一株海藻糖合成酶产生菌的鉴定及产酶条件优化

目的对一株海洋来源的产海藻糖合成酶菌株进行鉴定及产酶条件的初步优化。方法通过16SrDNA基因序列的同源性分析,对一株来源于东海海水的海藻糖合成酶产生菌进行鉴定,并通过单因素分析初步研究其培养特性和最佳的发酵条件。结果该菌16SrDNA序列与GenBank中已知序列相比,最高相似度为100％,鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）,命名为Pseudomonassp．A50。其最佳碳源和氮源分别为2％麦芽糖和0．5％酵母膏,最佳NaCl浓度为2．5％,在初始pH7．8,接种量1％,装液量125mL／250mL,28℃,130r／min发酵48h,海藻糖合成酶活力达到最高。结论此产海藻糖合成酶菌株为假单胞菌属,优化后,海藻糖合成酶活力达到14．16U／mL。     

恶臭假单胞菌S1产胞内海藻糖合成酶发酵培养基的优化

采用摇瓶发酵法研究了不同碳源、氮源对恶臭假单胞菌S1干重和胞内海藻糖合成酶酶活力的影响。通过正交试验得出其最佳培养基配方为(g.L-1):葡萄糖25,玉米浆15,麦芽糖20,豆粕水解液10 mL.L-1,Na3C6H5O7.2 H2O 0.5,Na2HPO4.12 H2O 0.5。优化后菌体密度、单位细胞产酶活力分别提高了1.44倍和72.16%。     

Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

利用PCR和TA克隆方法扩增和克隆得到了恶臭假单胞菌Pseudomonas putida S1的海藻糖合成酶基因treS.对其进行序列分析表明,其编码区含有2067bp,编码含688个氨基酸残基的蛋白质,其核苷酸序列和蛋白质序列与来源于其它假单胞菌属细菌的海藻糖合成酶的序列表现出了较高同源性.将该基因序列与表达载体pQE30T连接,构建重组质粒pQE30T-TS,并将其转化至E.coli M15菌株中.重组菌株经诱导表达后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有明显的分子量约77.5kD的特异蛋白条带出现.经测定酶活力达19U/mL,约是原始菌株P.putida S1的50倍.     

热激对恶臭假单胞菌S1胞内海藻糖合成酶的影响

研究了热激对恶臭假单胞菌S1胞内海藻糖合成酶的影响。通过正交试验确定了热激的最佳条件:热激在产酶初期(培养20 h)进行,热激时培养温度由20℃升高至30℃,处理时间30 min。在此条件下,海藻糖合成酶的酶活提高了76%。同时在热激后菌体的耐盐性也有较大增强。     

一株精氨酸脱亚胺酶产生菌的筛选及鉴定

精氨酸脱亚胺酶由于具有成为精氨酸营养缺陷型肿瘤如肝细胞瘤,黑素瘤治疗药物的潜力而被国内外多个科研机构进行研究。本文报道本研究室于无锡锡惠公园土样中筛选得到一株产精氨酸脱亚胺酶的菌株901,并对其进行了形态,生理生化特征分析及16S rRNA基因分析,该菌被鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。     

谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段,在GenBank数据库进行氨基酸的同源性检索分析,发现来自谷氨酸棒杆茵(Corynebacterium glutamicum)一功能未确定的ORF序列被注释为假设的海藻糖酶(putative trehalose sesynthase),它与已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有60％以上的同源性。本研究把这段ORF克隆到大肠杆茵进行表达及进行功能鉴定。实验表明这段ORF序列为一新的海藻糖合成酶基因,其表达产物能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子。重组酶性质的初步研究表明重组酶在pH7．0～7．5,30℃转化麦芽糖效率最高。     

一株杀蛆细菌的分离与鉴定

蝇属昆虫纲,双翅目,能传播霍乱、伤寒、结核及痢疾等多种疾病的病原菌,种类较多,生长很快,分布广泛,危害严重。化学药剂灭蝇,不仅杀虫效果差,而且环境污染严重。生物防治蝇蛆,不仅能避免污染,而且可在蝇蛆中间不断传染,药效较长。但是,目前在国内外尚未见到有这方面的研究报告,仅见到刘世贵等利用类产碱假单胞菌防治草地蝗虫的报道。     

