我国部分禽流感病毒H5N1之HA序列变异演化分析

从GenBank上获得我国人(Homo sapiens)、家禽和野鸟42株H5N1亚型禽流感病毒的HA基因核酸序列,利用DNAStar分析HA蛋白关键位点氨基酸残基的变化,比较HA基因核苷酸序列同源性,构建遗传进化树.探讨我国部分人、家禽和野鸟H5N1病毒基因的遗传进化关系.序列分析结果表明:禽流感病毒H5N1亚型的HA基因持续地发生着变异,但并非以均一速度进行,时间间隔愈长,核苷酸同源性愈低;我国同一地区或临近地区,当年或前后两年发生的人及家禽感染的禽流感病毒高度同源.推测我国部分人发生的禽流感可能是通过家禽感染的;候鸟的迁徙在传播病毒过程中所起的作用有待深入探讨.     

山东地区16株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)山东分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术对16株从山东不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,16个分离株的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;有7～9个潜在糖基化位点;受体结合位点除198位有变异,其他位点均较保守;234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征;16个分离株HA基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为96.3%～99.9%和97.1%～99.6%;16个分离株同属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a( )中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因 (HA) (GenBank DQ023145) 序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白. PCR 产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA. 在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法 (SOE) 用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a (+) 中,诱导表达获得正确的表达产物.Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应.利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型.本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础.     

鸽源H5N1亚型禽流感病毒株的HA和NA基因特征性分析

本研究自行设计合成两对特异性引物,通过RT-PCR扩增出1株鸽源H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）两个基因的cDNA片段,将它们成功克隆于pMD18-T载体上,然后进行序列测定。结果表明,HA基因全长1707bp,编码568个氨基酸, HA基因有7个糖基化位点,在裂解位点附近有连续6个碱性氨基酸（R-R-R-K-K-R）的插入,具有高致病性毒株的分子特征。受体结合位点的氨基酸分别为YWIHELY,左侧壁氨基酸为SGVSSA,右侧壁为NGQSGR;NA基因全长1350bp,编码446个氨基酸,NA基因有3个糖基化位点。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1基因的克隆及其序列分析

目的：克隆H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并分析其序列特性。方法：通过RT-PCR方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并对该基因片段进行测序,将此序列与数据库中不同时间、地点、宿主来源的H5N1亚型流感毒株NS1基因序列进行同源性比较。结果：获得了678bp的NS1全长基因,可编码225个氨基酸;其与毒株A／chicken／Jilin／hq／2003的同源性最高,二者的核酸和氨基酸的同源性分别为99．7％和99．1％。比对分析发现,该毒株NS1基因在第238-252位有15个核苷酸的缺失;进化树分析表明,它与1997年香港流行的H5N1亚型禽流感病毒毒株分别属于2个不同的分支。结论：克隆了一株H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并初步分析了其序列特性,为进一步研究NS1基因的功能奠定了基础。     

禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)HA基因的克隆及序列分析

禽流感是由A型流感病毒引起的禽的一种疾病综合症.1878年首次在意大利爆发流行,当时称该病为"鸡瘟".之后,许多国家和地区都有该病的报道,包括美国、英国、澳大利亚、爱尔兰、比利时、荷兰、法国、俄罗斯、加拿大、以色列、匈牙利、日本、中国(包括香港)等[1-3].     

抗体选择压作用下H9N2亚型禽流感病毒NA基因的变异

将LG1株H9N2亚型禽流感病毒在带有抗LG1株母源抗体的鸡胚中分4个独立系列连续传40代后,有3个系列从10～20代起在NA基因的#99位发生了可稳定遗传的碱基"G"到"A"的突变,并使氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸;有2个系列从20～30代起在#473位发生了可稳定遗传的由"A"到"G"的碱基突变,导致相应的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸,另一个传代系列在50代时也发生了同样的突变。在无抗体的鸡胚上的2个独立对照系列同样传了80代,在这2个位点没有发生突变,表明这2个突变与抗体的选择压相关。在抗LG1母源抗体阳性鸡胚的连续40代传代过程中,NA基因在有抗体组的四个传代系列碱基的非同义突变(NS)与同义突变(S)比为4.6(32/7),而在无抗体组NS/S比为2.0(16/8)。有抗体组NS/S值显著高于无抗体组,也显示出抗体的选择压作用。     

