创新霉素分子中硫的生源研究

创新霉素产生菌——济南游动放线菌对天然含硫化合物的利用与微生物一般硫代谢的规律是一致的。     

创新霉素产生菌——济南游动放线菌的分类鉴定

放线菌3945是从山东济南土壤中分离出来的,产生一种新的抗菌素——创新霉素,形成孢囊,孢囊孢子微游动,极生鞭毛。在合成与有机培养基上,基内菌丝为紫色到深褐紫,培养基染成相应颜色。根据形态、培养特征、生理特性及抗菌性质的研究,放线菌3945有别于游动放线菌属(Actinoplancs)中的已知种,经鉴定认为是个新种,名之为济南游动放线菌(Actino-planes tainanensis n. sp.)。     

脱硫创新霉素对E.coli B的抗菌作用和抗菌原发作用

<正> 脱硫创新霉素是我所合成室用创新霉素进行脱硫反应制备的一个创新霉素衍生物,其分子结构为β—甲基吲哚丙酸。脱硫创新霉素虽然不具有创新霉素的噻喃环,但是实验结果说明:1.脱硫创新霉素对E.colib的抗菌作用与创新霉素相似。2.色氨酸能够恢复脱硫创新霉素对E.coli B的生长抑制作用和脱硫创新霉素对E.coli BT(Trp~-)的生长无抑制作用。这说明脱硫创新霉素的抗菌原发作用也和创新霉素一样是抑制色氨酸的生物合成。     

一株酸枣内生菌的鉴定及其抗菌活性物质的初步分离

为了从酸枣中筛选出内生菌并分析其代谢产物中的活性成分,用于开发和生产药物,该研究通过组织块分离法和划线分离法,从陕北野生酸枣植株体内分离得到内生菌,采用平板对峙法测定其对7株供试指示菌的抗菌活性,以心神宁片提取液为对照,对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析和高效液相色谱分析。结果表明:从野生酸枣中共分离得到121株内生菌,其中内生细菌49株,内生放线菌6株,内生真菌66株;通过抗菌试验,发现54株内生菌(细菌33株,真菌21株)对1～7种指示菌具有抗菌活性,占分离菌株总菌数的44.63%,其中A-04、A-05、B-03、C-03、C-06和D-04共6株菌株的抗菌谱较广,对7种供试指示菌均具有抑菌活性;薄层层析检测结果显示菌株B-03发酵产物在R_f值为0.46处有与酸枣提取液层析带迁移率相同的显色带,液相色谱分析结果显示其属于黄酮类物质;通过16S rRNA基因序列分析结果显示菌株B-03与Bacillus axarquiensis的相似性为99%。菌株B-03能发酵产生黄酮类或产生与黄酮类类似的化合物,表明酸枣内生菌具有合成黄酮类药物的潜力。     

创新霉素产生菌中质粒的研究——Ⅳ.AJP1质粒的物理图谱

用MAK法提纯创新霉素产生菌——济南游动放线菌中天然质粒AJP1,并对其进行了酶解分析。实验表明,限制性内切酶BamHⅠ、BglⅡ、HindⅢ、KpnⅠ、SstⅠ和HpaⅠ不能降解AJP1,XhoⅠ、PsiⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、PvuⅠ、SinaⅠ和SalⅠ在AJP1上分别有1、1、1、2、3、5,和7个切点。应用双酶解等方法进行酶切位点的定位,绘制了共有20个酶切位点的AJP1物理图谱。     

西沙群岛海域海洋放线菌的分离及其抗菌活性

分离西沙群岛海域放线菌并研究其抗菌活性。采用干燥、辐射、冷冻及加热处理等11种样品预处理方式和10种培养基对海洋放线菌进行分离,对代表性菌株进行鉴定,并考察分离放线菌生长的海水依赖性。进一步以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、啤酒酵母和扩展青霉为指示菌考察分离放线菌的抗菌活性。从西沙群岛海域样品中分离获得放线菌383株,其中专性海洋放线菌23株。选定93株代表菌株进行鉴定,93株菌隶属于9个科,11个属。不同培养基对分离放线菌菌株的数量及种类影响显著。6株放线菌对4种指示菌均有抑菌活性,其中4株为专性海洋放线菌,表明海洋环境具有丰富的放线菌资源,这些放线菌特别是专性海洋放线菌有望为新型抗菌物质的发现与开发提供菌种来源。     

