蜜蜂残翼病毒VP2基因密码子优化、原核表达及免疫原性分析

蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)是引发世界各地大范围蜂群损失的主要嫌疑对象,间接给农业生产带来了巨大的经济损失。为了探究DWV结构蛋白VP2的免疫原性,深入研究该蛋白的功能和为制备DWV单克隆抗体提供可靠的免疫原,本研究从DWV分离株(GenBank登录号:MF770715)扩增得到VP2基因,同时根据大肠杆菌密码子的偏嗜性对VP2基因进行优化并合成,分别将优化前和优化后的VP2基因克隆到pET-28a载体上,获得重组质粒pET-28a-VP2和pET-28a-opti-VP2,分别转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测,显示仅优化后的opti-VP2基因高效表达,然后对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,对重组蛋白纯化后分3次免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,同时设置纯化病毒组和空白对照组,对免疫小鼠的抗体水平和淋巴细胞增殖指数(SI)以及干扰素(IFN-γ)、白介素IL-2和IL-4水平进行检测。结果表明,重组VP2蛋白能够诱导产生特异性抗体,促进淋巴细胞增殖,提高IFN-γ、IL-2和IL-4水平,具有良好的免疫原性,为深入研究DWV VP2蛋白功能和开发防治DWV的生物制剂提供了帮助。     

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 ,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性     

香蕉条斑病毒ORFⅠ、ORFⅡ在大肠杆菌中的原核表达和自激活特性的鉴定

目前,香蕉条斑病毒所有3个ORF表达产物功能均不明确,通过双杂技术研究病毒未知蛋白与宿主蛋白的互作,可以初步推断未知蛋白的功能。本实验旨在构建香蕉条斑病毒ORFⅠ和ORFⅡ在细菌双杂系统中的诱饵质粒。首先以课题组保存的连接有香蕉条斑病毒河口分离物全基因组的pMD-18T载体DNA为模板,经过PCR扩增,切胶回收,并通过与带有λcI基因的pBT载体共同双酶切及T4连接酶连接后,得到与λcI基因融合表达的重组载体pBT-ORF1和pBT-ORF2。转化大肠杆菌XL1-BlueMRF'报告菌株,用IPTG(0.1mmol/L)诱导目的基因片段表达。Westernblotting结果表明,ORF1-λcI和ORF1-λcI两种融合蛋白均成功表达,且大小与预期一致。之后,pBT-ORF1及pBT-ORF2分别与空质粒pTRG共转化XL1-BlueMRF'报告菌株,pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化作为阴性对照。结果显示pBT-ORF1及pBT-ORF2均无自激活现象,可以进行后续的细菌双杂工作。本实验为BSV与宿主的细菌双杂系统的建立及蛋白组学的研究奠定了基础。     

水貂阿留申病毒VP2蛋白主要抗原表位基因原核表达及其检测应用

将构建好的重组质粒pMD-VP2a、pMD-VP2b分别经双酶切获得基因片段VP2a、VP2b,分别将其定向插入到原核表达载体pMAL-c2中,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb。阳性重组质粒转化宿主菌TB1,经IPTG诱导,两段基因均获得表达;Westernblot分析表明表达蛋白具有良好的抗原性。用KCI染色后,切胶回收的方法对表达蛋白进行纯化,以纯化的目的蛋白作为诊断抗原初步建立了水貂阿留申的VP2-CIEP诊断方法。结果表明该方法具有较高的灵敏性和特异性,与传统的CIEP方法的检出符合率达94.3%。     

猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用

将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2 Ⅰ蛋白主要抗原域VP2 Ⅰ融合蛋白的高效表达.通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性.表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为140,待检血清阳性标准初步定为OD490＞0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1.     

猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用

将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2Ⅰ蛋白主要抗原域VP2Ⅰ融合蛋白的高效表达。通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性标准初步定为OD490>0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP2的原核表达及其单克隆抗体的研制

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株NSP2蛋白基因进行截短修饰 (tNSP2),克隆于pGEX-6P-1载体,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达。Western-blot结果表明,融合表达的GST-tNSP2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别,大小约50kD。经GST柱提取纯化蛋白GST- tNSP2,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,获得2株能稳定分泌抗NSP2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为2B5、3H3。亚型鉴定结果均为IgG 1型,其轻链均为Κ链。间接免疫荧光试验证明,2B5和3H3均能与PRRSV S1毒株产生特异性反应,而不能与SY0608毒株反应。从而为PRRSV分离株的鉴定及NSP2功能研究奠定了重要基础。     

淋巴囊肿病毒中国株TNFR类似物的原核表达与结构分析

肿瘤坏死因子受体(TNFR)是细胞因子受体家族中的一员,在大DNA病毒的免疫逃避中起着重要的作用.淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-C)是一种大DNA病毒,属于虹彩病毒科.参照已知虹彩病毒TNFR基因设计引物P1,5'GGATCCAAAACTATGATTAAAATAAAGA 3';P25'ATTACTCGAGAATGTTAAAAATTAAGCTT3'.以LCDV-C基因组DNA为模板,PCR扩增得到一个834bp的DNA片段,并对该片段进行测序.构建原核表达重组质粒后,在大肠杆菌DE3中诱导表达,其产物经SDS-PAGE电泳后,显示为45kDa的融合蛋白带.对测序结果进行计算机辅助分析的结果显示,LCDV-C TNFR类似物是一个含278个氨基酸的多肽,具有典型的半胱氨酸富集区功能结构域,与宿主牙鲆TNERII氨基酸同源性为34%.     

鸡传染性贫血病毒VP2基因的表达及其免疫活性分析

利用特异性引物从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒核酸经PCR扩增得到VP2基因,BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理,纯化后,克隆至BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理的表达载体pET-28a中,构建了原核表达质粒pET-28-VP2。将pET-28-VP2转化至感受态E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约31kDa的目的蛋白以可溶性形式表达于上清中。Western blot分析发现,表达产物与鸡传染性贫血的阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白免疫小鼠后制得的多抗可以与全病毒发生反应,证明其具有免疫原性,为进一步研究VP2蛋白的功能及开展CIAV疫苗及诊断试剂的研制奠定了基础。     

诺如病毒NV衣壳蛋白VP1表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 获得纯化的诺如病毒（NV）衣壳蛋白VP1,免疫动物制备多克隆抗体。方法 提取粪便样品中诺如病毒RNA,逆转录得到cDNA文库,通过PCR扩增获取VP1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中诱导表达重组VP1蛋白。使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠‒聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝法（BSA）对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的VP1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价、Western blot检测抗体特异性。结果 成功地构建出重组表达载体VP1-pET28a,并将其在大肠埃希菌BL21（DE3）中稳定地表达诱导重组蛋白。ELISA测其多抗血清的平均效价为1∶200000,Western blot检测抗体在原核和真核特异性很高。结论 本实验成功地利用原核表达系统表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,为进一步研究诺如病毒的诊断和疫苗开发提供了条件。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21(DE3)中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度(16℃)有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

GII型诺如病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达与定位研究

【目的】利用杆状病毒表达系统表达诺如病毒(GenegroupⅡ)VP2蛋白,分析其亚细胞定位,为深入研究VP2蛋白的功能奠定基础。【方法】设计可扩增完整ORF3基因片段的引物P1和P2,在下游引物中引入6×His标签的编码序列,从质粒pMD-ORF3中克隆了含有6×His编码序列的ORF3基因,与pFastBac1载体连接,构建重组质粒pFB-ORF3,转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒基因组Bac-ORF3,脂质体介导转染sf9昆虫细胞获得表达VP2蛋白的重组杆状病毒Ac-VP2,感染sf9细胞后,收集病变细胞,采用抗6×His标签的单克隆抗体作为一抗进行Western blot与间接免疫荧光实验鉴定。【结果】Western blot实验证实Ac-VP2感染的sf9细胞在约29 kD处出现特异性条带;间接免疫荧光实验证实Ac-VP2感染的sf9细胞出现特异性绿色荧光,并且VP2主要定位于sf9的细胞核与细胞膜。【结论】诺如病毒VP2蛋白在Ac-VP2感染的sf9细胞中获得成功表达,并且主要定位于sf9细胞的细胞核与细胞膜。     