禽流感病毒H5N1全基因组克隆与分析

为明确广东地区分离的一株禽流感病毒H5N1的遗传背景,建立流感病毒反向遗传的平台。对该株禽流感病毒进行了空斑纯化与组织细胞培养,检测其在MDCK细胞中的增殖特性;利用H5N1病毒通用引物,通过RT-PCR对该病毒全基因组的8条片段进行全长克隆及测序分析;将H5N1的8条全长基因组片段分别插入反向遗传通用载体中,构建禽流感病毒H5N1的感染性克隆。结果表明,该H5N1毒株在MDCK细胞中可不依赖胰酶进行有效增殖与复制,可使MDCK细胞出现典型细胞病变,具有高致病性禽流感病毒的细胞增殖特征。RT-PCR克隆得到该H5N1毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS八条全长片段,经测序分析确认该毒株的基因序列,其内部编码序列出现多处突变,其中HA连接肽为多个连续碱性氨基酸,表明该毒株可不依赖胰酶进行有效复制,与细胞培养结果一致,未出现抗药性的遗传突变。PCR与测序证明,插入H5N1八个全长基因组片段的载体序列完全正确,表明成功构建了该毒株的感染性克隆。为明确病毒遗传信息,建立流感病毒反向遗传的平台,为进一步研究禽流感病毒相关疫苗提供了研究基础。     

中国H5N1禽流感病毒HA基因的分子进化分析

为了阐明中国H5N1禽流感病毒血凝素(HA)基因的分子进化规律,从GenBank下载中国近年来分离的27株禽流感H5N1病毒的HA基因,利用LaserGene软件包中的EditSeq程序剪切共同序列并翻译成氨基酸序列,与DNAMAN软件进行比对,并以LaserGene软件包中的MegAlign程序构建分子进化树,结合背景资料分析其传播流行规律。结果显示:①在HA裂解位点上游毗邻的位置,gdch04、gddu04、gxch0405、gxdu05、gxqu0502、hkcph05、stch05、stqu05、ynch0502株都缺失了三个碱基;②27株毒株在HA裂解位点上游毗邻的位置存在多个连续的碱性氨基酸;③来自广西的gxch0405、gxdu05、gxqu0502和来自香港的hkcph05、hkgh04的序列同源性很高,很可能与苍鹭的迁移有关;④来自广西的gxqu0502和来自香港的hkcph05亲源关系很近,很可能来自同一祖先。     

共表达H5亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效地抵抗高致病性H5亚型禽流感病毒的基因工程疫苗,将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p11SH5ANA。将p11SH5ANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5ANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5ANA。通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒。经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性。用105PFU的rFPV-11SH5NA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体。初步的动物试验表明,该重组病毒能使经肌肉注射攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%,显示出一定的应用前景。     

Highly pathogenic H5N1 influenza virus causes coagulopathy in chickens

Severe hemorrhage at multiple organs is frequently observed in chickens infected with highly pathogenic avian influenza (HPAI) A viruses. In this study we examined whether HPAI virus infection leads to coagulation disorder in chickens. Pathological examinations showed that the fibrin thrombi were formed in arterioles at the lung, associated with the viral antigens in endothelial cells of chickens infected intravenously with HPAI virus. Hematological analyses of peripheral blood collected from the chickens revealed that coagulopathy was initiated at early stage of infection when viral antigens were detected only in the endothelial cells and monocytes/macrophages. Furthermore, gene expression of the tissue factor, the main initiator of blood coagulation, was upregulated in the spleen, lung, and brain of HPAI virus-infected chickens. These results suggest that dysfunction of endothelial cells and monocytes/macrophages upon HPAI virus infection may induce hemostasis abnormalities represented by the excessive blood coagulation and consumptive coagulopathy in chickens.     

Inhibition of highly pathogenic avian H5N1 influenza virus replication by RNA oligonucleotides targeting NS1 gene

H5N1 avian influenza virus (AIV) has caused widespread infections in poultry and wild birds, and has the potential to emerge as a pandemic threat to human. In order to explore novel approaches to inhibiting highly pathogenic H5N1 influenza virus infection, we have developed short RNA oligonucleotides, specific for conserved regions of the non-structural protein gene (NS1) of AIV. In vitro the hemagglutination (HA) titers in RNA oligonucleotide-treated cells were at least 5-fold lower than that of the control. In vivo, the treatment with three doses of RNA oligonucleotides protected the infected chickens from H5N1 virus-induced death at a rate of up to 87.5%. Plaque assay and real-time PCR analysis showed a significant reduction of the PFU and viral RNA level in the lung tissues of the infected animals treated with the mixed RNA oligonucleotides targeting the NS1 gene. Together, our findings revealed that the RNA oligonucleotides targeting at the AIV NS1 gene could potently inhibit avian H5N1 influenza virus reproduction and present a rationale for the further development of the RNA oligonucleotides as prophylaxis and therapy for highly pathogenic H5N1 influenza virus infection in humans.     

