枸杞L-半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析

以青海枸杞(Lycium barbarum L.)为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆枸杞L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)基因序列,命名为LbGLDH。LbGLDH基因全长为2 114bp,包含一个开放读码框1 767bp(编码588个氨基酸)、5′末端序列57bp、3′末端序列290bp。LbGLDH基因核苷酸序列与番茄、马铃薯、烟草GLDH基因具有88%~90%的一致性。LbGLDH编码氨基酸序列包含GLDH蛋白酶具备的FAD-binding-4和ALO结构域。qRT-PCR分析结果显示,在枸杞不同组织中LbGLDH基因的表达、抗坏血酸含量和GLDH活性变化趋势相同,表现为在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少。推测LbGLDH基因表达促进枸杞果实中抗环血酸含量的积累。     

保加利亚乳杆菌ATCC11842 L-乳酸脱氢酶同工酶基因的克隆与表达分析

通过对保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)同工酶基因的异源表达、酶活测定和摇瓶发酵研究L-LDH在乳酸合成中的作用。将保加利亚乳杆菌ATCC11842中L-乳酸脱氢酶基因ldb0120和ldb0094分别克隆至载体pET28a(+)中,构建重组表达载体pET28aldb0120和pET28aldb0094,并转化到大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行表达。进一步对重组蛋白进行Ni-NTA柱亲和层析和酶学活性测定,结果显示,LDB0120和LDB0094的比活力分别为0和25 U/mg,表明LDB0094是具有低活性的L-乳酸脱氢酶,而LDB0120不具有活性。对两株重组菌分别进行好氧和微好氧发酵,重组菌E.coli BL21/pET28aldb0094在好氧和微好氧条件可以合成L-乳酸,浓度分别为41.9和227.9 mg/L,而菌株E.coli BL21/pET28aldb0120在两种培养条件下均基本不合...     

黄色短杆菌GDK-9谷氨酸脱氢酶基因的克隆、序列分析及表达

利用PCR技术从黄色短杆菌GDK-9的基因组DNA中扩增出谷氨酸脱氢酶基因(gdh)片段(EC.1.4.1.4), 连到pUCm-T载体上测序。核酸序列分析结果表明, 该片段全长1927 bp, 包含一个ORF, 推测此ORF区编码一条448个氨基酸的多肽, 分子量约为48 kD。与已报道的gdh序列相似性为99.55%, 其中1190位碱基(C→A)突变导致了编码氨基酸的变化(Thr→Asn), 其它的碱基变化不影响编码的氨基酸。将gdh基因克隆入穿梭质粒pXMJ19中, 并转化E. coli XL-Blue和Brevibacterium flavum GDK-9, 经IPTG诱导后, SDS-PAGE电泳结果显示, 在预计位置出现明显的诱导蛋白条带, 分子量约为48.7 kD。谷氨酸发酵实验表明, 尽管谷氨酸脱氢酶GDH能明显提高胞内的谷氨酸含量, 但其不影响谷氨酸的分泌。     

猕猴桃的组织培养和遗传转化研究进展

综述了国内外猕猴桃组织培养和遗传转化研究进展,内容包括花药培养、胚培养、胚乳培养、子叶、叶、茎段等器官培养、原生质体培养以及遗传转化等,并对生物技术在猕猴桃研究中存在的问题以及今后在猕猴桃中的应用前景进行了讨论。     

草莓ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近。原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达。用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花红果粉红果白果青果叶。     

草莓ξ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ξ-胡萝卜素脱氧酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸.序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性.系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近.原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达.用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草每的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞叶.     

荧光假单胞菌香兰素脱氢酶基因的克隆及表达

对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens ATCC13525)香兰素脱氢酶基因vdh进行了克隆、序列分析以及表达。PCR扩增获得了长度为1 449 bp的核苷酸序列,该序列编码含438个氨基酸,分子量约为50 ku的多肽。序列分析表明该基因与GenBank提供的部分已知vdh基因具有高度的同源性。该基因在大肠杆菌DH5α中能高效表达,而在野生型P.fluorescens ATCC13525中本身并不表达出功能。Vdh基因表达产物香兰素脱氢酶(Vdh)在细胞中主要以可溶性蛋白的形式存在。同时研究表明诱导剂IPTG对vdh基因在大肠杆菌中的表达并不起作用。     

红阳猕猴桃遗传转化体系的建立

以红阳猕猴桃叶片和茎段为实验材料,通过优化培养基,建立了一个高效的红阳猕猴桃遗传转化体系,利用农杆菌介导转化法把猕猴桃ACO基因(ACC oxidase gene)的反义链导入红阳猕猴桃,共获得47株潮霉素抗性植株.随机挑选其中14株进行PCR鉴定,其中9株成功扩增到了目的条带,初步统计阳性植株为64.3%左右.此研究为利用分子遗传基因工程手段培育优质延熟保鲜的转基因猕猴桃新品种打下了基础.     

