哺乳动物细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原的理化和生物学性状

研究了哺乳动物细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)纯品的理化及生物学性状。结果表明:此种HBsAg在CsCl中的浮力密度是1.21g/cm~3;快速液相层析的SuperoseHR6层析柱上呈现3个峰,中间是一个主峰,两侧各一小峰;经Mono Q柱层析呈现一个对称峰,证明了HBsAg颗粒所带电荷的均一性;以SDS-PAGE和凝胶扫描方法分析HBsAg的多肽,P23、gp27和gp30各占65％、20％和10％,另有5％的二聚体存在;N-末端的氨基酸序列与转入细胞的目的基因所编码的序列相同;HBsAg在4℃和-20℃储存较稳定,室温条件保存时间不宜过长。动物实验证明:用与血源HBsAg疫苗同等剂量的基因工程HBsAg疫苗接种Balb/C小鼠,可获得比血源疫苗高2.64倍的免疫效果。此外,经过福尔马林处理的疫苗较未处理的疫苗有较强的免疫原性。     

应用乙型肝炎疫苗阻断围产期乙型肝炎病毒的母婴传播

993名HBsAg携带者母亲所生新生儿,以768名新生儿为试验组,226名新生儿为对照组,试验组分别注射HBsAg血源性氢氧化铝佐剂疫苗,乙型肝炎高价免疫球蛋白(HBlg)或疫苗加HBIg,对照组注射安慰剂,所用疫苗为国产81-2、82-1-2、83-1和美国NIHA9,观察表明,出生后六个月,试验组各批疫苗的保护率为60～93％,以83-1批为最高;疫苗加HBIg的保护效果与疫苗相似,HBIg组亦有70％的保护效果,以上结果证明单独应用HBsAg疫苗阻断母婴传播的效果是理想的。     

DNA疫苗预敏蛋白疫苗增强策略对乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫应答的影响

目的:观察核酸疫苗预敏,乙型肝炎病毒HBsAg蛋白疫苗增强的免疫对Balb/c小鼠免疫应答的影响.方法:以TransfectionTM脂质体将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗pSW3891/MHBs/adr(简称为adr),及空载体pSW3891(简称vector)体外转染293T细胞.免疫印迹法(Western blot)检测adr,vector的体外表达;动物体内研究选用Balb/c小鼠共18只,每组6只,编号后随机分为3组,即空载体质粒组(vector+vector组)、adr核酸疫苗+HBsAg蛋白疫苗(adr+protein组)、HBsAg蛋白疫苗+HBsAg蛋白疫苗(Protein+Protein组);于第0周肌肉注射法分别以vector、adr及HBsAg蛋白疫苗免疫小鼠,于第4周肌内注射法分剐以vector、HBsAg蛋白疫苗、及HBsAg蛋白疫苗免疫小鼠.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清HBsAg特异性抗体、酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测小鼠脾细胞HBsAg多肽特异性IFN-γ分泌细胞.结果:adr体外转染293T细胞后,能够表达乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs);体内研究结果显示:除vector+vector组外,adr+protein组、Protein+Protein组小鼠均能检出血清抗-HBs,Protein+Protein组抗-HBs终点滴度比adr+protein组高,但无统计学意义;三组中vector+vector组没有检测到特异性INF-γ分泌的脾细胞,而adr+protein组、Protein+Protein组小鼠均能检出,且adr+protein组特异性细胞数量显著高于protein+protein组(P＜0.001),具有统计学意义.结论:乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗预敏.能明显增强Balb/c小鼠对乙型肝炎HBsAg蛋白疫苗细胞免疫应答水平.     