游动放线菌科的研究IlI．游动放线菌属的三个新种

从北京土壤中分离出5株放线菌,经过形态,培养特征、生理生化、细胞壁组份及DNA中GC％含量的研究,这5株菌都形成孢囊,孢囊孢子有鞭毛,能游动,细胞壁组份11型,属于游动放线菌科中游动放线菌属。经与国内外已知种比较,定为三个新种：丛鞭毛游动放线菌新种(Actinoplanes tuftoflagellus n. sp．);梨形游动放线菌新种(Actinoplanes pyriforinis n. sp.)绛红褐游动放线菌新种(Actinoplanes purpeobrunneus n. sp.)。     

红树林链霉菌ZFSM1-146中抗菌活性物质的发现

【背景】红树林来源的放线菌蕴含着丰富的次级代谢产物资源,是挖掘小分子药物的重要来源。【目的】对红树林放线菌天然产物进行研究,分离和鉴定其中的抗菌活性化合物。【方法】采用稀释涂布平板法分离纯化红树林土壤中的放线菌,通过琼脂块法初筛和滤纸片法复筛获得具有抗菌活性的放线菌;基于16SrRNA基因序列分析和系统发育树构建确定目标放线菌种类;通过高效液相色谱法对目标放线菌的发酵产物进行分析,采用硅胶柱层析和高效液相色谱分离技术结合的活性追踪法纯化抗菌活性物质;经高分辨电喷雾电离质谱和核磁共振波谱技术鉴定抗菌活性物质的结构。【结果】从红树林土壤中筛选到一株抗菌活性较强的放线菌ZFSM1-146,16SrRNA基因序列及其基因片段构建的系统发育树分析初步确定其为抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus);菌株ZFSM1-146可产生抗菌活性化合物1-3,化合物1-3经结构鉴定分别为放线菌素X_(Oβ)、X_2和D。经培养基初步优化,抗菌活性最强的放线菌素X2的产量约达到原来的2倍。【结论】从红树林土壤中筛选出一株可产生抗菌活性物质的抗生链霉菌ZFSM1-146,并鉴定出3个抗菌活性成分均为放线菌素类化合物,为后续进行放线菌素的产量优化和通过分子遗传手段进行结构改造提供了宝贵的菌种资源。     

枯草芽孢杆菌B-903菌株抗菌物质的研究

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-903菌株系从郑州苹果园中分离得到,其代谢产生的抗菌物质对多种植物病原真菌有强抑制作用。试验结果表明,将B-903菌株摇床培养24小时,细菌数量以对数增长达最大值;培养41小时,抗菌物质开始检出,此时培养液pH值由6．5变为7．5,以后随细菌数量减少和pH值的回降,抗菌物质逐渐积累,于培养112小时达最高值。作者认为该物质是细菌衰亡过程中产生的代谢产物。培养过程中的供氧条件影响细菌数量的增长和抗菌物质积累。B-903抗菌物质为水溶性物质,常温下,酸、碱条件不破坏该物质活性,酸性环境中,该物质具热稳定性。     

游动放线菌科分类的研究II.游动放线菌属的四个新种

从我国土壤中分离出35株游动放线菌,细胞壁组份为II型,即含有内消旋二氨基庚二酸和甘氨酸。根据形态、培养特征和生理生化特性的系统研究,定为4个新种：桔橙游动放线菌新种(Actlnoplanem ourantlacus n. sp. 71—C38);粉红孢囊游动放线凶新种(Actinoplanesroseosporangius n. sp. 71-C29);淡桔橙游动放线菌新种(ActlnoplaneJ pallido-aurantiacusn. Sp. C);赭红孢囊游动放线菌新种(Actinoplanes rutilosporangius n. sp．71-C6)。     

铜绿假单胞菌抗菌物质对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌活性研究

目的观察铜绿假单胞菌抗菌物质对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus,MRSA)的体外抑菌活性。方法用交叉划线接种方法进行铜绿假单胞菌对32株耐甲氧西林金葡菌的体外抗菌活性的测定。结果铜绿假单胞菌抗菌物质对MRSA的体外抑菌活性良好,产生色素的菌株的抗菌活性最好,15株铜绿假单胞菌中,7株产蓝绿色色素的铜绿假单胞菌,对MRSA的抑制率均达到了100%,平均抑菌带的宽度为37.7 mm。结论铜绿假单胞菌抗菌物质对32株MRSA具有较强的抗菌活性,无疑对MRSA感染的抗菌药物研制方面开辟了一条新的途径。这是国内的首次研究报道。     

