TGF-β1诱导的Postn、α-SMA和CollagenⅠ在宫腔粘连内膜组织中高表达与粘连严重程度相关

骨膜蛋白（periostin, Postn）与转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta1,TGF-β1）信号通路活动密切相关,并参与多种纤维化疾病的病理形成,但在宫腔粘连（intrauterine adhesions,IUAs）形成过程中的作用机制尚不清楚。为了解Postn与纤维标志物（α-平滑肌肌动蛋白：alpha smooth muscle actin,α-SMA,Ⅰ型胶原：CollagenⅠ）在宫腔粘连发病中的作用,本研究收集宫腔粘连（实验组）轻、中、重度各20名患者的内膜组织,非宫腔粘连者20名（对照组）,利用实时荧光定量PCR技术、Western印迹技术和免疫组化染色证明：Postn与α-SMA、CollagenⅠ在mRNA和蛋白质表达水平的趋势一致,且与宫腔粘连严重程度呈正相关;实验组Postn、α-SMA 和 CollagenⅠ较对照组明显升高,其中以中、重度宫腔粘连患者内膜组织Postn、α-SMA和CollagenⅠ表达有非常显著的统计学差异（P＜0.01）。同时,为探究TGF-β1与Postn等纤维标志物的关系,利用重组人转化生长因子TGF-β1刺激原代子宫内膜基质细胞后,Western印迹结果显示,TGF-β1与Postn、α-SMA和CollagenⅠ蛋白质表达变化呈现剂量和时间依赖关系。上述结果证实,内膜纤维化是宫腔粘连的主要特征,由Postn等纤维产物参与形成,且与粘连程度相关。推测该病理过程可能与内膜损伤后,TGF-β1促使子宫内膜基质细胞成纤维分化、诱导Postn持续高表达有关。     

宫腔镜下冷刀分离术与电切术治疗宫腔粘连的疗效及对宫腔形态恢复和血清白细胞介素的影响

摘要 目的：对比宫腔镜下冷刀分离术与电切术治疗宫腔粘连（IUA）的疗效及对宫腔形态恢复和血清白细胞介素的影响。方法：回顾性分析2019年4月~2021年2月期间来我院接受治疗的83例IUA患者的临床资料。根据手术方式的不同将患者分为A组（宫腔镜下电切术,40例）和B组（宫腔镜下冷刀分离术,43例）,对比两组手术时间及住院时间、宫腔形态恢复情况和血清白细胞介素变化,观察两组术后并发症发生率、月经改善率和宫腔再粘连发生率。结果：B组手术时间、住院时间短于A组（P<0.05）。B组总有效率、内膜创面上皮化愈合满意率均高于A组（P<0.05）。两组血清白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）水平升高,但B组低于A组（P<0.05）。两组血清白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）降低,但B组高于A组（P<0.05）。两组术后并发症发生率组间对比无统计学差异（P>0.05）。B组月经改善率高于A组,宫腔再粘连发生率低于A组（P<0.05）。结论：与宫腔镜下电切术治疗IUA相比,宫腔镜下冷刀分离术治疗IUA手术时间、住院时间更短,宫腔形态恢复和月经改善情况更好,机体炎性反应更轻微,同时宫腔再粘连发生率更低,疗效更优。     

P63在子宫内膜样腺癌的表达及意义

目的检测正常子宫内膜、子宫内膜增生症和子宫内膜样腺癌（endometriod adenocarcinoma,EC）组织中P63的表达,探讨P63与子宫内膜样腺癌发生、发展及预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测正常子宫内膜（20例）,子宫内膜增生症（20例）,子宫内膜样腺癌（50例）组织中P63蛋白的表达。结果（1）正常子宫内膜中仅1例增生期内膜中有P63表达,阳性细胞零星分布于极个别腺体的基底部。子宫内膜增生症和子宫内膜样腺癌组织中,P63阳性细胞常相对集中分布于某一区域的腺体或实性巢,染色强。（2）EC组和子宫内膜增生症组P63的阳性率分别为46％和50％,与正常子宫内膜组（5．0％）比较差异有显著性护〈0．05）。子宫内膜增生症组P63的阳性率与EC组比较差异无显著性（P〉0．05）。（3）P63的表达与EC的分化程度无关（P〉0．05）。结论（1）EC组织中P63阳性细胞可能来源于胚胎时期的未分化细胞,具有多向分化的潜能。（2）P63与EC的发生发展有关,可能起癌基因的作用。（3）P63在子宫内膜增生症组织中高表达,表明P63与子宫内膜的异常增生相关。     

