伪狂犬病毒立即早期基因5’端特异性反义RNA对病毒增殖的影响

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科,基因组为线状双链DNA,长约150kb,至少可编码70～100种蛋白质。根据伪狂犬病毒感染细胞后DNA转录、表达时间的先后可将PRV基因分为立即早期基因(Immediateearly gene),早期基因(Early gene)和晚期基因(Late gene),这三类基因依此以级联方式调节。     

长链非编码RNA CTO-S对伪狂犬病毒复制的影响

[目的]研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)CTO-S对于病毒复制的影响.[方法]利用3'RACE和5'RACE鉴定CTO-S的全长序列.验证CTO-S是否具有编码多肽的能力.Red重组方法构建CTO-S缺失株以及回复突变...     

伪狂犬病毒蛋白激酶基因的PCR扩增及其克隆鉴定

以ＢＨＫ－２１细胞单层上增殖的伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）,经离心浓缩后,用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ消化法分离纯化ＰＲＶ基因组ＤＮＡ。参照ＰＲＶＫａ株和ＮＩＡ－３株蛋白激酶（ＰＫ）基因的ＤＮＡ序列,设计并合成了一对长度为２６ｂｐ和３２ｂｐ的引物,以纯化的ＰＲＶ基因组ＤＮＡ为模板,用ＰＣＲ技术成功地扩增出我国伪狂犬病毒地方株的ＰＫ基因,并将它克隆于ｐＵＣ１９载体。酶切分析结果表明,所获ＰＫ基因克隆在ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ和ＳａｌＩ上的切点与ＰＲＶＮＩＡ－３株相同。为下一步进行ＰＫ基因的体外缺失和重组,以构建减毒的ＰＫ缺失疫苗株奠定了基础。     

用狂犬病毒核蛋白基因小干扰RNA库抑制狂犬病毒复制和感染的研究

采用RNaseⅢ消化长片段双链RNA的方法,制备了狂犬病毒N基因、P基因和G基因小干扰RNA库(siRNACocktail)。将siRNA转染BSR和MNA细胞单层后,采用直接免疫荧光法观察发现,N基因siRNACocktail能够对RV的复制和感染产生明显和稳定的抑制作用,并且通过RT-PCR在转录水平探测到mRNA产量的降低;而P基因或G基因siRNACocktail对RV的复制和感染不产生或仅产生弱的抑制作用。这一结果为RNA干扰在RV研究中靶基因的选择及进一步的应用提供了依据。     

用狂犬病毒核蛋白基因小干扰RNA库抑制狂犬病毒复制和感染的研究

采用RNase Ⅲ消化长片段双链RNA的方法,制备了狂犬病毒N基因、P基因和G基因小干扰RNA库(siRNA Cocktail).将siRNA转染BSR和MNA细胞单层后,采用直接免疫荧光法观察发现,N基因siRNA Cocktail 能够对RV的复制和感染产生明显和稳定的抑制作用,并且通过RT-PCR在转录水平探测到mRNA产量的降低;而P基因或G基因siRNA Cocktail对RV的复制和感染不产生或仅产生弱的抑制作用.这一结果为RNA干扰在RV研究中靶基因的选择及进一步的应用提供了依据.     

人巨细胞病毒立即早期基因功能的研究进展

人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）是一种重要的病毒,属于疱疹病毒科,在普通人群中的感染率为８０％以上,对于某些特殊地区和人群,其感染率可高达１００％。人群感染ＨＣＭＶ后,通常呈隐性感染,但对于孕妇和免疫能力低下者（如器官移植病人、艾滋病患者）,该病毒易导致严重...     