禽流感特异性转移因子的制备及其免疫作用

目的制备禽流感病毒特异性转移因子并探讨其对禽流感灭活疫苗的免疫增效作用。方法用禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗免疫鸡,用国标血凝抑制方法检测病毒特异性血凝抑制抗体效价。当抗体效价达到高峰时,翅静脉采取外周血,分离淋巴细胞并制备细胞单层、传代后获得禽流感病毒H5N1血清亚型特异性转移因子。用所获得的特异性转移因子进行疫苗免疫增效试验。结果采用本法可获得禽流感病毒特异性转移因子。免疫增效试验表明,在进行禽流感病毒灭活疫苗免疫的同时使用禽流感病毒特异性转移因子,可在一定幅度内提高禽流感病毒抗体水平并能延长抗体维持时间。不同给药途径比较试验表明,口服途径给药的疫苗增效作用优于注射途径给药。结论通过淋巴细胞体外培养可以制备禽流感病毒特异性转移因子。禽流感病毒H5N1血清亚型特异性转移因子对禽流感病毒灭活疫苗具有明显的增效作用,且口服途径给药的疫苗免疫增效作用优于注射途径给药。     

Spread of H5N1 avian influenza virus: an ecological conundrum

The role of wild birds in the spread of influenza H5N1 virus remains speculative and the ecology of influenza A viruses in nature is largely unstudied. There is an urgent need for multidisciplinary studies to explore the ecology of avian influenza viruses in wild birds and the environment to support ecological interpretation of the source of disease outbreaks in poultry.     

H5N1亚型禽流感病毒进化的研究进展

由H5N1流感病毒引起的高致病性禽流感,在禽类之间广泛传播。当人类接触这些禽类时,可能会被感染并产生严重的呼吸道症状,且死亡率高达60%。血凝素(hemagglutinin,HA)是H5N1病毒中和抗体的主要抗原,为了便于对病毒的HA突变进行研究,根据HA遗传基因的差异远近,所有的H5病毒株都被划分在20个分支内。对于H5N1病毒进化的研究在禽流感疫苗的研制、禽流感大流行的预防等方面均具有重要意义。现对禽流感、H5N1病毒特征、血凝素的结构功能、H5N1病毒的分支以及病毒进化的研究进行概述。     

H5N1 avian influenza in China

H5N1 highly pathogenic avian influenza virus was first detected in a goose in Guangdong Province of China in 1996. Multiple genotypes of H5N1 viruses have been identified from apparently healthy waterfowl since 1999. In the years 2004–2008, over 100 outbreaks in domestic poultry occurred in 23 provinces and caused severe economic damage to the poultry industry in China. Beginning from 2004, a culling plus vaccination strategy has been implemented for the control of epidemics. Since then, over 35420000 poultry have been depopulated, and over 55 billion doses of the different vaccines have been used to control the outbreaks. Although it is logistically impossible to vaccinate every single bird in China due to the large poultry population and the complicated rearing styles, there is no doubt that the increased vaccination coverage has resulted in decreased disease epidemic and environmental virus loading. The experience in China suggests that vaccination has played an important role in the protection of poultry from H5N1 virus infection, the reduction of virus load in the environment, and the prevention of H5N1 virus transmission from poultry to humans. Supported by the Key Animal Infectious Disease Control Program of the Ministry of Agriculture, the Chinese National S&T Plan(Grant No. 2004BA519A-57), National Key Basic Research and Development Program of China (Grant Nos: 2005CB523005, 2005CB523200).     

An overview of the highly pathogenic H5N1 influenza virus

Since the first human case of H5N1 avian influenza virus infection was reported in 1997, this highly pathogenic virus has infected hundreds of people around the world and resulted in many deaths. The ability of H5N1 to cross species boundaries, and the presence of polymorphisms that enhance virulence, present challenges to developing clear strategies to prevent the pandemic spread of this highly pathogenic avian influenza (HPAI) virus. This review summarizes the current understanding of, and recent research on, the avian influenza H5N1 virus, including transmission, virulence, pathogenesis, clinical characteristics, treatment and prevention.