上应用的进展,进而分析了痘病毒载体疫苗尤其是禽痘病毒载体疫苗的发展趋势。     

正痘病毒基因结构及功能研究的几项进展

正痘病毒载体在重组疫苗研究中有广泛前景,但其罕见但较为严重的副反应阻碍了发展。正痘病毒属中具有较宽宿主范围的痘苗病毒和牛痘病毒具有典型的宿主范围基因K1L、CP77和C7L。这三个基因对不同宿主细胞具有选择性,可以扰乱宿主细胞信号通路,并且与病毒的毒力相关。     

溶瘤痘苗病毒的研究进展

溶瘤病毒可靶向性杀伤肿瘤细胞而不对正常细胞产生杀伤作用。近几年已开发出十余种溶瘤病毒。痘苗病毒曾在全球消灭天花行动中被广泛使用,并且有着复制速度快、免疫原性强、副作用明确等优点。痘苗病毒经过基因改造,可以选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解细胞。目前,用于溶瘤痘苗病毒改造的主要有痘苗病毒Western Re verse株、Wyeth株、Lister株和Copenhagen株,我国使用的痘苗病毒天坛株尚未有相关报道。     

红斑性肢痛症相关痘病毒血清免疫学特征的研究

本文从四个方面综合报道了红斑性肢痛症相关痘病毒(ERPV)血清免疫学特征的研究结果。血清学鉴定表明,ERPV为正痘病毒属内成员,但与正痘病毒属内成员痘苗病毒和鼠痘病毒具有中和抗原表位差异。流行性红斑性肢痛症患者血清中含有抗ERPV的中和抗体和抗ERPVA型包涵体IgG抗体,其检出率明显高于当地未发病者和美国人群的检出率。     

痘苗病毒天坛株基因组旁侧区结构及开放读码框架的分析

本分析了我国痘苗病毒天坛株基因组两端的ＨｉｎｄⅢ－Ｃ和－Ｂ片段所编码的多肽,并与其他痘苗病毒株和正痘病毒进行了比较。结果表明,天坛株基因组ＨｉｎｄⅢ－Ｃ和－Ｂ片段共有４６个主要的开放读码框架（ＯＲＦｓ）,其中一个ＯＲＦ属于痘苗病毒基因组中第一次的与天花病毒相似的基因编码区。此外,天坛株基因组丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅱ的编码区由于移码变异而分成两个不同ＯＲＦｓ。民其他痘苗病毒株相比,天坛株基因组有多个Ｏ     

蚀斑减少中和试验检测抗天花免疫球蛋白效价

为了建立测定抗天花免疫球蛋白效价的检测方法,采用抗天花免疫球蛋白50%中和100PFU痘苗病毒的稀释度来确定其效价。通过与NIBSC提供的抗天花人免疫球蛋白标准品进行的对比试验,结果显示基本一致,证明该方法是可行的。     

痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析

通过我国痘苗病毒天坛株(疫苗株)全基因组核苷酸序列的测定,对痘苗病毒基因组的一级结构进行了详细的分析,发现天坛株全基因组由189274个碱基对和碱基组成,与其它痘苗病毒株相比,在病毒基因组旁侧区限制性内切酶Hind Ⅲ-C,B及中央区Hind Ⅲ-A片段出现多个DNA片段的缺失和新的DNA片段的插入,这些片段中编码的某些多肽目前已知与病毒的生物学性状有关,对阐明痘苗病毒疫苗株与非疫苗株毒力上的差别及正痘病毒属成员的致病机理等方面的研究提供了线索.除此之外,有关病毒启动子、开放读码框架的分布特点、G+C含量及密码子使用频率等基因组结构特点的分析,也为研究基因表达的调控机制和利用该病毒作为载体进行基因工程重组疫苗的开发奠定了基础.     

