改造后的大肠杆菌氨基酸产量可望成倍增长

应用遗传工程学技术又获可喜成果。主要研究氨基酸、色氨酸生产方法的大阪大学工程学部的发酵工程数研室(合叶修一教授)研究小组,用大肠杆菌产生色氨酸研究成功。产生色氨酸的量是当代所采用的发酵法的两倍。 大肠杆菌以葡萄糖为原料,经过五种酶的复杂的连续地反应可以合成色氨酸。在一     

DL-5-甲基色氨酸的化学合成

<正> DL-5-甲基色氨酸是色氨酸的一种衍生物,它和其它衍生物一起(如DL-5-氟-色氨酸)主要用于处理色氨酸发酵产生菌,从而获得抗类似物高产菌株,在此基础上,利用重组DNA技术,进一步获得“工程菌株”,因此,它是色氨酸发酵科研中的一     

温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响

目的：研究变温控制对大肠杆菌TRTH L-色氨酸补料分批发酵过程中生物量、色氨酸产量、比生长速率及质粒稳定性的影响。方法：利用5L自控发酵罐对L-色氨酸补料分批发酵过程进行温度控制,对不同温度下相关参数进行分析比较,确定优化的温度控制方案。结果：以30-36％顺序升温的工艺进行发酵得到理想结果,与单一温度控制策略相比,L-色氨酸产量提高了15．4％;色氨酸的比合成速率提高了21．6％;质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平。结论：温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵有重要影响。     

模块化工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸

L-色氨酸作为一种必需氨基酸,广泛应用于食品、饲料和医药等领域。目前,微生物法生产L-色氨酸存在转化率低等问题。为此,本研究通过敲除L-色氨酸操纵子阻遏蛋白(L-tryptophan operon repressor protein, trpR)、替换l-色氨酸弱化子(trpL)、引入抗反馈调节的aroG^fbr等,获得可积累11.80 g/L L-色氨酸的底盘菌株大肠杆菌(Escherichia coli)TRP3。在此基础上,将L-色氨酸合成途径分为中心代谢途径模块、莽草酸(shikimic acid, SA)途径至分支酸(chorismic acid, CHA)模块、分支酸至L-色氨酸模块,并借助启动子工程,通过平衡中心代谢途径模块、莽草酸途径至分支酸模块、分支酸至L-色氨酸模块,获得工程菌E.coli TRP9。在5 L发酵罐中,工程菌E.coli TRP9的L-色氨酸产量提升至36.08 g/L,糖酸转化率提升至18.55%,达到理论转化率的81.7%。本研究利用模块工程策略,构建了高产L-色氨酸生产菌株,为l-色氨酸的规模化生产奠定了良好的基础。     

大肠杆菌trpBA基因的克隆表达

目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b( )中,得到重组质粒pet22b( )-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b( )-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。     

Optimization of L-tryptophan fermentation conditions from recombinant Escherichia coil

为了提高重组大肠杆菌FB-04/pSV-04发酵生产L-色氨酸的产量,减少代谢副产物乙酸的生成,考察了比生长速率和无机盐对重组大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响.在确定了合适的比生长速率和无机盐浓度之后,乙酸积累很少,L-色氨酸的产量为53.4 g/L,比优化前提高了141.6％.经30 L发酵罐初步放大,L-色氨酸的产量达53.6 g/L,发酵结果稳定,具有工业化应用前景.     

重组大肠杆菌生产L-色氨酸发酵条件优化

为了提高重组大肠杆菌FB讲／pSV－04发酵生产L－色氨酸的产量,减少代谢副产物乙酸的生成,考察了比生长速率和无机盐对重组大肠杆菌发酵生产L．色氨酸的影响。在确定了合适的比生长速率和无机盐浓度之后,乙酸积累很少,L-色氨酸的产量为53．4g／L,比优化前提高了141．6％。经30L发酵罐初步放大,L－色氨酸的产量达53．6g／L,发酵结果稳定,具有工业化应用前景。     

代谢副产物乙酸对L-色氨酸发酵的影响

分析了重组大肠杆菌(E.coli TRTH/pSV-709)发酵生产L-色氨酸的发酵过程,检测结果表明发酵液中有大量代谢副产物乙酸的积累。利用外源添加试验研究了乙酸对L-色氨酸发酵的影响,结果表明乙酸浓度高于2g/L时对L-色氨酸生产菌的生长和产酸均有抑制作用。分析了乙酸的产生机制,并采取了调节溶氧水平、确定合适初始葡萄糖浓度、限制葡萄糖流加及控制菌体比生长速率等措施来减少乙酸的生成。在优化条件下,乙酸含量与原工艺相比降低了51.35%,菌体生物量和L-色氨酸产量分别提高了51.07%和46.54%,实现了高密度发酵培养的目的。     