伪狂犬病毒UL49基因核定位信号的初步确定

伪狂犬病毒UL49基因编码的蛋白VP22是一种皮层蛋白,其生物学功能尚不清楚。预测并确定PRV UL49的核定位信号,可为研究其编码蛋白VP22的蛋白转导功能及作用机理奠定基础。通过生物信息学软件分析预测到,PRV UL49基因存在潜在的两个核定位信号:5~21位氨基酸序列(RKTRVA ADETASGARRR)NLS1和241~247位氨基酸序列(PGRKGKV)NLS2。本文将实验分为对照组、NLS1和NLS2同时缺失组、NLS1缺失组和NLS2缺失组四组,并通过PCR扩增、分子克隆等技术获得PRV Ea株UL49基因。以pEYFP-N1为载体,将UL49基因及各组缺失或突变片段插入EYFP上游,成功构建PRV pUL49-EYFP重组质粒及一系列缺失突变体,转染COS-7细胞后观察荧光定位。实验结果表明,确认预测到的NLS1和NLS2具有核输入功能,且位于241-247位的氨基酸序列(PGRKGKV)的入核功能更强,5~21位氨基酸序列(RKTRVA ADETASGARRR)为双向核定位信号,其同时具有核输出的功能。     

靶向C—Raf-1基因的反义核酸抗乙型肝炎病毒活性研究

目的：通过体内外实验验证靶向c-Raf-1基因的反义核酸是否具有抑制乙型肝炎病毒（HBV）的活性。方法：设计靶向c-Raf-1基因的反义核酸,并在细胞水平进行体外抗HBV活性筛选,通过RT-PCR检测c-Raf-1基因mRNA水平的变化,通过体内药效学实验进一步验证反义核酸的抗HBV效果。结果：经体外筛选,靶向c-Raf-1基因的反义核酸Raf-3145具有相对明显的抑制HBV表面抗原（HBsAg）的作用,并可剂量依赖性地抑制c-Raf-1基因的表达;体内药效学结果显示,反义核酸Raf-3145在30 mg/kg剂量下对HBsAg的表达具有一定的抑制作用。结论：经体内外活性评价,初步确定了靶向宿主基因c-Raf-1的反义核酸具有一定的抑制HBsAg表达的活性,也进一步验证了c-Raf-1基因可以作为抗HBV药物设计的候选靶点。     

反义RNA抑制猪传染性胃肠炎病毒复制的研究

根据反义RNA作用原理,设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因(26888—27184)区的反义RNA序列。将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN—N5’,并与质脂体共转染PA317细胞,经G418(500μg／ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆。取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的假病毒滴度,用高滴度假病毒感染IBRS2细胞。提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA,通过PCR和RT_PCR证明PL,XSN—N5’整合到IBRS2细胞基因组。病毒感染细胞病变表明,反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用。     

反义RNA抑制猪传染性胃肠炎病毒复制的研究

根据反义RNA作用原理,设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因(26888-27184)区的反义RNA序列.将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN-N5',并与质脂体共转染PA317细胞,经G418(500μg/ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆.取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的假病毒滴度,用高滴度假病毒感染IBRS2细胞.提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA,通过PCR和RT-PCR证明PLXSN-N5'整合到IBRS2细胞基因组.病毒感染细胞病变表明,反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用.     

利用靶定基质蛋白基因m的小干扰RNA抑制2009甲型H1N1流感病毒的复制

目的:设计、构建并筛选针对流感病毒基质蛋白基因m的小干扰RNA(siRNA),检测其对2009甲型H1N1流感病毒复制的抑制效果。方法:设计3条针对流感病毒m基因的siRNA,并克隆到短发夹型(shRNA)siRNA表达载体pSilencer2.1-U6-hygro上;经测序证明构建成功后,将表达3种siRNA的质粒和阴性对照质粒psiRNA-control分别转染MDCK细胞,用潮霉素筛选稳定表达细胞株,用H1N1流感病毒感染细胞,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果。结果:构建了3个针对流感病毒m基因的siRNA表达质粒,3种siRNA均使m基因的mRNA水平降低,其中M1-306的抑制效率达60%;3种siRNA均使流感病毒NA蛋白的表达量降低,M2-25、M1-105的抑制效率明显,M1-306略低。结论:针对m基因的siRNA可以有效抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。     

RNA 干扰技术抑制病毒复制的研究进展

RNA干扰是指dsRNA抑制细胞内同源基因表达的现象,RNA干扰现象自发现以来在短短的几年里,已成功地用于不同种属的生物研究。dsRNA不仅参与内源基因表达调控,而且能够抑制宿主内病原微生物基因的表达,参与构筑生物体的防御机制。近年来,运用RNAi技术在哺乳动物中的研究不断深入,尤其是抑制病毒复制的研究成果令人欣喜,这为人类动物抗病毒治疗提供了新的思路。     