蛋壳内膜分解菌的筛选、鉴定及其所产蛋白酶性质的初步研究

从土壤中分离筛选到具有分解利用蛋壳内膜能力的菌株Pes207,通过生理生化鉴定及16S rRNA序列分析,确定其为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。通过分离纯化及初步酶学性质研究发现,该菌株所产胞外蛋白酶分子量约为32 ku,最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,Km值为2.89 mmol/L。Pes207具有很强的分解液化蛋壳内膜的能力,其所产蛋白酶在pH 5.5～9.0、温度30～70℃之间具有良好的分解活性,具有较好的应用前景。     

耐放射异常球菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段,在GenBank中进行氨基酸序列的同源性比较分析,检索到来自于耐放射异常球菌（Deinococcus radiodurans）基因组序列中一功能未确定的开放阅读框（ORF）,其氨基酸序列和已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有约60％的同源性.将这段ORF克隆到大肠杆菌进行表达,并进行功能鉴定.实验表明这段ORF序列所编码的是一种海藻糖合成酶,它能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子,以30％的麦芽糖为底物时能将约65％的麦芽糖转化成海藻糖.重组酶性质初步研究表明,在pH 7.0,最佳温度30℃转化麦芽糖效率最高.     

一株花生根际铁载体产生菌的分离鉴定及耐药性分析

目的：从花生根际筛选铁载体产生能力较强的菌株,对其进行鉴定及耐药性分析。方法：用梯度稀释法从花生根际中分离出细菌,在刃天青（CAS）检测平板上依显色圈的大小从中筛选出一株铁载体产生能力较强的菌,并对其进行生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,用抗生素梯度平板检测其对9种常见抗生素的抗性。结果：筛选出一株产铁载体的菌株D15,13项生理生化指标除甲基红试验呈阳性外,其他均与恶臭假单胞菌相同;其16S rDNA与恶臭假单胞菌的同源性为100%;该菌对氨苄青霉素、氯霉素、利福平、红霉素、新霉素、链霉素、四环素都有不同程度的的抗性,对卡那霉素和庆大霉素表现较强的敏感性。结论：获得铁载体产生菌D15,经鉴定为恶臭假单胞菌,该菌耐药性符合用转座子诱变法研究铁载体合成的相关基因的条件。     

嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7中麦芽寡糖基海藻糖合酶的酶学性质

【目的】克隆表达嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7中的ST0929基因,并测定其酶活性。【方法】根据ST0929基因设计引物进行PCR扩增,将这段基因克隆到p ET-15b质粒上,重组质粒导入大肠杆菌BL21细胞中表达。亲和层析纯化酶蛋白,并测定其酶活性。【结果】SDS-PAGE分析表明其分子量大约为83 k D。酶学性质研究表明该酶的最适温度为75°C,最适p H为5.0,具有很强的热稳定性和p H稳定性。该酶还能对多种金属离子和有机溶剂具有一定的耐受性。底物特异性研究发现该酶能够利用麦芽糊精作底物,而不能利用壳寡糖、麦芽糖等。【结论】通过以上酶学性质的研究,说明这种来源于超嗜热古菌的麦芽寡糖基海藻糖合酶在工业生产海藻糖领域具有一定的应用前景。     

天蓝色链霉菌海藻糖合酶的异源表达、活性分析及重组菌全细胞转化合成海藻糖的条件优化

从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因 (ScTreS),在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中进行了异源表达,通过 Ni-NTA 亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经 SDS-PAGE 测定其分子量约为62.3 kDa。研究其酶学性质发现该酶最适温度35 ℃;最适pH 7.0,对酸性条件比较敏感。通过同源建模和序列比对分析,对该基因进行定点突变。突变酶K246A比酶活比野生酶提高了1.43倍,突变酶A165T相对提高了1.39倍,海藻糖转化率分别提高了14%和10%。利用突变体重组菌K246A进行全细胞转化优化海藻糖的合成条件并放大进行5 L罐发酵,结果表明：在麦芽糖浓度300 g/L、初始反应温度和pH分别为35 ℃和7.0的条件下,转化率最高达到71.3%,产量为213.93 g/L;当底物浓度增加到700 g/L时,海藻糖产量仍可达到465.98 g/L。     

Characterization of the maltooligosyl trehalose synthase from the thermophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius

We report the molecular characterization and the detailed study of the recombinant maltooligosyl trehalose synthase mechanism from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. The mts gene encoding a maltooligosyl trehalose synthase was overexpressed in Escherichia coli using the T7-expression system. The purified recombinant enzyme exhibited optimum activity at 75 degrees C and pH 5 with citrate-phosphate buffer and retained 60% of residual activity after 72 h of incubation at 80 degrees C. The recombinant enzyme was active on maltooligosaccharides such as maltotriose, maltotetraose, maltopentaose and maltoheptaose. Investigation of the enzyme action on maltooligosaccharides has brought much insight into the reaction mechanism. Results obtained from thin-layer chromatography suggested a possible mechanism of action for maltooligosyl trehalose synthase: the enzyme, after converting the alpha-1,4-glucosidic linkage to an alpha-1,1-glucosidic linkage at the reducing end of maltooligosaccharide glc(n) is able to release glucose and maltooligosaccharide glc(n-1) residues. And then, the intramolecular transglycosylation and the hydrolytic reaction continue, with the maltooligosaccharide glc(n-1) until the initial maltooligosaccharide is reduced to maltose. An hypothetical mechanism of maltooligosyl trehalose synthase acting on maltooligosaccharide is proposed.     

一株抗万古霉素耐药菌的抗生素产生菌AR1148的鉴定

从土壤中分离得到一株放线菌AR1148,其代谢产物对万古霉素耐药肠球菌有较明显的抑菌活性。该菌株的基内菌丝无横隔,气生菌丝丰茂,分枝较好,孢子椭圆形,表面光滑。菌丝细胞壁工型,含有L-2,6-二氨基庚二酸（LL-DAP）和甘氨酸。菌株AR1148归属于链霉菌属金色类群。根据16SrDNA序列分析,该菌株与现有种差异明显,聚类在不同的分支。定名为Streptomyces sp．AR1148。     

一株产纤维素酶细菌X10-1-2的鉴定

从土壤中筛选出来一株产纤维素酶的细菌,编号X10-1-2.该菌株为革兰氏阳性杆菌,可生成芽孢,好氧.最高生长温度为35～45℃,最低生长温度为10～20℃.在实验室根据其个体形态、菌落形态、生理生化特征作为分类依据,鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).     

改造大肠杆菌合成海藻糖途径以高效合成海藻糖

海藻糖是相容性溶质的一种,因其具有多种生物学功能,在食品、化妆品、药品以及器官移植等方面均有很广泛应用。然而近几年生产海藻糖主要集中在使用酶催化的方法,虽然这种方法的转化效率高,但是却存在着副产物的问题,难以得到高纯度的海藻糖产品,严重制约了海藻糖的应用。本文通过基因工程技术在大肠杆菌Escherichia coli中构建了海藻糖高效合成新途径,通过全细胞催化合成海藻糖。利用PCR技术在哈氏噬纤维菌Cytophaga hutchinsonii中克隆获得海藻糖双功能合成酶基因(tpsp),采用E.coli pTac-HisA高效表达载体,实现海藻糖双功能合成酶基因(tpsp)高效表达,利用高效表达菌株进行全细胞催化,将葡萄糖高效转化为海藻糖。结果表明C.hutchinsonii海藻糖合成酶基因(tpsp)在E.coli中成功实现表达,该酶能够在胞内将葡萄糖高效转化为海藻糖,并将其转运到胞外,实现海藻糖的高效率合成,海藻糖的产量提高到1.2 g/L,相对转化率为21%。当将此高产菌株在发酵罐中进行转化时,海藻糖的产量达到13.3 g/L,葡萄糖的相对转化率达到48.6%。采用C.hutchinsonii海藻糖合成酶基因高效表达并且应用于海藻糖全细胞合成催化在国内外尚属首次报道,海藻糖的转化率及产率都已达到文献报道最高水平,本研究为开拓海藻糖生产新技术奠定了基础。     

Cloning, expression and identification of a new trehalose synthase gene from Thermobifida fusca genome

Trehalose is a disaccharide with two glucose mole-cules linked in an α,α-1,1-glycosidic linkage. The onlyreducing group in each of its glucose molecules has beenused up for the formation of α,α-1,1-glycosidic linkage,therefore trehalose is a nonreducing disaccharide withhigh stability against the disruption caused by such factorsas temperature and extreme pH of environment [1]. Ithas been well established that many organisms will copewith external stress conditions by increasing the levelo…