文摘

基因工程９７００８２用修饰的色氨酸酶启动子指导大肠杆菌高水平表达外源蛋白［会，英］／Ｓｉｔｎｅｙ，Ｋ．Ｃ…／／Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｅａｄ．Ｓｃｉ．－１９９６，７８２．－２９７～３１０［译自ＤＢＡ，１９９６，１５（２１），９６—１２０７９］优化了不依赖温度的色氨酸酶启动子（ｐｌｎａＡ）以用于在大肠杆菌中生产重组蛋白。该启动子在所有生理相关温度（２０～４２℃）下起作用。在低于３７℃下的诱导作用可避免引发热休克反应，有利于可溶性蛋白质生产。用含有分解代谢物激活蛋白（ＣＡＰ）结合位点，但不含色氨酸效应元件…     

大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控

为了通过基因工程手段提高大肠杆菌色氨酸产量, 对色氨酸生物合成途径中的关键基因trpR、tnaA、aroG和trpED进行了改造。首先通过敲除trpR基因解除了基因组上色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控, 进而又敲除了tnaA基因, 阻断了色氨酸的分解代谢。然后, 将色氨酸合成途径的关键酶aroGfbr和trpEDfbr基因串联表达, 以去除色氨酸生物合成途径的瓶颈。与对照MG1655相比, trpR基因单敲菌色氨酸浓度提高了10倍, 双敲菌色氨酸浓度提高了约20倍。pZE12-trpEDfbr转入双敲菌后色氨酸浓度提高到168 mg/L, 而将aroGfbr和trpEDfbr转入双敲菌后, 色氨酸浓度提高到820 mg/L。为构建色氨酸高产菌奠定了基础。     

大肠杆菌宿主遗传背景对色氨酸生物传感器响应特性的影响

生物传感器是一类重要的合成生物学功能元件,目前已经被广泛应用于代谢工程领域的突变文库筛选和进化工程研究中。生物传感器的正交性,即和宿主细胞中其他遗传元件尽可能小的相互作用,对于其在代谢工程领域的成功应用至关重要。然而,对于这一问题缺乏系统性的认识。在本文中,通过分析不同遗传背景的大肠杆菌宿主对于色氨酸生物传感器响应特性的影响,结果发现:trpR调控网络、Tna A裂解酶和色氨酸生物传感器的响应特性具有显著的相互作用。通过一系列的遗传学分析,我们给出了分子水平上介导这一相互作用过程的可能模型。本工作给出了宿主内遗传元件破坏生物传感器正交性的一个案例,对于指导生物传感器在代谢工程领域的应用具有重要意义。     

大肠杆菌色氨酸操纵子的结构与克隆

色氨酸(Trp)具有重要生理活性,是哺乳动物的必需氨基酸之一。Yanofsky小组对大肠杆菌Trp合成酶的研究,首次确证了核苷酸三联密码与多肽链氨基酸的对应关系。Monod等发现大肠杆菌Trp合成酶的合成被培养基中的Trp所抑制,而且过量Trp对邻接的五个Trp基因都起着调节作用,由此提出了Tip基因组成一个操纵子的著名设想。以上两项工作在分子生物学领域具有十分重要的意义,促使人们对Trp操纵子及其基因调控机制进行了更为深入的研究,并试图以基因工程手段获得工业化生产的Trp产生菌。本文尝试对Trp操纵子的结构、基因调控及基因分离的主要研究成果作一简要介绍。     

大肠杆菌色氨酸转运系统多基因敲除对色氨酸生产的影响

大肠杆菌中色氨酸向胞内的转运主要是由mtr、tnaB和aroP 3个基因编码的通透酶进行调控.利用Red重组技术,在mtr单基因敲除菌的基础上,成功构建了mtr.tnaB和mtr.aroP双基因敲除菌以及mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌,并通过发酵实验首次考察了色氨酸转运系统多基因缺失对大肠杆菌合成色氨酸的影响.发酵结果表明,mtr.tnaB和mtr.aroP双基因缺失后,色氨酸产量分别达到1.38 g/L和1.27 g/L,与出发菌株相比分别提高了17％和9％,而mtr.tnaB.aroP三基因缺失后,菌体生长受到了明显抑制,发酵后色氨酸产量仅为0.63 g/L.在补料分批发酵实验中,mtr.tnaB双基因敲除菌的色氨酸产量进一步提高至12.2 g/L,与出发菌株相比色氨酸产量提高了27％.     