人羊膜上皮干细胞联合富血小板血浆对宫腔粘连大鼠纤维化因子、炎症因子的作用

摘要 目的：探究人羊膜上皮干细胞（hAECs）联合富血小板血浆（PRP）对宫腔粘连大鼠的治疗效果,为临床中优化宫腔粘连治疗方法理论基础。方法：选用SPF级雌性SD大鼠共40只,依照随机数字表法随机分为空白组（A组）、假手术组（B组）、hAECs组（C组）、PRP组（D组）、hAECs+PRP组（E组）,每组各8只。A组不做任何处理,B组仅做麻醉、开关腹腔处理,C组、D组、E组使用搔刮法制备宫腔粘连模型。随后C组进行hAECs治疗,D组注射等量生理盐水。D组进行PRP治疗,C组注射等量生理盐水。E组进行hAECs联合PRP治疗。观察比较两组大鼠子宫内膜组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、盘状结构域受体2（DDR2）蛋白表达水平、PI3K/Akt/mTOR通路相关mRNA表达量、血清白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）水平以及各组大鼠妊娠孕囊数量比较。结果：与A组相比,B组的子宫内膜组织MMP-9、DDR2蛋白表达水平、p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA水平以及血清IL-6、IL-8水平比较无差异（P＞0.05）;C组、D组、E组大鼠的子宫内膜组织MMP-9、DDR2蛋白表达水平明显下降,IL-6、IL-8水平、p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA表达升高（P＜0.05）。其中,E组大鼠MMP-9、DDR2蛋白表达水平明显高于C组、D组,IL-6、IL-8水平及p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA表达低于C组、D组（P＜0.05）。C组、D组大鼠MMP-9、DDR2蛋白表达水平、血清IL-6、IL-8水平及p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA表达比较（P＞0.05）。妊娠孕囊数量方面,与A组比较,B组大鼠妊娠孕囊数量。结论：hAECs联合PRP治疗可能通过上调宫腔粘连大鼠子宫内膜组织MMP-9、DDR2蛋白表达水平并下调p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA表达,同时降低炎性因子IL-6、IL-8水平,进而提高妊娠孕囊数量,起到治疗作用。     

人嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体的分离鉴定及生物学特性研究

外泌体是指释放到细胞外微环境中的直径约50～130 nm的纳米级的膜性囊泡。嗅黏膜间充质干细胞（olfactory mucosa mesenchymal stem cells,OM-MSCs）作为一类新发现的间充质干细胞,在许多疾病中均具有治疗作用,且其内在机制与其旁分泌的外泌体密切相关,但OM-MSCs外泌体的分离、鉴定及生物学特性的研究尚未见报道。本研究采用超速离心法提取OM-MSCs培养液中的外泌体,应用流式细胞术及免疫荧光进行细胞鉴定后,分别用透射电子显微镜、纳米粒径分析及Western印迹对外泌体形态、颗粒大小和表面的特异性分子标志进行分析鉴定。采用CCK8增殖实验,Western印迹和划痕实验,分析其对人脑微血管内皮细胞增殖和迁移的影响。电镜、Western 印迹和纳米粒径分析的结果显示：OM-MSCs来源外泌体形态多为圆形,直径约为40～150 nm;表达外泌体标记物CD63,CD81;CCK-8法检测显示：不同浓度的OM-MSCs源外泌体可提高人脑微血管内皮细胞的增殖活性,且其增殖促进作用具有浓度依赖性（P<0.05）。Western 印迹检测结果显示：相比空白对照组,OM-MSCs源外泌体可显著提高内皮细胞的增殖细胞核抗原蛋白质水平表达（P<0.01）,细胞划痕实验结果显示,OM-MSCs源外泌体可增强内皮细胞的迁移能力,且高于对照组（P<0.01）。本研究表明：通过超速离心法可以分离纯化获得OM-MSCs源外泌体,且该外泌体具有促进人脑微血管内皮细胞迁移和增殖的作用。     

