陆地棉GhCDPK1基因响应干旱胁迫的功能初探

钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)是一类重要的钙信号感受蛋白和响应蛋白,在植物干旱、低温、盐碱等非生物胁迫应答中起着重要的调控作用。为探讨陆地棉GhCDPK1基因在干旱胁迫下所起的作用,该研究利用实时荧光定量PCR技术分析了PEG模拟干旱胁迫下该基因的表达量,发现GhCDPK1基因受干旱胁迫诱导。通过构建植物表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK1,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,发现干旱胁迫下转基因植株保水能力明显高于野生型植株,叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白含量及POD、SOD活性也高于野生型植株,而丙二醛含量低于野生型植株。研究结果表明,GhCDPK1基因作为正向调控因子响应干旱胁迫诱导,过表达GhCDPK1基因可以使植株积累更多的渗透调节物质、增强抗氧化系统酶的活性和维持细胞膜的稳定性来提高植物抵御外界干旱胁迫的能力。     

陆地棉GhPS2基因的克隆和表达分析

卤代酸脱卤酶(HAD)在调节植物生长发育和响应磷缺乏胁迫方面具有重要作用。该研究基于前期陆地棉根部低磷胁迫基因差异表达序列数据分析,以陆地棉新陆早19为材料,对GhPS2基因进行克隆,并对其基因组DNA与cDNA测序分析,借助生物信息学方法分析GhPS2的基因结构和进化关系;采用荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测该基因于根、茎、叶、花4个器官的基因表达量变化和低磷胁迫下0,4,12,24,72 h的相对表达。结果表明,(1)成功获得陆地棉GhPS2基因,该基因的开放阅读框序列长度813 bp,编码270个氨基酸,存在3个内含子,属于HAD家族,其中存在1个保守结构域名为Put-Phosphatase。(2)序列比对和进化分析显示,陆地棉GhPS2与其他棉种PS2、榴莲PS2的相似性分别为93%和83.15%。(3)qRT-PCR结果表明,GhPS2基因在根中表达量最高,其次是茎和花,在叶中表达量最低,该基因在低磷胁迫4 h时相对表达量达到最高值,低磷胁迫72 h时是适磷处理的16.66倍。研究表明,GhPS2基因属于低磷胁迫响应基因,在棉花响应低磷胁迫过程中具有重要作用。     

一个陆地棉bZIP蛋白cDNA的克隆及表达分析

利用PCR筛选方法从陆地棉纤维cDNA文库中筛选到一个全长cDNA序列,命名为GhbZIP。其编码产物长度为645个氨基酸残基,序列中含有两个未知功能的保守区域DUF630和DUF632,而DUF632区中有一个类似碱性亮氨酸拉链基元;此外氨基酸序列中还存在一个富脯氨酸区和一个富苯丙氨酸区,因此该蛋白具有植物碱性亮氨酸拉链蛋白的结构特征。亲水性分析表明,GhbZIP为一个典型的膜蛋白。GhbZIP基因主要是在开花3d之后在胚珠和纤维细胞中表达,这表明该基因可能与棉纤维伸长过程中的基因表达调控有关。     

陆地棉低磷胁迫应答基因GhERF5的克隆与表达分析

该研究基于前期陆地棉根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达序列数据分析及基因组数据库,从陆地棉‘新陆早19’中克隆AP2/ERF基因(GhERF5),并对其基因组DNA与cDNA测序分析,借助生物信息学方法分析其基因结构和进化关系;采用半定量RT-PCR技术与荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测该基因于根、茎、叶、花等组织的表达变化以及低磷胁迫不同时间的相对表达。结果表明：(1)成功克隆获得一个AP2/ERF基因,命名为GhERF5;GhERF5基因开放阅读框序列长度963 bp,共编码320个氨基酸;该基因在177～241处存在一个AP2保守结构域,属于AP2家族。(2)多序列比对发现,GhERF5与亚洲棉GaERF5、雷蒙德氏GoraiERF5L相似性达到95%;系统进化树分析显示,陆地棉GhERF5蛋白序列与陆地棉GhERF5L(NP＿001386305)的相似性最高,推测GhERF5基因是位于D亚基因组的基因。(3)半定量RT-PCR和qRT-PCR检测发现,GhERF5基因在陆地棉根、茎、叶和花中均有表达,但主要在叶中表达,其次为根和茎,花中的表达量最低;低磷处理0～72 h...     

