大肠杆菌中的蛋白质分泌

目前,在微生物遗传工程中应用的表达载体大多是指导目的基因在宿主的胞质中表达,尽管外源蛋白的产量可达菌体总蛋白的50％以上,但同时也存在不少缺点:(1)高水平表达的外源蛋白容易发生沉降、凝聚,难以重新折叠为正确构象,不易获得有功能的产品;(2)产品纯化工艺复杂;(3)对宿主有毒性作用,导致表达体系不稳定;(4)外源蛋白易被胞内蛋白酶降解。这使得微生物遗传工程的应用受到很大限制。 如果能使在胞质表达的外源蛋白分泌到胞外,既可纠正由子高表达所引起的种种不利。近十年开展了对E.coli中蛋白质定位的深入研究。E.coli的蛋白质最初都是在胞质合成的,通过分泌而定位于膜或周质。例如外膜蛋白A(OmpA)先以前体形式在胞质合成,然后借助信号肽的作用穿过内膜,在分泌过程中信号肽被切除成的成熟蛋白定位子外膜。现在许多作者利用E.coli分泌蛋白的信号肽序列与目的基因相融合,将外源蛋白分泌出胞质。如用碱性磷酸酶(phoA)的信号肽分泌人α干扰素,使产物的稳定性和产量都有所提高,并且可通过简单的物理技术得到产品。E.coli溶血素通过特殊的分泌机制穿越细胞膜分泌至培养基,现已尝试用该系统构建表达载体。 本文从信号肽的作用、成熟蛋白对分泌的影响、宿主在分泌中的作用、E.coli溶血素的分泌以及外源蛋白在E.coli中的分泌等几方面综述近几年研究E.coli蛋白质分泌的进展。     

原核基因工程中的包涵体

包涵体是原核基因工程的特有产物,其中表达的蛋白产物是以无活性、不溶解的形式存在。包涵体特性、蛋白回收及活性恢复是生物工程研究的重要课题。文章对包涵体特性、回收及产物提取,重组蛋白的复性及纯化作了综述。     

来源于玫瑰微球菌的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在大肠杆菌中的融合表达

设计引物克隆玫瑰微球菌QS412中麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的基因treZ,通过与pET-28a( )载体相连,转化入宿主菌E.coli BL21,进行发酵诱导。通过SDS-PAGE检测到外源基因在大肠杆菌中有很高的MTHase表达量,但大部分都以不溶性包含体形式存在。对菌体超声破碎全菌液检测酶活,结果显示了水解酶酶活。这是来源于微球菌属的麦芽寡糖基海藻糖水解酶首次获得基因克隆和活性表达,为进一步提高酶活、增大海藻糖产量奠定了基础。     

包含体内重组蛋白质的复性

具有临床、工业生产、药用功能的真核生物蛋白质的供给常常受到其天然来源的限制。可喜的是基因工程技术的发展使许多真核生物蛋白质能在细菌细胞中进行表达[1] 。大肠杆菌由于培养和基因操作容易而成为最受欢迎的表达系统 ,但是重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达常常导致以包含体形式存在的胞內聚集的变性蛋白质的形成。这种变性蛋白质的量可高达总的重组蛋白质量的95%。由于以包含体形式存在的聚集蛋白质分子不具有正确的三维结构 (天然结构 ) ,它们在水溶液中通常不溶解且没有活性 ,因此大肠杆菌中包含体的形成就意味着可溶性重组蛋白…     

猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定

通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF3全基因,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a（+）,构建pET28a-ORF3表达载体,转入E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达。Ni-NTA层析柱纯化表达蛋白,用SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA等方法分析鉴定表达产物。结果成功扩增到345 bp的目的基因;构建了重组表达载体pET28a-ORF3;转化宿主菌E.coli BL21 (DE3)后表达产物的相对分子质量在6.50~16.5 kDa之间,与预期表达的目的蛋白相对分子质量相符;表达的目的蛋白能与阳性猪源和人源血清发生特异性反应,证实其具有较好的反应原性。     

人α1型干扰素克隆菌的表达研究——I.内外源基因表达特性

在E.coli表达系统中,克隆的外源基因的表达水平往往有较大的差别。例如,Goeddel等构建的α干扰素克隆菌的产量达2.5×10~8u/l,而在Gray等构建的γ干扰素表达系统中,干扰素产量只有2.5×10~4u/l。这种差别及实际应用的要求推动了人们对影响外源基因表达的各个因素进行研究。过去几十年中,由于生物化学及分子生物学家们的努力,对E.coli内源基因表达调控的规律有了许多认识。目前在研究E.coli中克隆的外源基因的表达调控时,往往也是借鉴这方面的成果。 克隆菌E.coli MEC101(pBV37)含有一选择性标记Ap~r目的基因IFN,它们来源不同,就宿主而言分别属于内源基因和外源基因。本文就这两个基因的表达特性进行了研究和比较。     