大环内酯类化合物产生菌的基因筛选及其代谢产物研究

应用Ⅰ型聚酮合酶(PKS-I)基因筛选体系从32株海洋放线菌中寻找大环内酯类化合物的潜在产生菌,通过DNA序列相似性比对从5株阳性菌株中筛选获得了游动放线菌Actinoplanes sp.FIM060065。采用HPLC制备色谱从该菌株发酵液中分离纯化得到一个大环内酯类化合物FW060065,紫外、质谱以及核磁共振波谱分析表明它与台勾霉素B同质,药敏实验表明其对艰难梭菌、消化链球菌、双歧杆菌等革兰氏阳性厌氧菌显示出较强的抗菌能力。本研究通过基因筛选获得了台勾霉素的产生菌及其相应的代谢产物,为Ⅰ型聚酮合酶基因与大环内酯类化合物之间的联系提供了证据。     

放线菌Streptomyces sp．FJ3的核糖体工程改良与活性产物的分离

[目的]利用核糖体工程抗性筛选技术,获得有抗菌活性突变株,并对突变株新产生活性物质进行研究.[方法]以三峡库区筛选出的无抗菌活性放线菌野生株为出发菌,通过单菌落挑选与平板划线培养,分离筛选具有链霉素和利福平抗性突变株;通过摇瓶发酵和对发酵液进行纸片法活性测定,获得抗金葡菌活性突变株;采用高效液相色谱法(HPLC)分析其发酵液组分,通过LC-MS对变化峰进行分析;进行16S rDNA及形态学鉴定.[结果]链霉素和利福平对放线菌菌株FJ3的MIC分别为0.5μg/mL和110μg/mL;在FJ3突变菌株中,共获得24株链霉素突变菌株和20株利福平突变菌株,抗菌活性筛选显示6株具有抗菌活性,其中2株链霉素突变菌株对金葡菌有强抑菌活性,采用Doskochilova溶剂系统纸层析结果表明,该活性物质为一种核酸类抗生素,HPLC和LC-MS显示该活性物质可能为硫藤黄菌素.[结论]利用核糖体工程技术可以改变放线菌的次级代谢,获得具有生物活性的突变株,拓展药源放线菌活性菌株新资源.     

链霉菌TJ430的鉴定及产物结构

【目的】通过对分离获得的土壤耐热放线菌株进行鉴定,并对该菌株产生的抗菌活性产物进行分离纯化和结构解析,达到判定该菌株归属及其产物新颖性目的。【方法】采用干热法对土壤样品进行前处理;采用经改良的HV培养基分离土壤耐热放线菌;通过琼脂块快速初筛法对分离获得的耐热放线菌进行生物活性快速评价;分别采用形态学观察法、细胞化学组分分析法、生理生化及酶学特征分析、16S rDNA序列分析、DNA杂交法,对分离获得的编号为TJ430的菌株进行菌株鉴定;采用柱层析法和制备色谱法,对发酵获得的有效成分粗提物进行分离纯化;采用红外光谱法、高分辨质谱法对分离获得的生物活性成分代谢产物进行结构探索。【结果】共分离获得570株耐热放线菌;抗菌活性快速初筛表明,编号为TJ430的菌株表现出优良的抗卵菌及广谱抗真菌活性;采用多种方法对菌株TJ430进行鉴定,结果表明该菌株为一株卡吾尔链霉菌;最终分离获得了纯度高达98%以上的有效成分纯品化合物;该有效成分的分子式为C40H66N3O11,分子量为765;分子中应含有亚胺基、甲基、亚甲基、羰基、共价双键、异丙基等化学基团。【结论】目前对该抗菌活性成分的详细化学结构研究尚有待深入,但该抗菌活性成分极有可能是一种新型化合物,具有较好的开发应用前景。     

脱硫创新霉素对E.coli BT色氨酸途径酶合成的阻遏作用

<正> 将E.coli BT(Trp~-)从阻遏条件转入去阻遏条件培养时,加入脱硫创新霉素,测定药物对色氨酸途径酶(ASase和TSase)合成的阻遏作用。实验结果证明:脱硫创新霉素的抗菌作用机制和创新霉素一样是阻遏色氨酸途径酶的生物合成。其50%的阻遏浓度为4—5μm,和创新霉素相似。实验结果也说明,创新霉素结构中的噻喃环对阻遏作用不是必要的,     

大豆根腐病生防菌KJB04-11的鉴定及其产生的脂肽类抗生素

从大豆根围筛选到1株对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌都具有很好拮抗作用的菌株KJB04-11,经形态观察、生理生化特征和16SrDNA序列分析,属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。具有抗菌活性的KJB04-11发酵液无菌滤液对热和酸碱具有较强的稳定性。采用SephadexG-25柱层析、反相HPLC和冷冻干燥从KJB04-11发酵液中分离纯化了抗菌活性成分。由红外光谱、MALDI-TOF-MS、氨基酸组成及脂肽合成酶基因扩增结果推测该菌株产生的抗菌物质为C16、C17的mycosubtilin和C15的surfactin。田间试验表明,大豆种子经KJB04-11发酵液包衣处理对大豆根腐病防效为53.6%,大豆产量提高12.5%。     