PKH26标记的人羊膜间充质干细胞在宫腔粘连大鼠中的迁移示踪

为了观察PKH26标记的人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)在宫腔粘连大鼠子宫内膜中的迁移情况,文中提取鉴定及PKH26标记hAMSCs,检测PKH26染色剂对hAMSCs生物学特性的影响;利用机械感染双重法建立大鼠宫腔粘连模型并经尾静脉移植PKH26标记的hAMSCs,荧光共聚焦显微镜下观察PKH26标记的hAMSCs移植后在大鼠子宫内膜中的分布情况。结果显示,PKH26染色剂对细胞的活性、周期、凋亡等无明显影响,PKH26标记的阳性细胞主要分布在大鼠受损的子宫内膜中。表明PKH26标记技术是一种安全有效的示踪方法,可用于hAMSCs移植在治疗宫腔粘连时的示踪研究。     

大鼠子宫宫腔粘连模型的建立及评价指标

子宫内膜损伤是导致宫腔粘连的最主要原因,建立有效的子宫内膜损伤动物模型是研究此类疾病发生、发展和治疗反应等不可或缺的支撑条件。通过宫腔注射95%的乙醇制造大鼠(Rattus norvegicus)子宫内膜损伤模型,检测胚胎植入数目来分析子宫内膜损伤对大鼠生育情况的影响,观察大鼠子宫内膜厚度、腺体数量和纤维化面积,分析乙醇处理对子宫内膜的影响;检测细胞角蛋白(CK-19)和波性蛋白(Vimentin)的表达水平,分析上皮细胞和间质细胞的增殖分化及子宫内膜损伤程度。结果显示,正常组大鼠子宫比损伤组更为平滑且有韧性,与正常组相比,损伤组大鼠生育率显著降低(P0.01),子宫内膜厚度变薄(P0.01)、腺体数量显著减少(P0.01),纤维化面积显著增大(P0.01),CK-19和Vimentin表达量显著下调。结果提示已成功建立大鼠子宫内膜损伤动物模型。     

脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定

目的探讨脐带间充质干细胞的外泌体的获取与鉴定方法。方法通过组织块贴壁法从胎儿脐带分离和培养脐带间充质干细胞并通过RiboTMExosome Isolation Kit收集外泌体,采用电镜和流式细胞仪鉴定外泌体。结果第二代脐带间充质干细胞表面CD45、CD34和HLA-DR呈阴性表达,CD29、CD44和CD105呈阳性表达;在透射电镜下观察到脐带间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形,大小不均匀,直径30~100 nm,有完整的膜结构,内含低密度物质;流式细胞检测外泌体CD9、CD63、CD81和CD83呈阳性表达。结论在培养脐带间充质干细胞的培养基中可以收集到外泌体,可以通过电镜和流式细胞仪对脐带间充质干细胞的外泌体进行鉴定。     