干旱胁迫下不同抗旱水平陆地棉的叶片蛋白质组学比较研究

为了探讨陆地棉品种抗旱机理,以陆地棉抗旱品种‘中H177’和不抗旱品种‘中S9612’为材料,运用双向电泳结合质谱技术,分析干旱胁迫下不同陆地棉三叶期叶片蛋白质组分差异变化。结果表明:干旱胁迫下,不同陆地棉叶片蛋白表达差异较大;‘中H177’出现30个差异表达蛋白质点,‘中S9612’出现47个差异表达蛋白质点,只在‘中H177’表达差异的蛋白点11个,只在‘中S9612’表达差异的蛋白点28个,差异表达一致蛋白点8个,表达不一致蛋白点11个。质谱共鉴定出43个差异表达蛋白;功能分类分析表明,干旱胁迫蛋白参与光合作用、物质与能量代谢、抗逆相关蛋白、物质运输和活性氧清除;Rubisco活化酶和能量代谢相关蛋白ATP合成酶类表达差异最大。研究结果可以初步为陆地棉抗旱机理的探讨提供一定的理论基础。     

香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析

通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得胁迫相关蛋白基因,命名为MaSAP1(GenBank登录号为AGH14257.1)。扩增获得的cDNA序列与质粒OZ092的目的片段序列一致,表明MaSAP1是香蕉SAP基因编码框全长cDNA,包含一个510bp的最大开放阅读框,编码一个长169个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的A20和AN1基序结构。系统进化树比对分析表明,MaSAP1与水稻和獐茅的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaSAP1基因在香蕉根和果实中的表达量较高,在茎中的表达量最低。实时荧光定量PCR分析表明MaSAP1响应激素的处理,同时也响应干旱、低温、高盐和枯萎病菌的侵染等胁迫。可见,MaSAP1基因在植物生长发育和植物响应逆境中具有重要作用。     

陆地棉类谷氧还蛋(GhGRL)基因家族生物信息学分析

谷氧还蛋白(glutaredoxin, GRX)是一类小分子氧化还原蛋白,可以调节蛋白质的氧化还原状态从而维持蛋白质的功能,在生物的生长发育及抗氧化反应中起着重要的作用。类谷氧还蛋白蛋白(glutaredoxin-like, GRL)是新划分的GRX类型,本研究为深入探究GRL基因家族在陆地棉中功能,对GhGRL基因家族进行生物信息学及表达分析。研究结果表明,32个GhGRL基因主要定位于细胞核,它们均具有GRX-GRX-Like保守结构域。GhGRL基因所编码的氨基酸的多重序列比对和保守序列分析发现,该家族成员序列相似性约为31.31%,大部分包含4个保守基序,同时这4个保守基序与保守结构域重叠;根据GhGRL基因的系统进化树可将32个GhGRL基因分为3亚组,基因结构分析发现该家族基因大部分无内含子;染色体定位分析显示GhGRL基因分散在19个染色体上,每条染色体上的GhGRL基因数目有很大的差别;表达谱数据分析表明,大部分GhGRL基因在根、茎、雄蕊、雌蕊、子房、叶片和花等7个组织器官中均有表达,并且有差异。以上结果有利于了解棉花GhGRL基因家族的基本情况,为深入研究该基因家族在生物学功能提供基础。     

小麦TaTrxh9基因的序列特征及其对渗透胁迫的响应

硫氧还蛋白是一类广泛存在于植物中的低分子量氧化还原蛋白,在植物生长发育调控和逆境响应过程中发挥重要的调控功能。以小麦(Triticum aestivum L.)品种‘中国春’和‘洛旱2号’为材料,采用RT-RCR方法克隆了小麦硫氧还蛋白基因TaTrxh9,通过生物信息学方法分析了其染色体定位及序列特征,并利用qRT-PCR技术分析了该基因对渗透胁迫的响应模式。结果显示:(1)成功克隆到小麦TaTrxh9基因,序列分析发现TaTrxh9基因位于第1染色体群的短臂上,并将其3个部分同源基因命名为TaTrxh9-1AS、TaTrxh9-1BS和TaTrxh9-1DS。(2)TaTrxh9基因包含4个内含子,且在内含子区域3个部分同源基因间序列差异较大;3个部分同源基因的编码区序列一致性在98%以上,均编码131个氨基酸,且蛋白序列完全相同;TaTrxh9蛋白包含1个Trx-family保守域和CXXC氧化还原活性位点,三维结构预测分析显示该蛋白可形成典型的硫氧还蛋白空间结构,包括由4个α螺旋组成的外围框架和由5个反向平行的β折叠组成的中心轴。(3)qRT-PCR分析显示,TaTrxh9基因受干旱胁迫诱导在叶片中下调表达,而在根系中呈先上调后下调的表达模式;盐胁迫过程中,TaTrxh9基因在叶片中无显著响应,在根系中也仅出现短暂的诱导表达现象;在ABA处理过程中,TaTrxh9基因表达模式与其对干旱胁迫的响应模式类似。研究推测,TaTrxh9基因对干旱胁迫的响应过程可能与ABA介导的基因表达调控有关。     

