成体干细胞的性别与疗效有关

干细胞与性别有关.根据一项新研究,取自雌性小鼠的肌肉干细胞用来修复损伤组织要比雄性小鼠的好.这是首次表明,干细胞的再生能力与性别有依赖关系.通常研究者并不专门用文件证明他们用来研究的干细胞系是取自雄性还是雌性.科学家如果仅考虑应用干细胞的一种性别,难免得出有偏见的结果.研究者开始考虑所应用的干细胞的性别作用.因为研究者认识到,多年来所应用的干细胞系都是选择其再生能力好的,而这些干细胞都是取自雌性.为分别研究干细胞雌雄性别的影响,研究者培养了来自15个雌性小鼠与10个雄性小鼠的健康肌肉组织的干细胞系.取自成熟动物组织的肌肉干细胞不象胚胎干细胞那样,会引起很多争论,而且可以不用杀死动物便提取出来.研究者将肌肉干细胞插入罹患类似人类肌肉营养障碍疾病的小鼠体内.两星期后,研究者计数由干细胞产生的健康肌肉纤维.只有1个雄性小鼠的干细胞系产生3 200多根新肌肉纤维,而却有6个雌性细胞系各产生这么多肌肉纤维.研究者在2007年4月9日的Journal of Cell Biology上作了报道.一位专司研究成体干细胞性别差异的科学家说,这是一个关于干细胞研究的新观念,说明干细胞的性别是有重要关系的.研究者说,这可以追溯到X和Y染色体上的某种差别,但其真相尚未了解.对于这种差异的真正机制可能要花几年时间去破解.在最近的研究工作中,研究者发现,某些应激反应基因在其插入的雌性干细胞中比雄性干细胞中活性更高.移植使细胞承受了应力,故研究者提示,在应激反应中性别差异很可能解释移植结果的差异.了解干细胞性别差异的机制,对于临床医师在治疗中用移植干细胞修复损伤组织时很可能有用.例如,研究者可以找到一种方法,将雌性干细胞性能改造雄性干细胞,从而提高未来疗法,即改变并重新插入男子自身干细胞疗法的成功率.     

Duchenne型肌营养不良小鼠模型鉴定及干细胞移植后dystrophin的变化

目的建立Duchenne型肌营养不良（DMD）模型dko小鼠的鉴定方法,评估干细胞移植后dystrophin的再生水平。方法采用SSP-PCR方法鉴定杂合子鼠交配产生的子代鼠的基因型。生化分析仪测定dko小鼠血浆肌酸激酶含量,HE染色观察肌肉组织学变化。扩增人脐带间充质干细胞并注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后免疫荧光染色法检测dystrophin的表达。结果杂合子鼠交配可以产生三个基因型的子代鼠,21.2%的子代鼠可以鉴定为dko小鼠的基因型（285 bp）。dko小鼠显示了肌营养不良的症状,血浆肌酸激酶含量高达（16,988.52±617.48）IU/L,典型的病理变化包括肌纤维大小不一,多见核中移细胞,结缔组织增生或炎性细胞浸润。将人脐带间充质干细胞注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后可检测到人dystrophin的表达。结论采用SSP-PCR可用于鉴定dko小鼠基因型,dko小鼠是研究干细胞治疗DMD的理想动物模型。     

骨髓和脐带间充质干细胞联合移植治疗杜氏型肌营养不良1例并文献复习

目的:研究自体骨髓和脐带间充质干细胞联合移植治疗杜氏型肌营养不良(DMD)的疗效和安全性方法对经临床表现、血清酶学、肌电图、基因分析、肌肉活检、肌肉核磁共振成像(MRI)确诊的1例DMD患者采用自体骨髓和脐带间充质干细胞联合移植的方案进行治疗.术后第3、6、9、12个月定期观察患者临床症状及各项疗效指标的变化并结合国内外文献进行综合分析.结果随访12个月,该患者肌力提高,动作灵活.血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶较前明显下降,活动能力评分和徒手肌力较前增加,肌电图运动单位电位波幅减低及时限缩短较前改善,肌肉MRI复查显示肌肉病变程度较前减轻、肌肉轮廓较前清晰.结论自体骨髓和脐带间充质干细胞联合移植是一种治疗DMD的有效治疗方法.     