宫腔镜下冷刀分离术后P8仿生物电刺激辅助治疗宫腔粘连的临床研究

摘要 目的：探讨宫腔镜下冷刀分离术后P8仿生物电刺激辅助治疗宫腔粘连的效果及对患者子宫内膜血流参数和血清基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平的影响。方法：选取2017年3月至2019年3月我院收治的宫腔粘连患者106例进行前瞻性随机对照研究,以随机数字表法将患者分为研究组（n=53）和对照组（n=53）。两组均采取宫腔镜下冷刀分离术,对照组术后置入COOK球囊,并在术后当天给予人工周期治疗,研究组在对照组基础上予以P8仿生物电刺激辅助治疗,均治疗3个月。对比两组疗效、月经改善情况、治疗后1年妊娠情况、粘连复发情况和治疗前、治疗1个月后、3个月后粘连评分、子宫内膜容积、子宫内膜厚度、子宫内膜血流参数［阻力指数（RI）、搏动指数（PI）］、血清MMP-9、TGF-β1水平。结果：研究组治疗3个月后总有效率、月经改善率分别为92.45%、94.34%,高于对照组的75.47%、79.25%（P＜0.05）;研究组治疗1个月后、3个月后粘连评分和RI、PI低于对照组,子宫内膜容积、子宫内膜厚度高于对照组（P＜0.05）;研究组治疗1个月后、3个月后血清MMP-9水平高于对照组,TGF-β1水平低于对照组（P＜0.05）;研究组治疗后1年妊娠率44.23%高于对照组25.00%,粘连复发率15.38%低于对照组32.69%（P＜0.05）。结论：宫腔镜下冷刀分离术后P8仿生物电刺激辅助治疗宫腔粘连可减轻宫腔粘连程度,改善子宫内膜容积、厚度、血流情况,调节血清MMP-9、TGF-β1表达,改善月经情况,进而提高疗效和妊娠率,减少粘连复发。     

人脐带干细胞来源的外泌体促进体外培养雪旺细胞迁移的研究

目的:外泌体是活细胞分泌的来源于多囊泡体的膜性囊泡,其主要作用包括携带与运输。雪旺细胞是周围神经再生中非常优秀的种子细胞,但其迁移能力较差,影响修复效果。本文旨在探讨外泌体和雪旺细胞共培养是否可以促进雪旺细胞迁移。方法:本实验通过分离纯化人脐带干细胞外泌体和大鼠坐骨神经雪旺细胞并鉴定,随后将其共培养于Transwell小室观察雪旺细胞迁移率。结果:通过人脐带干细胞超高速离心法得到的外泌体高表达干细胞标志物CD44(92.2±3.6%)、CD73(99.1±0.6%),并且低表达单核细胞表面抗原CD14(0.5±0.06%)以及造血干细胞表面抗原CD34(0.4±0.07%),外泌体鉴定高表达CD81和CD9;雪旺细胞培养鉴定纯度达(92.3±2.7)%;均符合实验要求。通过Transwell小室实验发现外泌体可以明显促进雪旺细胞的迁移,并且具有一定剂量关系。结论:外泌体可以提高雪旺细胞的迁移能力,从而使雪旺细胞在组织工程领域中的应用产生巨大突破。     

寿胎丸提高子宫树突状细胞的表达改善超促排卵大鼠子宫内膜容受性

摘要 目的：探究寿胎丸提高子宫树突状细胞的表达改善超促排卵(controlled ovary hyperstimulation,COH）大鼠子宫内膜容受性。方法：将大鼠随机分为对照组、模型组、寿胎丸（低、中、高剂量）组,用促性激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist,GnRH-a）、尿促性腺激素（human menopausal gonadotropin,HMG）和人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonado-tropin,HCG）构建COH大鼠模型,寿胎丸低、中、高剂量组采用2.5、5和10 g/ kg/d寿胎丸灌胃。流式检测子宫内膜树突状细胞（Uterine dendritic call,uDC）表面特异性标记蛋白OX-62。Western blot检测CD34和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白表达。结果：与对照组比较,模型组OX-62阳性表达率降低,CD34和VEGF表达明显降低（P<0.05）。与模型组比较,寿胎丸低、中、高剂量组OX-62阳性表达率上升,CD34和VEGF表达明显升高,呈剂量依赖性（P<0.05）。结论：寿胎丸提高子宫树突状细胞的表达改善超促排卵大鼠子宫内膜容受性。     

Jagged1/notch1在宫腔粘连患者子宫内膜中表达上调

Notch通路是与细胞增殖、分化、凋亡等密切相关的通路,其相关蛋白表达异常参与多种疾病的发生,但其在宫腔粘连中的作用尚不清楚.为探讨jagged1/notch1在宫腔粘连（IUAs）发病中的作用,本实验选择经宫腔镜诊断为宫腔粘连患者40例为IUAs组,非宫腔粘连患者25例为对照组,宫腔镜直视下取子宫内膜组织,采用实时荧光定量PCR法检测jagged1、notch1 mRNA表达,发现IUAs组jagged1、notch1的表达显著高于对照组.免疫荧光染色、免疫组织化学和Western印迹技术检测jagged1、notch1蛋白表达. 结果显示,与对照组相比,IUAs组jagged1、notch1蛋白表达水平均明显升高.以上结果表明, Notch通路相关因子jagged1、notch1的高表达可能与宫腔粘连的发生发展有关.     