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统改造对产L-色氨酸的影响

L-色氨酸是芳香族氨基酸的一种,被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS系统)在葡萄糖转运和磷酸化过程中起重要作用,是糖代谢基因表达调控的核心。利用Red同源重组系统,构建包含两类典型PTS系统突变(ptsHIcrr~-glf-glk~+和ptsG~-)的L-色氨酸生产菌,并对相关菌株进行补料分批发酵研究。结果表明,不同类型PTS系统突变对菌体生长、L-色氨酸产量、糖酸转化率及副产物生成均有较大影响。与出发菌相比,ptsHIcrr~-glf-glk~+突变株最高OD_(600)达到125,提高47.0%,产酸38.5 g/L,提高25.9%,糖酸转化率16.7%,提高26.5%,乙酸生成略有增加;ptsG~-突变株最高OD_(600)达到100,提高17.6%,产酸33.4 g/L,提高9.4%,糖酸转化率15.5%,提高17.4%,乙酸生成略有减少。对葡萄糖转运系统的进一步研究将为大肠杆菌合成L-色氨酸效率的提升提供帮助。     

色氨酸发酵的初步研究

我们从271株酵母菌中,选出一株可利用邻氨基苯甲酸为前体产生色氨酸的优良菌株——阿保利假丝酵母(Candida arborea AS 2．566)。对该菌的发酵条件进行了初步研究,发现通气量、邻氨基苯甲酸浓度等与色氨酸产量有密切关系。采用乙醇一邻氨基苯甲酸混合分次追加的方式,可提高色氨酸的产量。用30升发酵罐试验,色氨酸产量达5克／升以上。     

大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控

为了通过基因工程手段提高大肠杆菌色氨酸产量, 对色氨酸生物合成途径中的关键基因trpR、tnaA、aroG和trpED进行了改造.首先通过敲除trpR基因解除了基因组上色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控, 进而又敲除了tnaA基因, 阻断了色氨酸的分解代谢.然后, 将色氨酸合成途径的关键酶aroGfbr和trpEDfbr基因串联表达, 以去除色氨酸生物合成途径的瓶颈.与对照MG1655相比, trpR基因单敲菌色氨酸浓度提高了10倍, 双敲菌色氨酸浓度提高了约20倍.pZE12-trpEDfbr转入双敲菌后色氨酸浓度提高到168 mg/L, 而将aroGfbr和trpEDfbr转入双敲菌后, 色氨酸浓度提高到820 mg/L.为构建色氨酸高产菌奠定了基础.     

利用大肠杆菌细胞工厂生产吲哚-3-乙酸的研究

目的:利用重组大肠杆菌全细胞转化色氨酸生产IAA.方法:在大肠杆菌胞内构建两条全新的IAA合成途径,即吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide,IAM)途径和色胺(tryptamine,TRP)途径.结果:IAM途径涉及两个酶,分别是色氨酸-2-单加氧酶(IAAM)和酰胺酶(AMI1),构建好的重组大肠杆...     

色氨酸操纵子研究进展

色氨酸只能由微生物和植物合成。催化色氨酸分支途径的酶由色氨酸操纵子编码。生物体内色氨酸合成受到严格调控,色氨酸操纵子发挥重要作用。本文综述色氨酸代谢途径及其调节,并对途径工程在色氨酸操纵子改造中的应用进行回顾。     

L-色氨酸的生产方法

专利要求的范围 用节杆菌属(?一丈。,夕夕一)中对一种或二种以上的色氨酸类似物具有抗性的LO色氨酸产生菌,在培养液中积累色氨酸,并从该培养液中提取L一色氨酸的发酵生产法。 本发明详细池叙述了节杆菌属中的L一色氨酸生产菌,通过培养,从发酵液中分离、回收L一色氨酸的方法,由于采用了生成L一色氨酸能力高的菌株,所以使必须氨基酸中的L-色氨酸达到了兼价工业生产的要求。 过去发酵法生产L一色氨酸,采用的是在培养基中添加叫噪或邻氨基苯甲酸的方法,此法因必须采用高价的引噪或邻氨基苯甲酸作前休物质,使色氨酸的生产存在着成本高的缺点…     

pta基因敲除对L-色氨酸发酵的影响

[目的]探究pta基因缺失对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响.[方法]运用Red重组技术敲除pta基因,构建pta缺失株E.coli TRTH△pta.利用30 L发酵罐进行分批补料发酵试验,考察重组菌E.coliTRTHApta发酵0生产L-色氨酸过程中生物量、L-色氨酸产量、有机酸含量、发酵液中NH4+浓度及变化....