基因枪接种乙型肝炎表面抗原促进DNA疫苗诱生的免疫应答转换

目的 为了克服基因枪接种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)DNA疫苗诱生的免疫应答以Th2为主的缺点,在基因枪接种质粒HBsAg DNA疫苗的同时共导入或共表达乙型肝炎病毒壳(HBV core)基因作为佐剂,以促进其所诱生的HBsAg特异性的Th2型免疫应答向Tn1型转换。方法 构建可单独或共同表达HBsAg或核心抗原(HBcAg)的DNA免疫用载体pIRKS／core、pIRES／C149、pIRES／S、pIRES／S／Core和pIRES／S／C149,并在真核细胞进行表达验证。对BALB／c雌鼠进行免疫并检测小鼠免疫后的特异性体液免疫和细胞免疫指标。结果 共导入或共表达HBV core基因能增强基因枪接种HBsAg DNA疫苗诱生的Th1型免疫应答水平,包括HBsAg特异的IgG2a应答、CTL活性、IFN-γ产生能力等。结论 以HBV core基因为佐剂能促进基因枪接种HBsAg DNA疫苗诱生的Th2型免疫应答向Th1型免疫应答转换。     

重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN对转基因小鼠的免疫治疗效果

目的利用免疫耐受的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)转基因(Transgenic mice,Tg)小鼠模型,研究重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN的免疫治疗效果,为HBV的临床免疫治疗提供思路和依据.方法重组HBsAg疫苗单独或辅以CpG ODN,同时设干扰素(IFN)药物组和生理盐水(NS)照组,多次免疫治疗HBV转基因小鼠,于免疫前和末次免疫后2周、4周眼球后静脉丛取血,动态观察各组小鼠血清中HBsAg量、HBsAg阴转率、Anti-HBs阳性率和HBVDNA拷贝数的变化.在治疗后应用HE染色观察各组小鼠肝组织病变活动度以及SP组化法观察活肝组织中HBsAg表达量的改变.结果在免疫治疗后2周,HBsAg疫苗组和HBsAg CpG组血清中的HBsAg量较免疫前和同期的IFN组、NS组均有明显降低(P＜0.05),并且到4周时降低作用依然很明显;免疫治疗后2周时两组100%出现Anti-HBs抗体;HBsAg CpG组治疗后2周血清HBsAg有1只转阴,4周时阴转数增加到3只.其他三组中均无阴转;免疫治疗后2周至4周HBsAg CpG组的小鼠HBV DNA的拷贝数可降低1～2个数量级,IFN组2周部分出现轻微降低但到4周时出现回升;HBsAg CpG组肝组织中HBsAg量的表达均出现不同程度的降低;病理学检测显示HBsAg CpG组肝组织中浸润大量淋巴细胞,可见恢复期的肝小叶.肝组织病变活动度情况为HBsAg CpG组＞HBsAg组＞IFN组、NS组.结论CpG ODN增强重组HBsAg疫苗对HBV转基因小鼠的免疫治疗效果.重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN可作为临床上免疫治疗慢性HBV感染的可行性途经.     

加热灭活的乙肝疫苗(CLB)的免疫力与安全性

<正>乙肝苗(CLB)是用人血浆纯化的HBsAg制备的,疫苗中残余的乙肝病毒以101—104.5℃加热灭活90秒针,按着以65℃低温巴氏法灭活10小时。疫苗首先在黑猩猩和一定数量的人体中进行广泛的检测。在乙肝病毒(HBV)感染的高危人群男性同性恋中,血液透析工作人员和血液透析患者中,以安慰剂对照双盲法证明CLB疫苗     

BCG-CpG-DNA对重组HBsAg免疫原性的影响

为了研究BCG-CpG-DNA对重组HBsAg免疫原性的影响,了解其佐剂功能。采用不同剂量BCG-CpG-DNA与不同剂量重组(汉逊酵母)表达的HBsAg或Al-HBsAg混合免疫小鼠,与同剂量铝佐剂疫苗对比,以放射免疫法检测抗-HBs中和抗体水平和抗体持续时间,ELISA法检测抗体亚类。结果显示,BCG-CpG-DNA和HBsAg混合,抗-HBs的中和抗体水平达到或高于同剂量铝佐剂疫苗;BCG-CpG-DNA和Al-HBsAg混合,抗-HBs的中和抗体水平高于同剂量铝佐剂疫苗,并有统计学显著意义(P<0.05);添加BCG-CpG-DNA组抗体水平4周时增加不明显,到10周则显著地高于同剂量铝佐剂疫苗组,IgG2a抗体水平也高于相应的对照组。实验结果表明BCG-CpG-DNA对HBsAg有较好的免疫佐剂作用,并和AL佐剂有协同作用。     