间充质干细胞来源外泌体对脑内小胶质细胞极化和炎症因子释放的影响及机制研究

摘要 目的：探究间充质干细胞外泌体对脑内小胶质细胞极化和炎症因子释放的影响及其机制。方法：收集体外培养的间充质干细胞上清，超高速冷冻离心获取外泌体。采用纳米颗粒系统和透射电子显微镜分别检测外泌体粒径大小、形态结构和功能完整性。通过免疫荧光、ELISA和细胞流式等方式检测LPS刺激下，外泌体对BV2细胞的表型极化和炎症因子释放的影响。采用Western Blot法检测间充质干细胞外泌体对BV2细胞JAK1/STAT3通路活化的影响。结果：（1）间充质干细胞分泌的外泌体粒径大小主要介于40-100 nm，透射电镜显示外泌体形态呈典型膜性"杯盘"状结构；（2）流式结果表明，相比于对照组，LPS组能显著激活M1型小胶质细胞表面标志物CD11b和M2型小胶质细胞表面标志物CD206的表达，而经外泌体处理，CD11b的表达显著被抑制，CD206显著升高。同时ELISA结果证实，相比于LPS组，外泌体组分泌的促炎症因子（IL-1β、IL-6）和NO水平显著降低（P<0.05），抗炎因子（IL-10）显著升高 (P<0.05)；（3）间充质干细胞外泌体显著提高了BV2细胞JAK1/STAT3通路的磷酸化水平。结论：间充质干细胞外泌体通过激活JAK1/STAT3通路有效促进脑内小胶质细胞M1型向M2型极化。     

子宫内膜异位症大鼠模型的建立及其病理学改变

目的构建子宫内膜异位症（内异症）大鼠动物模型,为阐明内异位症发病机理以及寻找有效的治疗方法提供理想的动物模型。方法取性成熟雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只,通过手术将大鼠自体子宫组织移植到子宫旁韧带上,建立诱发型内异症大鼠动物模型。术后8周,再次剖腹观察异位组织的存活情况、病灶大小、与周围组织的粘连程度以及病理学变化。结果25只大鼠有明显的异位病灶。所有病灶都与周围组织有不同程度的粘连,病灶外观呈囊泡状。光镜观察见大部分异位子宫内膜形态和结构与在位子宫内膜基本相同,但内膜细胞、间质细胞、腺体,与在位内膜相比较少。少数病灶只有上皮组织或只有问质组织。结论自体子宫移植法可成功建立内异症大鼠模型。     

人脐带间充质干细胞外泌体抑制草酸及草酸钙诱导的HK-2细胞上皮间质转化

采用草酸及一水草酸钙(calcium oxalate monohydrate,COM)晶体诱导人近端肾小管上皮细胞(HK-2)发生上皮间质转化,同时采用超速离心法提取人脐带间充质干细胞外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cells exosome,huc MSC-Ex)用于干预间质化的HK-2细胞,探究外泌体对其纤维化的缓解作用。采用Western blot、透射电镜及NTA(nanoparticle tracking analysis)鉴定外泌体表面标志物及形态,采用MTT法观察外泌体对细胞活性的影响;免疫荧光双标法检测ZO-1及N-cadherin的表达;Western blot检测细胞上皮标志物E-cadherin和ZO-1、间质标志物N-Cadherin和α-SMA及相关信号通路蛋白TGF-β和Smad2的表达水平。结果显示,草酸和COM晶体可使HK-2细胞形态发生上皮间质转化,并降低上皮细胞标志物E-cadherin和ZO-1的表达,同时使HK-2细胞高表达间质标志物N-Cadherin和α-SMA并上调信号通路蛋白TGF-β和Smad2的表达。电镜下可观察到huc MSC-Ex形态呈双层膜,中空,圆形或椭圆形,并且阳性表达外泌体标志物Alix、CD63和TSG101蛋白,其粒径分布在80~300 nm之间。huc MSC-Ex预处理可显著提高暴露于草酸及COM晶体的HK-2细胞活性。降低HK-2细胞中N-Cadherin和α-SMA及信号通路蛋白TGF-β和Smad2的表达,恢复其上皮标志物E-cadherin和ZO-1蛋白的表达。该研究结果表明,huc MSC-Ex能够缓解草酸及COM晶体诱导的HK-2细胞损伤,同时抑制其上皮间质转化。     

