雌核发育银鲫的受精生物学研究——天然雌核发育银鲫繁殖方式的讨论

本文研究了同源雌核发育银鲫精子在4种类型的雌核发育银鲫卵中的发育特征。初步揭示了天然雌核发育银鲫根据精子的来源不同而分别具有二种不同的繁殖方式,对其在维持雌核发育银鲫种群生存,促使克隆分化等方面的独特的生物学意义进行了讨论。     

黑龙江方正银鲫雌核发育的细胞学初步探讨

雌核发育是一种特殊的繁殖方式,同种或异种精虫进入卵细胞内只刺激其发育,精虫头部并不形成有功能的雄性原核,结果卵细胞的发育只是在一个雌性原核的参与下进行(洛马索夫,1960)。许多研究报告证实银鲫用这种方式繁殖后代。Berg 1949年首次提出银鲫(Carassius auratus gibelio)雌核发育的假设,其后洛马索夫和哥洛温斯卡娅(1947,1954)用黑龙江移殖的银鲫雌鱼与鲫、野鲤、家鲤等雄鱼杂交,得到的后代完全与银鲫同型,并用细胞学方法证实了雄性精核在卵细胞的发育过程中没有与卵核融合。1966年,Cherfas报道了黑龙江一种雌核发育银鲫的染色体为三倍体。1971、1978年,小林弘先后发表了日本关东系三倍体银鲫(Carassius auratus lagsdorfii)雌核发育的细胞学研究报告,     

雌核发育银鲫和两性融合发育红鲤卵母细胞成熟的细胞学比较研究

对雌核发育银鲫和两性融合发育红鲤的卵母细胞成熟过程,进行了详细的细胞学比较研究。在银鲫卵母细胞成熟过程中,绝大部分卵母细胞的核物质,在胚泡破裂(GVBD)后的第一次成熟分裂时期,出现明显的不同于红鲤卵母细胞核的行为,其染色体逐渐清晰地分为三群,这三群染色体的发育既彼此独立又相互联系,最终形成一首尾相接的三极纺锤体。随后,三极纺锤体扭转、重叠、合并成为一个正常的中期纺锤体。但极少数银鲫卵母细胞也出现了类似于红鲤卵母细胞的成熟单星光,并进而发育成两极纺锤体,形态类似红鲤第一次成熟分裂中期纺锤体。在银鲫上述两类卵母细胞的成熟过程中均未观察到“第一极体”外排的现象。由此,我们确认,银鲫卵是通过第一次成熟分裂异常,卵核染色体不减数来维持染色体倍性的;并且,根据上述特殊现象,我们对银鲫卵子第一次成熟分裂异常的机制进行了初步分析。       

雌核发育进行银鲫遗传育种新进展

近年来,人工诱导雌核发育作为一种崭新的技术在鱼类遗传育种研究中正日益引起人们的普遍关注。银鲫作为天然雌核发育的代表,以其独特的生殖方式和重要的经济价值,在理论研究和生产实践中均具有重要意义,本文概要介绍了银鲫的生殖方式,天然群体中优良品系的选育、异源精子对银鲫子代的生物学效应及其在生产实践中的应用－异育银鲫的选育,以及结合染色体倍性操作技术培育四倍体复合鲫的研究近况及发展前景。     

草鱼人工雌核发育的细胞学观察

运用组织学方法研究了用紫外线辐射处理后的鲤鱼精子诱导草鱼卵子雌核发育的细胞学过程。结果表明精核在卵子内主要有２种变种（１）始终保持固缩状态,不形成雄性原核;（２）形成雄性原核。冷休克处理可破坏卵子第二次成熟分裂的纺锤体。冷休克处理后,室温孵化期卵子内变化有２种（１）卵子内重新形成了纺锤体和纺锤丝,其中部分卵子可排出第二极体;（２）卵子内纺锤体或纺锤丝不恢复。     

雌核发育银鲫微卫星突变速率和突变模式

银鲫是天然雌核发育的三倍体两性型种群, 因其遗传背景和生殖方式的特殊性, 已经成为研究单性和多倍体脊椎动物进化遗传学的理想模式鱼类。利用33个微卫星序列对雌核发育银鲫的突变速率和突变模式进行研究, 结果表明: (1) 22个子代个体中, 检测到1尾个体在15个微卫星位点具有18个突变等位基因; (2) 每个微卫星位点每代总体平均突变率是1.16×10-2, 95%置信区间是6.87×10-3~1.83×10-2, 与其他鱼类相比, 雌核发育银鲫的突变率明显偏高, 这与天然雌核发育鱼类处在单性生殖和两性生殖的过度阶段有密切关系; (3) 具有突变等位基因的13个位点的重复单元数目都在10次以上, 11个复合型微卫星位点的突变率(1.31×10-2)与21个完美型位点(1.00×10-2)的突变率没有明显差异(P = 0.67), 微卫星突变率受到重复单元数目的影响, 然而与重复结构类型和侧翼序列GC碱基含量无相关性; (4) 序列分析表明, 雌核发育银鲫的微卫星突变模式并不严格遵守逐步突变模型。     