L-山梨糖脱氢酶的纯化及性质的研究

从５Ｌ罐发酵Ｌ－山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ＳＣＢ３２９和Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＳＣＢ９３３混合菌株中差速离心收集ＳＣＢ３２９菌体,破碎,离心获得无细胞抽提液,硫酸铵分级沉淀蛋白后依次经ＤＥＡＥＣｅｌｌｕｌｏｓｅ ５２和Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ柱层析分离得到了Ｌ－山梨糖脱氢酶（ＳＤＨ）,它能将Ｌ－山梨糖脱氢氧化为Ｌ－山梨酮,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳测得分子量约为６０ＫＤ。动力学性研究表明它为一个典型的Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ氏酶,对Ｌ－山     

L-乳酸脱氢酶热变性的热力学研究

用差示扫描量热法对L-乳酸脱氢酶的热变性进行了研究(温度扫描范围为290—390K,酶蛋白溶液浓度为0.28—0.72mg蛋白/mg溶液)。实验观察到当酶溶液浓度在0.62—0.72mg蛋白/mg溶液范围内有一个吸热转变,酶溶液浓度小于0.62mg蛋白/mg溶液时有两个未完全分开的吸热转变。 这个酶的量热焓与范德霍夫焓的比远大于1,而接近于2,这表明乳酸脱氢酶的变性过程不是一个简单的两态转变,从热力学和吸热峰的形状、大小分析,可以推断乳酸脱氢酶分子是由两个以弱相互作用相连结的合作结构区组成,而每一个结构区是由两个相互作用很强的亚基组成。也就是说乳酸脱氨酶的变性过程包括两个半独立的合作结构区的转变,每一个结构区的转变都近似一个两态转变,ΔHeal与ΔHvh的比值是随着两个半独立部分相互作用的增强,即蛋白浓度的增加而减小。随着蛋白浓度的减小,蛋白质周围水分子增多,酶分子中两个半独立部分的相对独立性增强,这可由热谱图上一个吸热转变变成两个半独立的转变得到证实。     

茶树醇脱氢酶基因的表达特征及番茄遗传转化分析

根据茶树醇脱氢酶基因(CsiADH1)的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种‘龙井43’中克隆了CsiADH1序列,分析了CsiADH1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况并转化番茄。结果表明:CsiADH1包含一个1 044bp的最大开放阅读框,编码347个氨基酸。qRT-PCR分析显示,CsiADH1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤、茉莉酸和水杨酸的诱导;将CsiADH1基因ORF区域克隆进pCAMBIA1301载体中,构建了由CaMV35S启动子驱动的CsiADH1基因植物表达载体pCAMBIA-ADH,并以农杆菌介导的方法侵染番茄‘中蔬四号’子叶,经PCR鉴定,获得了8个转CsiADH1基因阳性植株。该结果为进一步揭示CsiADH1基因在植物诱导防御反应中的分子机理研究奠定了基础。     

S-扁桃酸脱氢酶基因的克隆及表达

S-扁桃酸脱氢酶能够选择性催化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸。通过PCR扩增获得Pseudomonas p utida NUST的S-扁桃酸脱氢酶全长基因(mdlA),并构建了表达载体pET30a(+)-mdlA,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导获得表达,SDS-PAGE结果显示表达蛋白为43kDa。所以工程菌细胞具有转化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸能力。     

油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的克隆与表达分析

以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。     

重组酵母菌乙醇脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的:克隆产麻黄碱重组酵母菌乙醇脱氢酶基因片段,并对其进行序列分析,为研究该基因在重组酵母中与麻黄碱生物合成途径的关系提供参考.方法:根据一段利用抑制差减杂交技术获得的来源于重组酵母乙醇脱氢酶基因片段,采用RACE的方法扩增Adh基因,使用分子生物学软件对该基因进行生物信息学分析.结果:获得一段大小为1 245 bp的基因片段,编码375个氨基酸,含有两个催化域和两个锌结合域,与来源于Gandida boidinii ADH3基因的同源性为85％.结论:克隆的基因为乙醇脱氢酶基因,并在GenBank注册,登录号为JF293468.     