Exo-1基因对端粒酶缺陷小鼠造血干细胞植入效率的影响

目的利用不同的造血干细胞移植方式,探讨Exo-1基因缺失对端粒酶基因敲除小鼠的造血干细胞植入效率的影响。方法以CD45.1小鼠的骨髓细胞或骨髓造血干细胞为供体,以端粒酶基因敲除小鼠或Exo-1基因和端粒酶基因双敲除小鼠为受体,在给予不同剂量X线照射或不照射的情况下,重复进行静脉注射全骨髓细胞或分选的骨髓造血干细胞(c-kit+、Sca-1+、lineage-,KSL),于移植后1个月取外周血,流式分析嵌合率。结果未经X线照射及1 Gy、2 Gy照射情况下,端粒酶基因缺陷受体小鼠的外周血中供体来源的细胞嵌合率较低;6 Gy照射后,供体来源的外周血细胞嵌合率仍低于50%,而且端粒酶基因缺陷受体小鼠在移植后1个月内死亡较多;3 Gy照射可形成较高嵌合率,Exo-1基因缺失对端粒酶缺陷小鼠的造血干细胞植入效率的影响不显著。结论以端粒酶缺陷小鼠作为衰老模型研究造血干细胞植入效率时,3 Gy X线照射能够有效地形成较高的外周血供体细胞的嵌合率,但是Exo-1基因没有进一步提高造血干细胞在端粒酶敲除小鼠的植入效率。     

科研快讯

《科学-转化医学》:基因疗法治疗遗传性眼病效果显著美国研究人员2月8日在《科学-转化医学》杂志上报告说,3名遗传性眼病患者接受基因疗法治疗后,视力显著提高且无排异反应等不良情况发生。这为利用基因疗法治疗其他视网膜病变带来了希望。这3名患者患有罕见眼疾--莱贝尔先天黑内障。这种病通常在患者年幼时发作,患者视网膜细胞的一种     

美首次在狗中进行抗癌基因疗法试验

《ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ》１９９９年１７卷１期８页报道：美国有６０００万只狗。全世界宠物抗癌市场的贸易额高达３０亿美元。鉴此，美国将在１９９９年初首次在狗中进行用基因疗法治疗黑素瘤的试验。并拟将在狗中获得的结果作为人类癌症基因疗法研究的一部分。这种基因疗法作用了编码未公开的细胞激活素和超抗原的基因。用于狗的基因疗法的药物可直接注射入肿瘤。这种药物可望于２０００年底或２００１年初面市。美首次在狗中进行抗癌基因疗法试验@汪开治     

小鼠类胚胎干细胞分离培养及用于制作嵌合体小鼠的实验研究

目的探讨分离小鼠囊胚内细胞群类胚胎干细胞及用于制作嵌合体小鼠的方法及应用价值。方法分离3.5d小鼠囊胚内细胞群的类胚胎干细胞作为供体细胞,通过显微注射方法将分离的类胚胎干细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中,再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中制作嵌合体小鼠。结果分离36枚囊胚的内细胞群类胚胎干细胞,注射256只昆明小鼠囊胚中,移植32只假孕雌鼠子宫中,获产崽2窝,共12只,其中2只获毛色嵌合体小鼠。结论采用该技术分离所获得的类胚胎干细胞作为供体细胞制作嵌合体小鼠获得成功,该方法为ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径,在同种不同品系的动物改良及遗传病基因治疗中有一定的应用价值,尤其是对未能建立ES细胞系的大动物的遗传工程操作具有一定意义。     

Science:新型基因编辑技术进展——成功阻断肌营养不良

正近日,一项刊登在国际杂志Science上的研究论文中,来自美国西南医学中心的研究人员通过研究,利用一种新型的基因编辑技术成功地在年轻小鼠中阻断了杜氏肌营养不良(DMD)的进展。如果该技术可以有效且安全地用于DMD患者中,那么其或将帮助开发首个基于基因编辑的疗法来治疗人类致死性的疾病。DMD是男孩儿中常见的一种严重形式的肌营养不良症,主要特点为肌肉进行性地退化且表现出虚弱,该疾病的发生主要是由X染色体相     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(MSC)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗DMD疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5·58×1012vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdxMSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdxMSCs进行同种异体移植治疗DMD疾病奠定了基础。     

通过胚胎干细胞途径获得的嵌合体小鼠中neo基因在各组织中的分布

为探讨小鼠胚胎干细胞参与早期胚胎发育的潜能,以neo基因作为目的基因进行了胚胎干细胞的转染,经G418的筛选,获得表达neo基因的单克隆细胞,挑取部分克隆扩大,进行小鼠囊胚腔注射,再重新植入小鼠子宫,共注射了60个囊胚,分别回输到5只假孕小鼠,在子代中得到了携带有neo基因的嵌合体小鼠。通过对嵌合体小鼠各组织PCR分析发现,neo基因可以在皮肤、肝脏、血液等多种组织中存在。     