雌核发育银鲫子代中微卫星特异序列分析

雌核发育个体的基因型基本上完全与母本相同,这是源于卵子发生过程中没有经过减数分裂.父本的遗传物质是在随机水平、亚基因组水平或基因组水平参与到子代的遗传重组过程,从而对长期突变积累的雌核发育生物基因组进行补偿,一直是遗传学家关注的问题.本文对雌核发育银鲫特异个体及父母本5个微卫星位点的扩增条带进行了克隆测序,相似性比对结果显示,特异个体所表现的父咎匾霥NA条带,序列结果与父本完全相同或相似(SCM4、SCM9、YJ5),并在某些位点上保留了母本的特异条带(YJ5),而个体本身特异的DNA条带与父母本的相似性均较高(SCM13).同时,所检测到的个体经越冬后查验为雌性个体,进一步进行同源繁育,研究变异条带在繁殖中的命运.连续2代的繁育检测结果表明,融合了父本特异性条带的银鲫个体在繁殖过程中仍行雌核发育的生殖方式,变异来的条带能够传递给子代,进一步证实同源雌核发育银鲫通过小概率两性融合事件丰富银鲫种群的遗传多样性[动物学报 53(3):537-544,2007].     

银鲫染色体组型研究

黑龙江水系的银鲫(Carassius auratus gibelio)属天然三倍体鱼类,是实行天然雌核发育的两性种群4,7。关于它的染色体数目和组型国内外报道为3n=1564。但是我们在银鲫天然雌核发育机制研究中,有时涉及染色体数目鉴定,常见染色体数目超过156。鉴于昝瑞光报道滇池高背型鲫染色体数目为3n=162,有10个超数染色体5,为此我们对黑龙江省方正县双凤水库的雌、雄银鲫进行了染色体组型研究。       

组织移植对银鲫不同雌核发育系的遗传监测

采用脾移植实验对银鲫3个不同的雌核发育系进行了遗传分析。在3个同系移植的组合中,移植物被接受的个体数平均达95%,表明同一雌核发育系的大多数个体具有一致的基因型。在不同雌核发育系间的移植,移植物在7—14天被排斥(21—30℃)。从而用组织移植证明这些雌核发育系是存在的,并与遗传标记所鉴别的结果一致。文中对同系移植中出现少数排斥现象的原因进行了讨论。       

银鲫种内的遗传标记及其在选种中的应用

用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分析了银鲫和异育银鲫的血清蛋白和肝脏酯酶,发现这两种鱼的血清蛋白和肝脏酯酶各具有4种不同的表型。由同一母本银鲫繁殖的子代——银鲫或异育银鲫,具有与母本相同的表型,只是在异育银鲫的肝脏酯酶谱型中另有一些无规律的变化,显然这是异源精子的作用所致。此外,这4种不同表型的鱼具有不同的生长能力,其差距最大可达50％．这些结果表明,天然雌核发育的银鲫种内含有若干个不同的雌核发育系,这对于开展银鲫的选育研究具有重要的实践意义。     

银鲫精子在两性融合生殖鱼类卵质中的受精特征

红鲤(♀)×银鲫(♂)的杂种胚胎均不能成活。受精细胞学研究结果表明,雌核发育银鲫的精核在两性融合生殖的鲤鱼卵质中能转化为雄性原核,并和雌性原核融合成合子核。但在卵裂开始后,可观察到某些异常现象,如染色体丢失,多极纺锤体形成,以及第二次卵裂时受精卵的两分裂球的非同步性分裂等。我们初步认为,雌核发育银鲫的染色体和两性融合生殖的鱼类染色体之间存在某种不相容性,表现为彼此间的互相排斥。出现这种现象可能和银鲫染色体组的雌核发育遗传背景有关。     