Small Interfering RNA Targeting M2 Gene Induces Effective and Long Term Inhibition of Influenza A Virus Replication

RNA interference (RNAi) provides a powerful new means to inhibit viral infection specifically. However, the selection of siRNA-resistant viruses is a major concern in the use of RNAi as antiviral therapeutics. In this study, we conducted a lentiviral vector with a H1-short hairpin RNA (shRNA) expression cassette to deliver small interfering RNAs (siRNAs) into mammalian cells. Using this vector that also expresses enhanced green fluorescence protein (EGFP) as surrogate marker, stable shRNA-expressing cell lines were successfully established and the inhibition efficiencies of rationally designed siRNAs targeting to conserved regions of influenza A virus genome were assessed. The results showed that a siRNA targeting influenza M2 gene (siM2) potently inhibited viral replication. The siM2 was not only effective for H1N1 virus but also for highly pathogenic avian influenza virus H5N1. In addition to its M2 inhibition, the siM2 also inhibited NP mRNA accumulation and protein expression. A long term inhibition effect of the siM2 was demonstrated and the emergence of siRNA-resistant mutants in influenza quasispecies was not observed. Taken together, our study suggested that M2 gene might be an optimal RNAi target for antiviral therapy. These findings provide useful information for the development of RNAi-based prophylaxis and therapy for human influenza virus infection.     

伪狂犬病毒gI基因的克隆表达及其对病毒增殖的影响

从伪狂犬病毒(PRV)国内地方分离Ea株基因组DNA片段中克隆了完整的gI基因,序列分析结果表明,gI基因编码区全长1101bp,可编码366个氨基酸残基,二级结构预测具有典型I型膜蛋白特征。与GenBank中收录的国外Rice株的同源比较发现,Ea株gI在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处突变,尤其是潜在胞浆区中连续两个碱基的缺失导致移码突变,致使gI基因的读码框架后移,从而导致Ea株gI较rice株长16个氨基酸残基。将gI基因克隆到真核表达载体pcDNA31+中的人巨细胞病毒早期启动子下游,构建的真核表达质粒转染PK15细胞,间接免疫荧光检测证实gI获得正确表达。进一步测定天然缺失gI的PRV弱毒Bartha株在表达gI细胞系和空白载体转染的对照细胞系中的蚀斑形成单位(pfu)和组织细胞培养半数感染量(TCID50),结果显示：Bartha株在表达gI细胞系中的pfu和TCID\-\{50\}分别为对照细胞系的164%和200%。说明gI具有促进病毒增殖的功能。     

Inhibition of Influenza Virus Replication by Targeting Broad Host Cell Pathways

Antivirals that are currently used to treat influenza virus infections target components of the virus which can mutate rapidly. Consequently, there has been an increase in the number of resistant strains to one or many antivirals in recent years. Here we compared the antiviral effects of lysosomotropic alkalinizing agents (LAAs) and calcium modulators (CMs), which interfere with crucial events in the influenza virus replication cycle, against avian, swine, and human viruses of different subtypes in MDCK cells. We observed that treatment with LAAs, CMs, or a combination of both, significantly inhibited viral replication. Moreover, the drugs were effective even when they were administered 8 h after infection. Finally, analysis of the expression of viral acidic polymerase (PA) revealed that both drugs classes interfered with early events in the viral replication cycle. This study demonstrates that targeting broad host cellular pathways can be an efficient strategy to inhibit influenza replication. Furthermore, it provides an interesting avenue for drug development where resistance by the virus might be reduced since the virus is not targeted directly.     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制及基因表达研究进展

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指由21～23个核苷酸组成的双链RNA(dsRNA)所引发的生物细胞内同源基因转录后沉默的现象,是生物体在进化过程中普遍存在的一种基因调控机制。目前对由乙型肝炎病毒(HBV)引起的病毒性肝炎尚无令人满意的治疗效果,而RNA干扰技术的出现为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。本文对RNA干扰抑制HBV复制及基因表达的研究现状、存在问题及应用前景进行了综述。