抗人红细胞单链抗体与猪瘟E2蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

为构建具有凝集性、免疫反应性的双功能融合蛋白,本研究采用重叠延伸PCR方法将2E8ScFv(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和mE2(猪瘟病毒E2蛋白主要抗原编码区基因)拼接成融合基因2E8mE2,并插入原核表达载体pET-DsbA,将重组表达质粒pET-DsbA-2E8mE2转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)PlysS中进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,结果表明:2E8mE2融合基因在大肠杆菌中获得了表达,表达产物以包涵体形式存在,分子量约为65kDa,与预期的大小一致。分别采用亲和层析法和谷胱甘肽再氧化法对融合蛋白进行纯化和复性,红细胞凝集试验证实:2E8mE2融合蛋白复性效果良好,既能够与人红细胞结合,又能够与猪瘟病毒抗体反应,具有双功能特性。     

人Notch2受体胞内区基因N2ICD的原核表达、纯化和鉴定

[目的]构建含Notch2胞内区基因N2ICD的原核重组质粒,并在E.coli中表达。[方法]根据Gen Bank上N2ICD基因序列设计引物,用PCR从真核重组质粒p CMV-Tag4/N2ICD中扩增目的基因,克隆至携带GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中并转化E.coli BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集菌体经反复冻融、溶菌酶破菌、超声破碎后,通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达形式,表达产物经谷胱甘肽琼脂糖树脂glutathione sepharose 4B纯化并经Western Blot鉴定。[结果]PCR获取了目的基因人N2ICD,并成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-1/N2ICD,目的基因在E.coli中成功表达并以部分可溶性形式表达在上清中,纯化后经Western Blot鉴定表达产物分子量在110 k Da。[结论]重组N2ICD在E.coli中成功获得可溶性表达,为研究Notch2受体在细胞信号转导中的作用奠定了基础。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3融合蛋白的表达研究

利用PCR扩增得到粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆至pGEM-T,构建成GMCSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆至T7RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴定扫描分析,目的基因产物表达量占菌体总蛋白量的30%以上,目的基因表达产物以包涵体的形式表达。Westernblot鉴定表明,该表达产物可以与GM-CSF抗体及IL-3抗体特异性结合。目的基因表达产物经过包涵体变性、透析复性及柱层析纯化,用GM-CSF、IL-3依赖细胞株TF-1检测,具有明显的生物学活性。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

两种水生动物抗菌肽的原核表达及活性分析

将两种水生动物分泌的抗菌肽基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1两个融合蛋白表达载体,转化至E.coli Rosetta 中进行表达,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。融合蛋白经复性、酶切处理获得抗菌肽Y18和CEC1。抑菌实验结果表明:融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E. coli DH5α、S. aureus、B. subtilis和S. cerevisiae的生长。     

马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将马铃薯Y病毒普通系(PVY0)的外壳蛋白基因克隆到表达质粒pMAL-c2中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体pMAL-c2-PVY0CP.SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明,这一表达栽体在E.coli DH5α中经IPTG诱导可表达分子量为71.8kDa的特异性融合蛋白.以amylose resin亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为1:1024的特异性抗血清.用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Western blotting对PVY进行检测.     

大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因ibeB的编码产物为外膜蛋白前体

为进一步探讨大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因ibeB的生物学特性 ,将ibeB基因克隆到pET2 8a(+)载体 ,以E .coliBL2 1 (DE3)为宿主菌 ,经IPTG诱导后 ,通过Ni2 + NTA树脂提纯IbeB蛋白 .SDS PAGE确定纯化蛋白的分子量 ;应用无蛋白酶的体外转录和翻译系统进一步鉴定ibeB基因表达蛋白的分子量 ;通过 [3 5S]Met标记的体内T7表达体系并结合膜蛋白分离技术定位IbeB蛋白在细菌中的亚细胞分布 ;利用细菌侵袭实验分析IbeB蛋白抗体对E .coliK1侵袭人脑微血管内皮细胞的封闭作用 .结果发现 ,ibeB基因的重组蛋白表达纯化产物呈现出 5 0kD和 34kD两种分子量大小 ,5 0kD存在于表达细菌的可溶性部分 ,而 34kD则存在于包涵体中 ;体外翻译实验也显示出较弱的 5 0kD和较浓的 34kD两个蛋白带 ;体内T7表达体系实验显示 34kD的IbeB成熟蛋白定位于E .coli的外膜 ;抗 34kDIbeB蛋白抗体能封闭E .coli对人脑微血管内皮细胞的侵袭 .这些结果提示 ,大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因ibeB的编码产物为 5 0kD的外膜蛋白前体 ,该前体可通过分子内剪接形成成熟的 34kDIbeB蛋白     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