HBsAg生化性状对乙型肝炎疫苗效力影响的研究

比较研究了重组酵母HBsAg P24亚基间二硫键结合及其还原条件下降解程度对乙型肝炎疫苗效力的影响。分别用HPLC及SDS－PAGE法检测重组酵母乙型肝炎疫苗HBsAg的P24亚基在还原条件下降解和P24亚基间二硫键桥联程度,并检测乙型肝炎疫苗小鼠体内效力（ED50值）和体外相对效力（RP）,分析HBsAg的P24亚基间二硫键结合及其还原条件下降解程度对乙型肝炎疫苗效力的影响。结果表明HBsAgP24亚基还原条件下降解成分Sub-P24的相对含量在5．2％－31％间,P24亚基间二硫键桥联型HBsAg颗粒相对含量在41．9％－71．8％范围内与疫苗的实验室效力无关。所生产重组酵母乙型肝炎疫苗HBsAg的P24亚基间二硫键结合及其还原条件下降解程度不影响乙型肝炎疫苗实验室效力。     

用基因工程手段生产HBsAg蛋白

乙型肝炎是由HBV引起的全球性传染病,其疫苗的研究很早就受到重视。乙肝疫苗从血源疫苗发展到DNA疫苗,已在酵母、病毒和哺乳动物的表达系统中成功地实现了HBsAg的表达。由于植物生物反应器的发展,在植物中表达疫苗正成为乙肝疫苗新的研究热点。本综述了用基因工程手段生产HBsAg蛋白的3种方法,即利用微生物、动物和植物来生产HBsAg蛋白。     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国常见病及多发病.HBV难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍.目前虽然基因重组HBV表面抗原(HBsAg)疫苗预防HBV感染取得了较好的效果,但基因重组HBsAg疫苗主要能诱导特异性体液免疫,不能刺激机体的细胞免疫应答.近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2].为了探讨应用HBV基因疫苗预防HBV感染的可能性,本文构建了HBV全S基因和HBsAg基因疫苗,观察和比较了这两种疫苗经肌肉注射接种到Balb/C小鼠体内后的细胞及体液免疫功能的变化.     

电转联合热休克蛋白佐剂疫苗引发抗HBV的免疫应答

针对HBV感染的治疗性DNA疫苗虽然具有很好的应用前景,但目前抗病毒效果并不高,表明在病毒长期感染过程中存在免疫抑制机制。以HBV的表面蛋白(HBsAg)和核心蛋白(HBcAg)为DNA疫苗抗原,采用gp96和HSP70作为佐剂联合电转以提高疫苗的活性。将gp96为佐剂的HBsAg/HBcAg DNA疫苗免疫HBV转基因鼠后引发抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答。使用gp96和HSP70佐剂引起Treg下调20%。与没有免疫的小鼠相比,以gp96和HSP70为佐剂的DNA疫苗显著降低血清中病毒S抗原水平和DNA拷贝数,大幅降低小鼠肝脏中HBc的表达。该研究为设计以gp96为佐剂的乙肝治疗性DNA疫苗提供了依据。     

乙肝表面抗原阳性产妇分娩的婴儿对乙肝疫苗的应答

<正>目的:在美国,每年有HBsAg阳性的产妇分娩约25 000个新生儿。推荐新生儿出生时立即注射乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白,随后完成疫苗接种及进行血清学检测。在较大队列的HBsAg阳性产妇分娩的婴儿中评估了影响疫苗应答的因素。方法:研究对象为2008-2013年间围产期乙肝预防计划内HBsAg阳性产妇分娩的HBsAg阴性的婴儿。接种不少于3剂疫苗后,婴儿乙肝表面抗体     