甘蔗细胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)叶片全长cDNA文库进行测序,获得了1个细胞质型苹果酸脱氢酶(cMDH)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-cMDH。生物信息学分析表明,该基因全长1314 bp,开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。Sc-cMDH与其他植物cMDH的氨基酸序列同源性高达86.5%～97.0%。Sc-cMDH包含典型的NAD+结合基元T11GAAGQI17和催化基元I184WGNH188,还有相当保守的6个半胱氨酸残基,因此推断该基因为细胞质型NAD-MDH。定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗叶片和根中的表达量高于茎。     

梭梭甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及序列分析

采用RT-PCR、RACE等方法从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中扩增出BADH基因的cDNA序列(命名为HaBADH),其开放阅读框为1 503 bp,推测的氨基酸序列全长为500个氨基酸残基,并含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C).其核苷酸序列与藜科几种盐生植物如盐爪爪(Kalidium foliatum)、中亚滨藜(Atriplex centralasiatica)、三角叶滨藜(Atriplex triangularis)、菠菜(Spinacia oleracea)、山菠菜(Atriplex hortensis)和甜菜(Beta vulgaris)等的相似性均在85%以上,推导编码蛋白的氨基酸序列一致性均在87%以上,表明BADH基因在藜科植物中是一种比较保守的基因.研究结果为进一步从分子水平探明梭梭的抗旱、耐盐机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础.     

Gene Cloning and Biochemical Characterization of an Alcohol Dehydrogenase from Euglena gracilis1

ABSTRACT. Euglena gracilis is a freshwater free‐living organism able to grow with ethanol as carbon source; to facilitate this metabolism several alcohol dehydrogenase (ADH) activities have been detected. We report the gene cloning, over‐expression, and biochemical characterization of a medium‐chain NAD⁺‐dependent ADH from E. gracilis (EgADH). The enzyme's amino acid sequence displayed the highest percentages of similarity and identity with ADHs of bacteria and fungi. In the predicted three‐dimensional model, all the residues involved in Zn²⁺, cofactor, and substrate binding were conserved. A conventional signal peptide for import into mitochondria could not be clearly identified. The protein of 37 kDa was over‐expressed, purified to homogeneity, and kinetically characterized. The enzyme's optimal pH was 7.0 for ethanol oxidation displaying a V_m of 11.7±3.6 U/mg protein and a K_m of 3.2±0.7 mM for this substrate. Isopropanol and isopentanol were also utilized, although with less efficiency. It showed specificity for NAD⁺ with a K_m value of 0.39±0.1 mM and Mg²⁺ or Zn²⁺ were essential for activity. The recombinant EgADH reported here may help to elucidate the roles that different ADHs have on the metabolism of short‐ and long‐chain alcohols in this microorganism.     

一类依赖于NAD的玉米胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其序列分析

苹果酸脱氢酶普遍存在于各种生物中,它负责催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换.根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布及其生理功能的不同,苹果酸脱氢酶在高等植物中可以区分出不同的类型,依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶是其中研究较少的一类.根据已发表的其他高等植物的依赖于NAD的胞质型苹果酸脱氢酶基因的保守序列,运用SMART RACE RT-PCR技术,从玉米叶片中分离了cyMDH 的1 264 bp全长cDNA序列,通过生物信息学分析发现,该序列含有一个999 bp的完整的开放阅读框,其共编码332个氨基酸(GenBank登陆号 EU625276).序列联配与树状分析结果表明,该玉米cyMDH 序列与多个物种的cyMDH 基因具有高度的同源性.组织特异性表达分析显示MDH基因在玉米叶片中表达量最高,在茎、根中亦有低水平表达.本研究将为更深入的研究玉米cyMDH 基因的分子调控机理奠定基础.     

力复霉素产生菌地中海拟无枝菌酸菌U32丙氨酸脱氢酶基因克隆及表达

丙氨酸脱氢酶(EC1411)可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸和NADH。它是生物体内的氨基酸代谢和氨同化途径的关键酶。在地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32中,丙氨酸脱氢酶的活力与力复霉素的生物合成有负相关现象,其活力受KNO3全局效应的调控。根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)的丙氨酸脱氢酶氨基酸的保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好,设计一对简并PCR引物。以此引物从地中海拟无枝菌酸菌U32中扩增到一555bp的片段,并以此片段为探针从地中海拟无枝菌酸菌U32 基因组cosmid文库中成功的克隆到了丙氨酸脱氢酶结构基因(ald)。它编码了一个371个氨基酸的蛋白质,基因的GC含量为72.5％,符合链霉菌的基因结构特征。在起始密码子的上游6个碱基处,有一典型的链霉菌核糖体结合位点(RBS)：AGGAGG,第75位的氨基酸为赖氨酸,是丙酮酸结合位点。以pET28b为载体,在E.coli BL21(DE3)中高效表达了ald基因。用IPTG在22℃时诱导得到的丙氨酸脱氢酶活力最高。用HisTag柱纯化了表达的丙氨酸脱氢酶。酶学性质研究表明该酶专一性以LAla和NAD(H)为底物。