产业动态

我国具有自主知识产权的艾滋病疫苗开始Ⅰ期临床试验由中国疾病预防控制中心与北京生物制品研究所联合研制、具有自主知识产权的DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗近日在北京开始进行Ⅰ期临床试验。该疫苗包括DNA疫苗及复制型重组痘苗病毒疫苗两个组分,疫苗的免疫原选自我国流行最广的HIV毒株CRF-07,包括gag,pol,env和nef四个基因。疫苗的载体选用天坛株痘苗病毒,是因为该痘苗病毒曾广泛应用于我国的天花疫苗,安全性已得到了数亿人群应用的充分验证。此次进行临床试验的是复制型痘苗病毒载体,属于活疫苗,能在动物上引起很强的免疫反应。动…     

HIV—1长末端重复序列对重组痘苗病毒表达Gag蛋白的影响

将系列缺失的ＨＩＶ１长末端重复序列（ＬＴＲ）和全长的ｇａｇＯＲＦ置于痘苗病毒载体中,经同源重组和血球吸附试验,成功地构建了６株重组痘苗病毒。免疫印迹和免疫酶试验检测均表明,６株重组病毒的Ｇａｇ蛋白表达量因ＬＴＲ不同而有明显差异,表明ＨＩＶ１的ＬＴＲ及其下游基因置于痘病毒启动子控制下,在痘苗病毒中表达时有下述特点：（１）不同的痘苗病毒启动子与全长ＬＴＲ相互作用,对ｇａｇ基因表达有显著不同的调控效果;（２）ＮＲ序列对Ｇａｇ蛋白表达没有明显影响;（３）ＥＮ序列不能被重组痘苗病毒表达系统识别;（４）ＴＡＲ序列可提高Ｇａｇ蛋白的表达量;（５）Ｕ５区及下游非翻译序列不影响Ｇａｇ蛋白的表达。     

减毒痘病毒表达载体的研究进展

随着基因工程技术的发展,人们对痘病毒能在真核胞浆中表达多种外源基因的有效载体作了进一步研究。为了能成为高效安全的疫苗,必须降低痘病毒载体本身的毒力。本文以痘苗病毒为主,从减毒的途径与免疫效果和非复制性载体的研究几个方面综述近几年痘病毒减毒的研究进展。     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡痘病毒的构建

[目的]旨在构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组鸡痘病毒。[方法]使用overlap PCR进行表达载体质粒的构建,使用菌液PCR和测序技术进行了鉴定;使用鸡胚成纤维细胞作为重组鸡痘病毒同源重组的介质,尝试了可能影响重组鸡痘病毒构建的不同条件;最后使用PCR和Western Blot方法对重组病毒进行了鉴定。[结果]将人工合成的痘苗病毒早晚期启动子SP与绿色荧光蛋白基因一同插入到鸡痘病毒载体质粒的多克隆位点,挑取LA平板上的重组子,菌液PCR及测序验证鉴定结果为阳性;利用重组质粒转染被野生鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞制备重组病毒,利用倒置荧光显微镜观察到含有重组病毒的在激发光下呈绿色的细胞;改进重组质粒转染的条件以达到更好的重组病毒包装成效,研究得出被野生痘病毒感染的细胞进行重组质粒传染制备重组病毒的效率是用野生痘病毒感染已转染重组质粒的细胞的6倍,且感染用野生病毒滴度高时重组病毒的制备效果更好;最后,用PCR方法和Western Blot方法对重组病毒进行鉴定,鉴定结果为阳性。[结论]成功构建了表达GFP的重组鸡痘病毒。     

人癌胚抗原-重组痘苗病毒的构建和制备

痘苗病毒的基因组庞大,结构复杂而特殊,不可能将外源基因直接插入它的基因组,必须利用一种特殊的痘苗病毒质粒,才能构建成功重组痘苗病毒．在分析了痘苗病毒质粒ｐＪ１２０〔含有我国天花疫苗－痘苗病毒天坛株７６１的启动子和胸苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ,简称ＴＫ基因）,及含有人癌胚抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ,简称ＣＥＡ）ｃＤＮＡ全序列的质粒ｐ９１０２３Ｂ－ｃｅａ－１７结构的基础上,设计出三步法构建了重组疫苗病毒质粒ｐＪ－ＣＥＡ．经酶切及ＰＣＲ鉴定ｐＪ－ＣＥＡ中ＣＥＡｃＤ－ＮＡ的存在,进一步用同源重组方法构建了表达人ＣＥＡ的重组痘苗病毒,并以人体成纤维细胞作为宿主细胞,对ＣＥＡ－重组痘苗病毒进行了大量培养．再次证实痘苗病毒是良好的真核表达载体,可以高效而准确地表达细胞膜糖蛋白ＣＥＡ．     