钙网质蛋白在多囊卵巢综合征大鼠子宫内膜的表达及意义

目的：研究钙网质蛋白（CRT）在PCOS大鼠子宫内膜中的表达及生物学意义。方法：60只雌性SD大鼠随机分为PCOS组和对照组,每组各30只。给模型组24日龄大鼠皮下埋植左旋甲基炔诺酮硅胶棒3mm／只,3d后BID皮下注射人绒毛膜促性腺激素1．5IU。给对照组皮下注射等体积生理盐水。注射9d后观察大鼠卵巢形态学（HE染色）,化学发光法测定性激素水平。结果：模型组大鼠卵巢重量和体积均显著高于对照组（P〈0．01）。模型组大鼠卵巢出现类多囊卵巢综合征的改变。模型组卵巢各级发育期卵泡及黄体少见,卵泡多呈囊性扩张。模型组大鼠血清孕激素、睾酮、空腹胰岛素、空腹血糖水平均显著高于对照组（P〈0．05）;卵泡刺激素（FSH）水平显著低于对照组（P〈0．05）。LH／FSH比值显著高于对照组（P〈0．05）。采用免疫组织化学方法及灰度值测定,定量分析CRT在PCOS组和对照组的子宫内膜中表达。CRT在两组中的子宫内膜中均有表达。PCOS组子宫内膜上皮CRT表达显著低于对照组（P〈0．01）。结论：避孕硅胶棒联合hCG诱导SD大鼠多囊卵巢综合征模型是较好的PCOS模型。CRT与PCOS的发病密切相关．     

米非司酮抗着床作用的形态学观察

采用光镜和透射电镜方法观察米非司酮对大鼠子宫内膜形态结构的影响。实验用３０ 只成年雌性大鼠分为５ 组, 实验组给予米非司酮（Ｃ１： １２ｍ ｇ／ｋｇ, Ｃ２： ６ｍ ｇ／ｋｇ, Ｃ３： ３ｍ ｇ／ｋｇ）, 与阴性（Ａ组） 及阳性（Ｂ组） 对照组进行比较。结果显示米非司酮用药组子宫内膜和腺体发育受抑制。     

一种大容量细胞灌流液中外泌体的提取方法及鉴定*

目的: 建立一种从大容量细胞灌流液中提取外泌体的方法,并进行外泌体的鉴定。方法: 人脐静脉内皮细胞株(EA.HY926)是人脐静脉内皮细胞和人肺腺癌细胞株A549杂交成的永生化细胞株,因其具有血管内皮细胞的特性,广泛用于内皮细胞相关研究。本研究采用含10%胎牛血清的M199培养基培养,利用Flexcell STR-4000平行板流室系统对EA.HY926施以振荡剪切应力。收集流体剪切应力处理后的细胞灌流液,去除细胞碎片后冻成干粉,脱盐、提取纯化外泌体。电镜观察外泌体形态、纳米粒径电位分析仪检测外泌体大小、PKH26染色检测外泌体膜性结构、BCA蛋白定量法检测外泌体的蛋白浓度、Western blot检测外泌体特异性蛋白CD9和CD81的表达,荧光定量RT-PCR检测内皮细胞相关基因的表达。结果: 该方法提取的外泌体,大小均一,结构完整,呈典型囊泡样结构;粒径集中在30~150 nm,多数粒径为97.63 nm;表达外泌体特异性蛋白CD9和CD81;PKH26染色阳性,并可被细胞摄取;EA.HY926分泌的外泌体表达内皮细胞相关的CD31、vWF等mRNA,以及miR-126、miR-21、miR-155等microRNA分子。结论: 本方法能够有效从大容量细胞灌流液中提取到结构完整的、高浓度、高质量的外泌体,为开展以流体力学干预细胞为基础的外泌体相关研究提供技术方法。     