Exonuclease-1缺失延缓端粒酶缺失小鼠造血微环境的衰老

目的研究Exo-1对端粒酶缺失小鼠造血微环境衰老的影响。方法以端粒酶基因敲除小鼠（Terc-/-）和Exo-1基因敲除小鼠（Exo-1-/-）杂交,并进一步互交产生第三代端粒酶基因敲除小鼠（G3Terc-/-）以及第三代Terc和Exo-1双基因敲除小鼠（G3Terc-/-Exo-1-/-）。以CD45.1野生型小鼠的骨髓细胞为供体,以2月龄G3Terc-/-或G3Terc-/-Exo-1-/-小鼠为受体,进行骨髓移植。在受体小鼠9月龄时,取骨髓、脾脏、胸腺、外周血等组织器官的细胞进行流式分析,研究G3Terc-/-和G3Terc-/-Exo-1-/-受体小鼠中的野生型供体来源的造血干细胞的发育分化。结果同G3Terc-/-小鼠相比,G3Terc-/-Exo-1-/-双基因敲除受体小鼠骨髓中野生型供体来源的B220＋细胞比例升高,前体B细胞的比例也明显升高;脾脏B220＋细胞的比例明显升高;胸腺发育正常;外周血中B220＋细胞比例升高。结论 Exo-1缺失延缓了端粒酶基因敲除小鼠造血系统微环境的衰老,从而逆转了端粒功能障碍引起的骨髓造血干细胞发育分化异常。     

基因疗法现状

从首次用基因疗法治疗人类疾病,至今已有一年多了。即没有成功的消息也没有失败的报导,然而美国及世界各地的研究者们仍急切盼望扩大使用这一技术。例如,莱顿大学和TNO(Rijswijk,the Netherlands)的荷兰科学家正在谋求开展严重的综合免疫缺失症(SCID)治疗计划。美国目前正进行此病的基因疗法实验。与美国人不同,荷兰研究者将腺嘌呤核苷脱氨酶(ADA)基因插入骨髓干细胞(人血细胞包括T细胞的前体细胞)中,而不是插入成熟的T细胞。他们希望只进行一次这样的基因转移,因为干细胞会不断产生含ADA基因的细胞;而成熟T细     

PiggyBac转座酶转基因小鼠模型的建立

目的 建立表达PiggyBac转座酶转基因小鼠模型,为研究PiggyBac转座子介导基因修饰在小鼠中的应用提供工具.方法 利用Cytomegalovirus( CMV)启动子驱动PiggyBac转座酶基因的表达,经显微注射法建立C57BL/6J表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测PiggyBac转座酶在小鼠生殖系睾丸中的表达情况.PiggyBac转座酶转基因小鼠活性的检测,是通过与转座子供体转基因小鼠杂交检测供体位置变化来确定的.结果 显微注射产生7只转基因小鼠并能传代,经RT-PCR筛选出一株在睾丸中相对高表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠.随后与转座子供体转基因小鼠杂交,子代双阳小鼠与野生型小鼠杂交基因型分离,产生的子代转座子供体单阳性小鼠中具有转座子供体片段的转座反应.结论 成功建立了表达PiggyBac转座酶转基因小鼠动物模型,该模型为PiggyBac转座子技术在小鼠中的应用提供了有价值的工具动物.     

绿色荧光蛋白嵌合体小鼠的建立和鉴定

为研究嵌合体动物中供体胚胎干细胞 (ES)在宿主胚胎发育中的走向和定位 ,同时探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值 ,本研究将pEGFP N1基因导入小鼠ES D3 细胞系 ,得到稳定表达GFP的胚胎干细胞亚系ES D3 GFP ,通过对昆明小鼠的囊胚腔注射 ,获得了 4只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠。其中 1只存活至成年 ,3只出生时死亡。荧光显像及组织PCR检测显示了绿色荧光蛋白在小鼠体内的嵌合情况。以绿色荧光为指标可实现活体水平的动态观察 ,本实验首次观察到以GFP为指标所示的机体嵌合情况与根据毛色嵌合推测的机体嵌合情况存在很大差异 ,以GFP为嵌合指标更加全面而准确 ;但不排除GFP对小鼠发育存在一定毒性的可能 ;另外 ,有结果显示供体ES细胞在宿主体内除了大片补丁状嵌合外 ,还存在细胞散在嵌合的情况 ,后者提示了在组织中利用GFP对ES细胞实施单细胞追踪和实时观察的可行性 ,为胚胎发育和疾病发生的相关研究提供了新的观察方法     