Hsh载体对外源基因在E. coli中高效表达的机制探讨

pHsh是根据大肠杆菌的热休克反应构建而成的新型表达载体, 受σ32调控。正常E. coli细胞的整个热休克反应持续时间约12 min, 而在携带有外源基因的高拷贝pHsh的E. coli细胞中, 外源基因却能持续高效表达4?10 h。为探求外源基因高效表达的机制, 以一个编码木聚糖酶的外源基因为代表, 首先研究了质粒拷贝数对木聚糖酶表达的影响, 接着通过Western-blot检测了携带质粒pHsh-xynIII和对照组携带pLac-xynIII的E. coli细胞在非诱导条件下(30 °C)和诱导条件下(30 °C→42 °C)胞内σ32的差异, 最后测定了不同温度下(30 °C、37 °C、42 °C、30 °C→42 °C)携带质粒(pHsh-xynIII)的E. coli细胞内稳定状态下热休克的水平(以木聚糖酶活性表征)。研究结果表明外源基因在pHsh中的高效表达是与3个方面密切相关的: pHsh质粒的高拷贝数增加了外源基因的剂量; pHsh的存在使E. coli细胞内σ32的水平较正常E. coli细胞显著增加了, 并最终增强了E. coli的热休克反应; 诱导状态下带有pHsh重组质粒的E. coli细胞内稳定状态下的热休克水平明显高于其它温度的水平。     

蛋白质复性研究进展

许多蛋白在大肠杆菌中高效表达时,其产物常以无活性的包含体形式存在,包含体蛋白的复性往往是制备这些蛋白的关键步骤之一,蛋白复性包括肽链折叠和分子内二硫键的氧化这两个互相影响的过程,本文综述了蛋白折叠过程的研究进展,及促进蛋白折叠和二硫键氧化的方法。     

南极衣藻谷胱甘肽-S-转移酶基因的表达及其对大肠杆菌低温耐受性的增强作用

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase, GST, EC2.5.1.18)是生物体内一种重要的抗氧化酶, 为阐明GST在南极衣藻(Chlamydomonas sp. ICE-L)中的具体地位, 采用实时荧光定量PCR对不同温度下南极衣藻的GST基因的表达进行了分析; 并构建了原核表达载体pET28a(+)-GST, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达, 通过平板培养法探讨了重组菌E. coli BL21(pET28a(+)-GST)对低温胁迫的耐受性。结果显示, GST在0℃时表达量最高, 最高可达对照组的两倍多; pET28a(+)-GST重组表达载体在E. coli BL21中实现了高效表达, 且主要以包涵体形式存在, 经HisTrap HP柱分离纯化获得高纯度的GST融合蛋白, 并通过SDS-PAGE及Western blot分析得以验证; 对低温胁迫实验发现南极衣藻GST蛋白的表达可以提高重组菌E. coli BL21对低温的耐受性, 说明GST基因对南极衣藻适应南极低温环境具有重要作用。     

生物转化法制备L-天冬酰胺

探索生物转化法制备L-天冬酰胺的技术与工艺。通过分子生物学方法,克隆来源于大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)JM109的天冬酰胺合成酶A基因asnA,并于E. coli BL21(DE3)中表达,利用构建的E.coli基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-asnA全细胞高密度催化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺,以PITC柱前衍生-高效液相检测底物和产物。表达的蛋白质分子质量约为37kDa,与预期大小相符,比酶活力为1786.6U/g。L-天冬氨酸转化率为95.8%,L-天冬酰胺产量可达126.5g/L,生产速率为15.81g/(L·h)。结果表明,已成功构建高效表达天冬酰胺合成酶A基因工程菌株,并用于催化L-天冬氨酸转化生产L-天冬酰胺,解决了L-天冬酰胺生物转化生产工艺中ATP成本过高的难题,为L-天冬酰胺制备提供新的绿色途径。