过表达IDO的骨髓间充质干细胞分泌外泌体下调树突状细胞免疫促进分子表达和上调Treg细胞数量

目的探讨过表达吲哚胺2, 3-双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxy genase, IDO)大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchy mal stem cells, BMSCs))分泌外泌体(exosome, ES)的免疫抑制调节作用。方法构建过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞提取分泌的外泌体做为实验组,将空载体大鼠骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞分泌的外泌体做为对照组,将实验组及对照组分泌的外泌体分别与树突状细胞(DC细胞)、T细胞体外共培养48h后采用流式细胞检测DC细胞表面免疫调节分子表达及T细胞亚群分子标志物表达,同时采用RT-PCR检测DC细胞中IDO表达量。结果过表达IDO的BMSCs分泌的外泌体与DC细胞共培养使DC细胞CD40、CD86、CD80、MHCII、CD45RA+CD45RB、OX62等免疫促进分子表达率降低,而CD274表达率升高,同时DC细胞中IDO表达量增多;而过表达IDO的BMSCs分泌的外泌体与T细胞共培养组使T细胞亚群中的Treg细胞数量增加,CD4阳性T细胞变化无规律性,但CD8阳性T细胞减少。结论过表达IDO-BMSCs分泌的外泌体可通过抑制DC活性和上调Treg细胞数量,产生免疫抑制作用。     

间充质细胞外泌体促进小鼠胰岛内皮细胞血管生成的研究

目的探讨间充质细胞（MSC）外泌体对低氧条件下胰岛内皮细胞（MS-1）血管生成的影响。 方法MSC无血清低氧条件培养48?h,超滤离心法富集条件培养基中的外泌体,采用电镜和Western Blot的方法进行鉴定;通过血管形成试验比较分析不同条件下：常氧培养组（NOR组,21﹪O₂、5﹪CO₂）、低浓度氧培养组（HYP组,2﹪O₂、5﹪CO₂）、外泌体+低浓度氧共培养组（HYP+EXO组,2﹪O₂、5﹪CO₂）,MS-1细胞的血管形成能力;image J软件分析血管形成长度;PCR、Q-PCR检测血管内皮生长因子（VEGF） RNA水平的表达,Western Blot检测VEGF、HIF1α蛋白水平表达以及mTOR信号通路激活情况。采用单因素方差分析和SNK-q检验统计学分析。 结果超滤离心法富集的MSC条件培养基中的外泌体,大小为30 ~ 100 nm,表达CD9,CD63,CD81等外泌体表面标志物;血管形成试验结果显示,低氧促进MS-1血管生成,HYP+EXO组形成明显的血管网状结构;HYP+EXO组血管形成相对长度（2386.0±137.7）像素与NOR组（393.3±174.2）像素和HYP组（1467.0±230.0）像素相比增强,差异有统计学意义（t = 12.30,P?= 0.0065;t = 15.74,P = 0.0040）;PCR结果显示,HYP+EXO组VEGF相对表达量（20.26±9.972）较常氧对照组（1.000）和低氧组（6.521±3.501）均增强,差异有统计学意义（t = 5.462,P = 0.0009;t = 4.238,P = 0.0038）;同时,Western Blot结果显示VEGF蛋白水平表达升高,HIF1-α表达上调,mTOR发生磷酸化。 结论MSC外泌体可促进低氧条件下的小鼠胰岛内皮细胞血管生成。MSC外泌体可能通过上调HIF1-α,调节VEGF表达,激活mTOR信号通路,促进胰岛内皮细胞血管生成。