玉米苗期SR蛋白基因家族的干旱胁迫应答

基因表达的选择性剪接(Alternative splicing, AS)调控与植物对逆境胁迫应答密切相关, SR蛋白(Serine/ arginine-rich proteins)是其中关键的调节因子。文章对玉米B73参考基因组进行分析显示: 多数SR蛋白家族基因成员启动子区域含有3~8种与发育或胁迫相关的顺式调控元件; 27个基因成员编码碱性蛋白, 其中23个成员的编码蛋白依照其N′端的首个RRM(RNA recognition motif)结构域特征大体上可划分为5个亚组。利用双向分级聚类方法, 对三叶期干旱胁迫下玉米杂交种郑单958及其亲本郑58和昌7-2的SR蛋白基因家族的分析显示, 该基因家族的表达模式具有明显的组织表达特异性和基因型依赖性特征; 其中在干旱胁迫下地下组织以下调表达模式为主, 而地上组织中以上调表达模式为主。在重度干旱胁迫后的3个不同时段复水过程中, 地上和地下组织中SR蛋白基因家族的表达皆以下调表达模式为主。另外, 尽管不同基因成员的表达模式在干旱胁迫及其后的复水过程中存在明显差异, 但普遍存在自身选择性剪接现象。SR蛋白基因家族在玉米干旱胁迫的应答规律, 为从AS-network视角解析玉米的抗逆分子机制提供了新思路。     

陆地棉MGDG基因家族低磷胁迫下的表达分析

单半乳糖甘油二酯(monogalactosyl diacylglycerol, MGDG)是植物光合膜的重要组成成分,在植物抵御不利环境过程中具有调控作用。研究利用生物信息学方法对陆地棉MGDG基因家族(GhMGDs)进行了全基因组鉴定,并验证其在低磷胁迫下的表达规律,为明确MGDG基因在陆地棉低磷胁迫中的作用奠定基础。结果表明:(1)该基因家族在陆地棉中有17个成员,氨基酸残基在435~888 aa之间,理论等电点在6.00~9.67,均含有6~8个内含子。(2)系统进化分析表明,该基因家族可分为A型和B型MGDG合成酶,各亚族内各成员基因结构和保守基序的数量和分布基本一致。(3)17个MGDG基因在7条染色体上呈现不均匀分布,二级结构均显示该家族主要由α-螺旋和无规则卷曲所组成。(4)qRT-PCR分析结果显示,MGDG基因在陆地棉4个不同组织中表达量有差异,其中GhMGD2、GhMGD12和GhMGD16在根的表达量最高,GhMGD7、GhMGD9和GhMGD10在叶的表达量较高。陆地棉MGDG家族GhMGD2、GhMGD7、GhMGD9、GhMGD10、GhMGD12和GhMGD16 6个候选基因均受低磷胁迫的诱导表达,GhMGD2基因在低磷处理72 h表达量是适磷处理的72倍。     

一个陆地棉羧基末端蛋白酶cDNA的克隆及其表达分析

利用PCR筛选方法从陆地棉纤维cDNA文库中分离出1个基因序列,命名为ChCtp。该cDNA全长1917bp,编码1个含473个氨基酸残基的多肽。GhCtp蛋白与拟南芥和水稻中的一类羧基末端蛋白酶具有较高的同源性,在GhCtp的N-末端有1个精氨酸富集区,而C-末端有1个Pfam数据库中编号为DUF239的高度保守区域;该蛋白的N-末端还存在1个在拟南芥和水稻羧基蛋白酶中所缺乏的ATP/GTP结合区A序列。亲水性分析表明,GhCtp为1个可能的跨膜蛋白。从表达特征来看,GhCtp不属于纤维细胞特异表达或优势表达基因,并且它在棉花不同组织中或不同纤维发育时期的表达强度均很低。     

棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术首次从棉花中克隆了一个CCoAOMT基因,命名为GhCCoAOMT1(GenBank登录号为FJ848871).研究结果表明:GhCCoAOMT1基因cDNA全长960 bp,具有一个753 bp的开放阅读框,5'非编码区为9 bp,3'非编码区为198 bp,编码250个氨基酸,预测分子量约为28.306 kDa,等电点为5.39.利用PCR方法克隆了GhCCoAOMT1基因的基因组序列,长度为1 311 bp,包含5个外显子和4个内含子.氨基酸同源性分析发现,GhCCoAOMT1与来自毛白杨、烟草和苎麻的CCoAOMT同源性较高.半定量RT-PCR检测表明,GhCCoAOMT1基因在棉花各个组织中都有表达,其中茎部的表达量最高,其次表达量依次为根>花瓣>子叶>10 d纤维>雄蕊>胚珠>叶.     