牛痘病毒活的重组体保护黑猩猩抗乙型肝炎

<正>乙型肝炎病毒是一种重要的人的病原体,它使2亿以上的人群呈慢性感染,其中很多人发展成肝癌。虽然乙型肝炎病毒组织培养呈不能繁殖,但是已用慢性感染病人的血浆制造出的高效价亚单位疫苗,并已被批准使用。这种疫苗是安全的,可是由于疫苗的价格昂贵及数量有限,不能对第三世界大多数国家供应。研制疫苗其他的途径,包括由基因工程装配的真核细胞中提纯HBsAg和按HBsAg基因核甘酸序列合成肽均仍处在评价阶段。用重组DNA技术研制疫苗的     

CpG ODN增强rHBsAg疫苗对小鼠免疫应答影响的研究

通过CpG寡核苷酸(CpG ODN)与重组HBsAg蛋白疫苗(rHBsAg)联合免疫C57BL/6BL/6小鼠,观察CpG ODN对小鼠免疫状况的影响。试验分对照、乙肝疫苗以及用乙肝疫苗加CpG三组,MTT法分别进行HBsAg特异性刺激淋巴细胞转化试验、HBsAg特异性刺激细胞毒性T细胞杀伤试验、自然杀伤细胞非特异性杀伤试验,以及ConA刺激淋巴细胞转化试验;ELISA测定HBsAb、INF-γ、IL-12和IL-4结果中,疫苗加CpG组抗原特异性转化试验指数为4.05±0.31;疫苗加CpG组抗原特异性CTL率为82.27±22.64,在统计学上差异显著(P<0.05);而HBsAb、INF-γ、IL-12的结果分别为51.85±14.41、802.25±104.25和373.62±66.58,与对照组及疫苗组比较,差异显著(P<0.05)。CpG ODN能作为一种新的免疫佐剂更好地增强重组乙肝表面抗原蛋白疫苗诱导小鼠产生高效的体液和细胞免疫应答。     

乙型肝炎血源疫苗不同免疫剂量阻断新生儿母婴传播的效果观察

用乙型肝炎血源疫苗,按0、1、6程序,分5种不同剂量免疫HBsAg和HBeAg均阳性(双阳性)母亲和仅HBsAg阳性母亲的新生儿,井于首针后8～12个月采血,用放射免疫(RIA)法检测他们的HBsAg和抗-HBs、抗-HBc,以比较不同剂量乙肝疫苗阻断母婴传播的效果。结果,10μg×3组对双阳性和仅HBsAg阳性母亲的新生儿的保护率,分别是42.9％和53.5％;20μ×3组为67.4％和69.7％;30μg、10μg、10μg组为75.6％和79.8％,30.20、20μg(含30、30、10μg)组为80.2％和81.5％;30μg×3组为82.3％和83.7％。随疫苗剂量增加保护率逐渐增加,抗-HBs阳转率也是如此。     

HBsAg阴性母亲的新生儿接种不同剂量乙型肝炎血源疫苗的效果

HBsAg阴位母亲的新生儿,按0,1、6月程序分别接种10-10-10μg(1组)、20-10-10μg(2组)和30-10-10μg(3组)乙型肝炎血源疫苗。第一针后一年,检查抗-HBs阳转率,分别为87.60％,90.64％和88.97％,无统计学显著差异。3针10μg组免疫后l～4年抗-HBs阳性率分别为88.31％、81.08％、80.10％和78.39％,虽稍下降,但无统计学显著差异。3个剂量组HBsAg阳性率分别为0.71％,0.49％和0.74％,说明HBsAg阴性母亲的新生儿,用国产血源HBsAg疫苗免疫以10μ×3效果较理想。     

佐剂CpG-ODN与重组HBsAg疫苗联合免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的免疫应答研究