创新霉素产生菌吲哚丙酮酸甲基转移酶的研究

在创新霉素产生菌济南游动披线菌的无细胞提取物中检测到吲哚丙酮酸甲基转移酶活性,并进行了分离提取。该酶能利用S-腺苷-L-甲硫氨酸对吲哚丙酮酸进行甲基化,它可能作用于创新霉素中间体的甲基化。经过硫酸铵分部盐析和DEA F一纤维素柱层析,得到了纯化60倍的甲基转移酶,比活0．66mu／ms。酶的最适底物是吲哚丙酮酸,最适pH7．5,对于底物s一腺苷一L一甲硫氨酸和吲哚丙酮酸的米氏常数(KⅢ)分别是4×10-,mol／L和1．8×10-7moI／L。用Sephadcx G-150凝胶过滤测得分子量是55000士5000道尔顿。     

大连地区海泥样品中分离的五株海洋放线菌的研究

对从大连小平岛地区海面下10~20 m处的海泥样品中分离的5株海洋放线菌进行了生理特征和抗菌活性的研究。抗菌活性实验初步表明,菌株S097,S187和S233具有较好的拮抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌测试菌株的活性,尤其是菌株S233对绿脓杆菌和白色假丝酵母的抑制活性很强。16 s rDNA序列分析结果表明,5株放线菌(S097,S187,S233,S239,L180)分别与Streptomyces argenteolusCGMCC 4.1693、S.flavofuscusNRRL B-8036、S.variabilisNRRL B-3984T、S.lit-m ocidiniNRRL B-3635和S.sulphureusNRRL B-1627T显示出最高的序列同源性(99%),这是这些菌种首次报道在大连地区的海泥样品中得到分离。利用I型聚酮合成酶(PKSI)兼并引物从菌株S187中扩增出了PKSI片段,揭示了该菌株生产I型聚酮类化合物的潜在能力。本文的研究结果为进一步开发利用大连地区海泥中的海洋放线菌资源奠定了基础。     

放线菌与枯草芽孢杆菌的共培养及其对活性次生代谢产物的影响

为探讨共培养对放线菌产生活性次生代谢产物的影响,结合抗菌活性测定及HPLC-PDA分析,研究了22株放线菌的单培养及其与枯草芽孢杆菌的共培养发酵代谢产物的差异,并选取抗菌活性较强的链霉菌FXJ2.014进一步研究其代谢产物。发现FXJ2.014、FXJ1.296、AS4.1252三株菌与枯草芽孢杆菌共培养时产生其在相同条件下单培养时没有的物质,其中链霉菌FXJ2.014单培养时主要产生醌霉素A,共培养时产物中增加了醌霉素结构类似物FXJ2.014-HB。进一步的抗菌、抗肿瘤活性测定结果表明,两者的生物活性有较显著的差异,且FXJ2.014-HB对多种肿瘤细胞系的抑制活性普遍弱于高毒性的醌霉素A,为有潜力的细胞毒性较小的抗生素。共培养是一条很有希望的发掘放线菌活性次生代谢产物的新途径。     

西藏湖泊放线菌的分离鉴定及抗菌活性测定

勘探西藏湖泊沉积物样品中放线菌资源并进行抗菌活性研究,以期发现可以产生新颖活性物质的药用放线菌资源。采用4种分离培养基,以稀释涂布法对西藏地区7个湖泊沉积物样品中的放线菌进行分离,通过分离菌株16S rRNA基因序列分析确定种属分类。采用纸片扩散法进行体外抗菌活性测定,以感染病原菌的秀丽隐杆线虫模型进行体内抗菌活性测定。结果显示,分离获得73株放线菌,分属于4个目5个科8个属,其中链霉菌属和小单孢菌属为优势菌属。至少对一种检定菌表现为阳性的菌株有55株,阳性率为75.3%。8株放线菌具有线虫体内抗菌活性,其中菌株PF188的体内外抗菌活性较好,其16S rRNA基因序列与最近有效菌株Nonomuraea guangzhouensis NEAU-ZJ3~T的相似度为98.13%,为Nonomuraea属潜在新种。西藏湖泊沉积物含有丰富的放线菌资源,是新抗生素发现的潜在药源。