异育银鲫幼鱼对饲料中维生素K需求的研究

以不同维生素K水平(0.13、2.15、3.25、6.40、12、17.20和23.20 mg/kg饲料)的7种精制饲料喂养初始体重约为(2.17±0.01) g的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)10周, 每个处理3个重复, 研究异育银鲫对维生素K的需求量。结果显示: 饲料中维生素K的添加可以明显降低摄食率, 饲料中维生素K含量为2.15 mg/kg时, 摄食率出现最大值, 之后显著下降(P<0.05), 在12 mg/kg时达到最低值。特定生长率随着维生素K的添加表现出升高的趋势, 饲料中维生素K含量为12 mg/kg时, 出现最大值, 但是差异不显著(P>0.05)。饲料中维生素K的含量从0.13 mg/kg升至3.25 mg/kg时, 饲料效率显著升高(P<0.05), 随着饲料中维生素K的进一步添加, 趋于稳定(P>0.05), 在12 mg/kg时达到最大值, 并且与特定生长率呈正相关关系(SGR=0.01 FE+0.95, R²=0.95)。血液红细胞数目随着饲料维生素K含量的增加先显著升高(P<0.05), 在6.40 mg/kg时达到最大值, 之后趋于稳定(P>0.05)。血红蛋白含量、血球容积比、血清钙含量与血液中红细胞数目表现出相似的趋势, 均在不添加维生素K组出现最低值, 但是差异不显著(P>0.05)。肝体比、肥满度及鱼体生化组成均不受饲料维生素K水平的影响(P>0.05)。分别对饲料效率、红细胞数目进行折线回归得出异育银鲫幼鱼对维生素K的最适需求量为3.73—6.72 mg/kg饲料。     

两性型天然雌核发育彭泽鲫染色体组型的研究

彭泽鲫是一种两性型天然雌核发育群体。染色体组型分析结果表明：雌、雄鱼的染色体数目均为１６６。它们的核型组成是：３２条中部着丝点染色体、４０条亚中部着丝点染色体、１８条亚端部着丝点染色体和７６条端部着丝点染色体。臂数（ＮＦ）为２３８。本研究结果与其它雌核发育类型的鲫鱼有明显的差别。     

异育银鲫幼鱼对饲料中缬氨酸需求量的研究

通过65d的生长实验, 探讨饲料中不同缬氨酸水平对异育银鲫(Carassius auratus gibelio)幼鱼平均体重(3.17±0.01)g/尾生长性能、饲料利用和蛋白利用的影响, 确定异育银鲫对饲料中缬氨酸的需要量。实验设计由酪蛋白、明胶和晶体氨基酸为蛋白源的8种等氮(蛋白含量:38%)等能(总能:17.0 kJ/g)的半精制饲料, 其缬氨酸水平等梯度逐步升高(0.54、0.79、1.04、1.29、1.54、1.79、2.04、2.29%饲料干物质)。各实验饲料中缬氨酸的实测值分别为:0.66、0.85、1.07、1.22、1.46、1.70、1.86和2.12%饲料干物质。饲料中其他必需氨基酸含量参照异育银鲫肌肉氨基酸模式。每种饲料饲喂3个重复,每个重复30尾鱼,养殖于塑料方箱中(70 cm×55 cm×50 cm;水体容积:150 L), 养殖系统为室内流水系统(500 mL/min流速), 每天两次饱食连续投喂(9:00和16:00)。实验结果表明,饲料中适量的缬氨酸显著提高了异育银鲫的特定生长率、饲料转化效率和蛋白沉积率(P0.05), 但显著影响了血清谷氨酰胺的浓度(P0.05), 但不同的缬氨酸水平显著影响了鱼体灰分含量(P<0.05)。对各处理组异育银鲫特定生长率的结果进行二次回归分析, 结果表明满足异育银鲫最大生长的缬氨酸需求量为饲料干物质的1.72%, 即占饲料蛋白的4.53%。       

异育银鲫消化道微生物群落对恢复投喂的响应

以实验室养殖的异育银鲫（Carassius auratus gibelio）中科3号成鱼为对象, 利用PCR-DGGE技术比较研究了其经饥饿与恢复投喂后消化道微生物多样性的变化。实验共检测到23条谱带, 其中饥饿组、投喂组谱带数分别为18条和17条（共有谱带12条）, 投喂组大部分谱带亮度高于饥饿组。基于PCR-DGGE所得到的谱带进行的CA （Correspondence Analysis）分析和聚类都表明饥饿组与投喂组消化道微生物存在明显不同。结果表明, 在充分饥饿处理后, 恢复饲料投喂可导致消化道微生物种类减少及微生物平均密度的增加, 同时对消化道微生态系统内微生物种类组成有显著影响。研究为进一步阐述消化道微生物功能基因奠定了基础, 也为水产鱼类肠道菌群研究提供一些基础数据。