棉花4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆及原核表达

本研究从棉花中克隆了一个4CL基因,命名为Gh4CL2(GenBank登录号为FJ848870)。研究结果表明:Gh4CL2基因cDNA全长2332bp,具有一个1725bp的开放阅读框,5′非编码区为64bp,3′非编码区为543bp,编码574个氨基酸,预测分子量约为62.106kD,等电点为5.94。氨基酸同源性分析发现,Gh4CL2与来自白杨、大豆和紫草的4CL一致性较高。进一步研究Gh4CL2基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-4CL2,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,最佳诱导表达条件为0.5mmol/LIPTG在37℃下诱导4h,重组蛋白主要以包涵体形式出现。     

棉花Gh4CL1基因克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的4-香豆酸辅酶A连接酶基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从棉花中克隆了1个4CL基因,命名为Gh4CL1(GenBank登录号为FJ479707).结果表明:Gh4CL1基因cDNA全长2 331 bp,具有1个1 722 bp的开放阅读框,5′非编码区为64 bp,3′非编码区为445 bp,编码573个氨基酸,预测分子量约为61.951 kD,等电点为5.70.氨基酸同源性分析发现,Gh4CL1与来自白杨、大豆和紫草的4CL同源性较高.半定量RT-PCR检测表明,Gh4CL1基因在不同发育阶段的棉纤维中均有表达,在开花后20 d的棉纤维中表达量最大,说明该基因可能参与调控棉纤维细胞的伸长和次生壁的增厚.Gh4CL1基因在棉花花瓣中表达量最高,在其他组织中低水平表达或不表达.     

棉花GhCCR1基因结构及表达分析

根据棉花GhCCR1基因的cDNA序列设计引物,采用PCR技术从棉花中克隆了GhCCR1基因的DNA序列,并采用半定量RT-PCR方法分析了GhCCR1基因在不同发育阶段棉纤维中的表达情况.结果表明:GhCCR1编码区DNA序列长度为1 161 bp,包含4个外显子和3个内含子,内含子富含AT,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则.半定量RT-PCR检测表明,GhCCR1基因在不同发育阶段的棉纤维中均有表达,在开花后20 d的棉纤维中表达量最高,说明该基因可能参与调控棉纤维细胞的伸长和次生壁的增厚过程.     

棉花LIM结构域基因(GhLIM1)的克隆和表达分析

LIM结构域蛋白是一个重要的发育调控因子,参与基因转录,细胞骨架建成和信号传导等许多发育调控过程,胞质骨架是形成和稳定细胞形态以及传递物质,能量和信息的重要成分。为研究棉花纤维细胞发育过程中胞质骨架的形成和作用机理,通过棉花纤维EST序列整合,从陆地棉徐州142胚珠（含纤维）中扩增并克隆出棉花LIM结构域基因的编码区段。该棉花LIM结构域基因（GhL1M1)长848bp,包含一个570bp的开放阅读框,推导的氨基酸序列（189个氨基酸）与拟南芥,烟草和向日葵的LIM结构域蛋白有极高的同源性,而且两个LIM结构域完整,RT-PCR和Northerm杂交分析表明,该基因（GhL1M1）在陆地棉的根,茎尖,上胚轴,叶片,花蕾,花药,胚珠和不同发育时期的陆地棉纤维（4DPA、12DPA、18DPA）以及海岛棉纤维（18DPA）和中棉纤维（12DPA）中均有表达,但GhL1M1基因在茎尖,纤维和有纤维的胚珠中表达量更高,因此GhL1M1基因应与棉花纤维发育有密切关系。     

两个棉花Rac蛋白基因的克隆与表达分析

为研究棉花纤维起始和伸长的分子机理,在棉花纤维EST序列分析的基础上,从棉花纤维中扩增并克隆了2个棉花Rac蛋白的cDNA基因,分别命名为GhRacA和GhRacB。GhRacA cDNA长959bp,推测的编码蛋白包含211个氨基酸。GhRacB cDNA长920bp,编码195个氨基酸的蛋白。GhRacA和GhRacB蛋白均含有GTP／GDP结合和激活区域、Effector区和碱性氨基酸区。GhRacB的C末端有保守的异戊烯基化位点CSIL,而GhRacA没有明显的异戊烯基化位点。序列比较分析表明,GhRacA和GhRacB是2个新的棉花Rac蛋白。RT-PCR分析表明,GhRacA和GhRacB在根、下胚轴、茎、叶和纤维中都有表达,但均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达,推测2个基因在棉花纤维的早期发育中可能有重要的功能。     

影响陆地棉遗传转化的外部因子研究

以我国培育的陆地棉载品种为主,研究了农杆菌介导遗传转化过程中外植体材料、菌液浓度、感染时间、抗菌素等对论效率的影响以及愈伤组织的诱导分化过程,明确了影响睦棉遗传转化的外界条件。