造血干细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

EDAG是在胚胎发育阶段造血干细胞特异性表达的基因.为了在早期造血组织细胞中实现相关基因的条件敲除,构建了含有早期造血组织特异性表达的EDAG启动子和Cre重组酶基因的转基因EDAG-Cre表达载体质粒.通过显微注射的方法将线性化的5.6kb的EDAG-Cre转基因片段导入小鼠受精卵细胞核,获得的新生小鼠经过PCR鉴定,常规方法培育传代.结果发现,共获得了6只阳性转基因首建鼠,其中4只已经建系并稳定传代.RT-PCR分析表明Cre重组酶基因在阳性转基因小鼠的骨髓、脾脏、胸腺、外周血以及胎肝等组织中均有表达,重组酶活性也在脾和骨髓中获得确认.EDAG-Cre重组酶转基因小鼠的建立,为研究早期造血组织以及造血干细胞特异性基因条件敲除小鼠模型的建立奠定了基础.     

Duchenne肌营养不良基因缺陷及基因治疗

Duchenne肌营养不良(DMD)是常见的神经肌肉遗传病之一,由于骨胳肌肌膜上的抗肌萎缩蛋白(dys—trophin)完全或部分缺失引起。本文介绍了dystrophin的结构和功能,对DMD基因治疗的目的基因。基因治疗方式(包括病毒载体和非病毒载体)。基因转染途径作了较为全面的介绍,指出腺相关病毒载体介导的基因治疗及干细胞移植是有希望的治疗方向。经全身途径使目的基因广泛转染骨胳肌并实现心肌和膈肌的转染,是基因治疗研究的难点。     

DMD的ATP酶组织化学研究

目的观察DMD(Duchenne muscular dystrophy)患者病变肌肉的酶组织化学病理改变,加深对其发病机制和预后的认识.方法对5例Duchenne型肌营养不良症患者进行肌肉活检,标本经处理,分别在HE染色、改良Gomori三色染色以及ATP酶染色(pH9.4和pH4.3)下进行观察,研究病变肌肉酶组织化学的病变特征及其意义.结果在DMD组织中肌纤维大小不等,肌纤维圆形化,炎性细胞浸润,并可见到不透光纤维.在再生肌纤维中可见到IIc型纤维.结论 DMD病变组织中纤维坏死显著,伴有不同程度的再生,故临床症状严重,病程短,预后较差.     

角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有角质细胞特异性角质素5启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因plyA的转基因载体pK5-Cre-hGH。以显微注射的方法将4．2kb的转基因片段K5-Cre-hGH引入小鼠基因组,共注射720枚受精卵,其中龄5枚移植至29只假孕母鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠48只,经基因型鉴定有12只小鼠在其基因组上整合有Cre基因,整合率为25％。将带有cre重组酶基因的小鼠与基因组上携带loxP位点的smad4条件基因打靶小鼠杂交以检测Cre重组酶组织特异性表达情况以及介导重组的功能。结果表明,K5-Cre转基因小鼠只在皮肤组织中表达Cre重组酶并能在体内成功地介导loxP位点的重组。     

线粒体钾通道Kcna3基因敲除小鼠初步制备

目的 为观察线粒体钾通道在缺血再灌注(I/R)心肌损伤中的作用,探讨其和心衰的关系,制备基因敲除小鼠模型以探讨钾通道单分子作用.方法 用BAC载体制备同源重组载体,对129小鼠胚胎干细胞(ES)打靶筛选后,显微注射至C57 BL/6J小鼠囊胚获得嵌合小鼠.经尾基因组DNA PCR鉴定和测序,鉴别杂合子小鼠.结果 在40只灰色小鼠中初步鉴定出Kcna3+/-基因型F1小鼠8只.结论 在国内首先用ES同源重组基因打靶方法,成功育成Kcna3基因敲除鼠杂合子,为下一步获得纯合子鼠奠定了基础.对进一步用钾离子通道病模型研究心肌保护病理生理机制和药物筛选具重要意义.     

创建干细胞而不损伤正常胚胎

有2个独立的研究组设计了几种方法来分离小鼠的胚胎干细胞,而不破坏活的胚胎.这些方法打算满足人们的伦理关切,因为有些人反对破坏人的胚胎来进行科研或治疗疾病.与成人干细胞不同的是,胚胎干细胞可以在形态结构上形成任何体细胞类型,诸如神经、肌肉或是心脏.许多研究者建议,利用胚胎干细胞的独特性能来制造新细胞,用以治疗损伤或是疾病,诸如帕金森病.然而,为了分离出新的胚胎干细胞系,科学家已经首次破坏了早期胚胎.为了既要拯救生命又要关注生命被破坏,研究者注意到,通常用来诊断胚胎遗传病的一项技术.该技术称为基因诊断前移植,即从8个细…