目的 以CpG-ODN为佐剂与重组HBsAg(rHBsAg)疫苗合用,研究其对乙型肝炎病毒转基因(HBV Tg)小鼠模型的免疫应答效果.方法 40只HBV Tg小鼠随机分为4组,每组小鼠分别注射rHBsAg疫苗(单用rHBsAg组)、rHBsAg疫苗+CpG-ODN(试验组)、rIFNα-2b(IFN组)、生理盐水(对照组).经多次免疫HBV转基因小鼠,于免疫前、后不同时间采血,动态观察各组小鼠血清中HBsAg量、抗-HBs阳性率和HBV DNA的变化,检测肝组织中HBsAg的表达.检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群和白细胞介素2(IL-2)、IL-12(p70)以及γ干扰素(IFN-γ)的含量,分别检测免疫小鼠的脾细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤功能并计算各组小鼠肝组织活性指数(HAI).结果 rHBsAg组和rHBsAg+CpG组在免疫小鼠后2周100%诱导抗-HBs;rHBsAg+CpG组能显著降低血清中的HBsAg量或使HBsAg转阴,rHBsAg+CpG组肝组织中HBsAg的表达量与血清中一样降低,并降低血清中HBV DNA的拷贝数.rHBsAg组的CD3+、CD4+、CD8+细胞在T细胞中所占百分比,IL-2、IL-12(p70)和IFN-γ的含量以及淋巴细胞特异性增殖和杀伤效应均明显高于对照组(P＜0.05).rHBsAg+CpG组与rHBsAg组比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞应答(P＜0.05),且以Th1型细胞免疫应答为主.在rHBsAg+CpG组肝组织中出现大量淋巴细胞,肝脏的HAI在4个组中最高.结论 CpG-ODN作为佐剂可以增强重组HBsAg疫苗诱导HBV转基因小鼠产生抗病毒免疫应答,重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN可作为免疫治疗慢性HBV感染的可行性途经.     

少年儿童接种乙型肝炎血源疫苗的效果评价

5～15岁的HBV易感儿童,按0、1、6月程序接种10μg×3乙型肝炎血源疫苗(北京生研所批号8615-1A、8722-2)。接种后1～2年他们的抗-HBs阳转率为～92％,无一例HBsAg阳转;未接种疫苗的对照组儿童,抗-HBs阳转率仅2.08％～2.60％,HBsAg阳转率分别为3.23％和2.08％。流行病学保护效果良好。易感少年儿童接种乙型肝炎血源疫苗将加快控制乙型肝炎的进程。     

乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究进展

预防与控制乙型肝炎发病的乙型肝炎病毒(HBV)疫苗,是有重大的社会和经济意义。HBV的持续感染可引起慢性肝脏疾患,并逐步发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。目前的乙肝重组亚单位疫苗可以使90％的接种产生保护性抗体;但是对慢性HBV携带,由于其机体对HBsAg蛋白产生耐受,不能产生体液和细胞免疫,因此它只能作为一种预防性的疫苗。DNA疫苗(基因疫苗)是一种新的疫苗技术,通过向体内递送编码抗原的细菌质粒,刺激产生特异的体液和细胞免疫反应。在小鼠和其他的肝炎病毒感染动物模型中,HBV DNA疫苗可以特异性地引起体液和细胞免疫,清除HBV转基因动物血循环中的HBsAg颗粒和HBV DNA。如果加入各种免疫调节细胞因子的基因,可以进一步提高HBV DNA疫苗的免疫效果,因此它不仅可作为预防性疫苗,也可作为治疗型疫苗。     

不同批号乙型肝炎血源疫苗的免疫效果

以北京和上海生物制品研究所生产的不同批号的乙型开炎血源疫苗,免疫HBsAg和HBeAg均阳性母亲及HBsAg阴性母亲的新生儿,以及不同年龄的儿童和成人HBV易感者,程序为0、1、6个月。在第一针后9～12个月采血,用RIA法检测抗-HBs,S/N≥10.0为阳性。观察不同批号疫苗兔疫后的抗-HBs阳转率。6个批号的疫苗,以30、10、10μg和30μg×3剂量免疫HBsAg和HBeAg均阳性母亲的新生儿210人,抗-HBs阳转率为74.46％～84.09％,7个批号以10μg×3免疫阴性母亲的新主儿1510人,抗-HBs阳转率为80.29％～96.24％;3个批号以10μg×3免疫易感儿童238人,2号批号以10μg×3疫易感成年人127人,抗-HBs阳转率前者为87％～100.0％,后者为90％～96％。如按S/N≥2.1计算,抗-HBs阳转率可全部达到90％以上。提示我国生产的乙肝疫苗对各年龄人群都有较好的免疫反应,个别批号间有些差异,但经统计处理多无显著意义。