含口蹄疫病毒01K亚型VP1基因的重组痘苗病毒的构建及表达

本文报道了将欧洲流行的口蹄疫病毒O1-K亚型的主要表面抗原VP,克隆插入痘苗病毒的TK基因中,并在动物细胞中表达。所用痘苗病毒载体为我国长期用于防治天花的痘苗病毒效果安全的天坛株,所用O1K亚型VPl克隆为Hofschneider,P．H．教授惠赠的pFMDV-1034。首先将pFMDv一1034中的VP1基因片段插入中间质粒pBCB06的BamHI／Hind I位点,该质粒含痘苗病毒WR株的P7.5;启动子和多克隆位点,其两侧序列为TK基因(由D．Boyle博士赠)。或插八pBcB08的Hind I位点,该质粒与pBcB06。之区别仅在于启动子为PL11、多克隆位点种类不同。将杂合的中间质粒转化已由天坛株痘苗病毒TK⁺侵染过的143BTK-细胞,通过体内同源重组而获得有VP,基因插八的重组痘苗病毒。在BUDR存在时不能侵染143BTK-细胞的病毒可视为TK-表型病毒即含VP1基因的痘苗重组病毒,再经pFMDV—1034BamHI-Hind I片段为探针进行杂交确证。其中所得两株重组痘苗病毒V．V10344H、V．V103408在143B TK^-细胞中繁殖并用ELIsA方法测表达,其P／N值最高分别为9．50和8．21。     

CRISPR/Cas9切割痘病毒DNA抑制病毒复制

当前,CRISPR/Cas9系统靶向痘苗病毒的相关研究鲜有报道。该文采用了CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术,以痘病毒为研究对象。在重组痘病毒WR-EGFP中针对EGFP基因序列设计不同靶点g RNAs,转染Cas9/g RNA质粒,同时感染WR-EGFP痘病毒,随后观察EGFP荧光表达、提取病毒基因组,通过PCR进行切口鉴定并运用错配酶切法验证CRISPR/Cas9对痘病毒靶点DNA切割的切口修复情况。与单独感染WR-EGFP组相比,转染了Cas9/g RNA174和Cas9/g RNA175质粒的EGFP荧光强度明显降低,表明CRISPR/Cas9抑制WR-EGFP病毒中EGFP基因的表达。相对定量PCR及错配酶切实验结果显示,CRISPR/Cas9切割靶点导致WR-EGFP病毒基因组产生了切口,并且存在DNA错配修复现象。最后,通过结晶紫染色法测定痘病毒的滴度,结果显示,经CRISPR/Cas9处理组的痘病毒滴度显著下降,即CRISPR/Cas9能够使痘病毒的复制能力显著地降低。综上所述,CRISPR/Cas9切割痘病毒基因组DNA并且抑制痘病毒复制。     

正痘病毒的生态学与重组牛痘病毒的使用

<正> 正痘病毒系遗传学和抗原性上与天花病毒相关的痘病毒。近年对正痘病毒的研究有二方面的进展。其一是对正痘病毒生态学和致病机理的认识,特别是鉴定病毒的贮存宿主范围和指示宿主。由于病毒间存在广泛的抗原交叉,阻碍了可能贮存宿主的血清学调查;其二是通过对插入能编码人和动物病原体免疫原的基因至牛痘病毒的基因组,以发     

非复制性重组金丝雀痘病毒活载体疫苗人体初免试验取得良好效果

自从表达狂犬病毒糖蛋白的非复制性金丝雀痘病毒和复制性痘苗病毒重组活载体疫苗接种哺乳动物(小鼠、狗或猫)取得同等水平免疫保护效力的试验结果去年公诸于世后,相继又有报道研制成功表达麻疹病毒糖蛋白和日本脑炎、黄热、登革等病毒的包膜、膜和非结构蛋白的非复制性重组金丝雀痘病毒活载体疫苗,并在动物实验中取得类似免疫保护效果。尽管有关机制目前尚不清楚,但与传统观点——病毒抗     

天花已消灭,但不可遗忘

天花象征着两方面：①人类最可怕的疾病之一；②人类与传染病斗争的顶点。天花于史前即已出现，传播全球，导致千百万人失明或死亡。天花病毒系正痘病毒中的一种，可感染人，引起急性传染病，平均病死率达３０％。人系唯一的宿主，生存者终身免疫。在Ｊｅｎｎｅｒ接种牛痘病毒获安全有效的免疫前，曾采用人痘接种。世界卫生组织广泛动员向在 展开歼灭战，终于在１９７９年宣告全世界已消灭天花。储存的天花毒株拟于１９９９年全部销     

按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1 gag基因提高表达水平的研究

为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1 gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1 gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究。结果显示：①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7．5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Western blot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17％。上述结果表明：按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素。