猪水泡病病毒VPl基因抗原区的原核表达

利用RT-PCR和nested PCR(nPCR)技术扩增出猪水泡病病毒VPl基因的抗原区,将其克隆到表达载体pProEX-HTb中,获得重组质粒,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确。将重组质粒导入BL21(DE3),经IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测表明,重组菌能表达猪水泡病病毒VPl抗原区蛋白;Western blot检测表明,诱导表达的抗原区蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。     

外源丙氨酸提高蜘蛛牵引丝蛋白天然基因在原核系统中的表达

蜘蛛丝蛋白天然基因的体外表达受诸多因素的限制。本研究在获得生长于中国的Nephila clavipes蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA（Genbank Accession No. AF441245）的基础上,利用限制性内切酶双酶切反应构建含有Spidroin2 cDNA的重组表达质粒pET-28b(+)-Sp。将该质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞感受态菌中,以不同浓度的IPTG进行诱导,并通过诱导时间、培养温度、加入外源丙氨酸等途径提高Spidroin2 cDNA的表达量,同时利用多克隆抗体对表达产物进行Western blot检测。重组质粒pET-28b(+)-Sp的测序结果表明Spidroin2 cDNA基因以正确的阅读框插入到原核表达载体中;SDS-PAGE结果表明菌体表达蛋白中存在着大小约为31 kDa的目的蛋白带（加入外源丙氨酸条件下）,Western blot检测结果进一步证实,目的基因在大肠杆菌中得到正确表达。本研究证实,蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA可在原核细胞内正确表达,外源丙氨酸的加入对于提高天然蜘蛛丝蛋白基因在原核系统的表达作用明显。     

人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达

诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGII4、GGII1和GGII3等为主要的流行遗传型。为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成。以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型衣壳蛋白基因进行了表达。结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒。重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰。这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础。     

Tropic1808基因的原核表达及其表达产物的生物活性

Tropic180 8基因是新近获得的一个鼠源性的cDNA .Tropic180 8基因开放阅读框架片段通过PCR方法从质粒中扩增后 ,重组入表达载体pET 2 1a中 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) .用IPTG诱导目的蛋白的表达 ,SDS PAGE并凝胶图象分析确定目的蛋白表达水平占细菌总蛋白的 14%以上 .表达蛋白在N端融合有 16个氨基酸 ,将表达蛋白电转移至PVDF膜 .氨基酸序列分析表明 ,其N端第 17～ 2 5位氨基酸序列与Tropic180 8基因编码序列一致 .利用融合部分含T7·Tag ,通过亲和层析纯化表达蛋白 ,经Westernblot检测为目的蛋白 ,加入到无血清培养的新生SD大鼠背根神经节 (DRG)中 ,观察到表达蛋白对DRG具有促进存活和促进突起生长的作用 .     

EV71病毒中和表位和诺如病毒P结构域嵌合蛋白的原核表达

目的:构建肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的线性中和抗原表位与诺如病毒P结构域融合基因的重组质粒,在大肠杆菌中表达诺如病毒P结构域与EV71中和抗原表位的嵌合蛋白。方法:根据已报道的3个EV71线性中和抗原表位的氨基酸序列,按大肠杆菌密码子表达使用的偏好性优化和设计各线性中和抗原表位的核苷酸序列,将这些表位以单个或不同的组合克隆至含诺如病毒P结构域和GST标签的质粒中,经测序确认后,分别转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导融合蛋白表达。用GST融合蛋白纯化磁珠对融合蛋白进行纯化,最后通过免疫印迹法确认融合蛋白的表达及嵌合蛋白的抗原性。结果:测序结果表明,成功地构建了含EV71病毒3个单表位和4个串联中和抗原表位的诺如病毒P结构域重组质粒,而且这7个含线性中和抗原表位的嵌合蛋白在大肠杆菌中都以可溶形式得到了表达。免疫印迹分析表达蛋白的抗原性结果表明,表达的嵌合蛋白都能与抗诺如病毒P结构域抗血清反应。除了含单表位的SP55和SP28嵌合蛋白外,其它的嵌合蛋白均能与抗EV71病毒的抗血清反应。结论:成功地在大肠杆菌中表达了诺如病毒P结构域和EV71病毒中和抗原表位的嵌合蛋白,且具有抗原性,这为诺如病毒和EV71病毒的二价疫苗及检测方法的研发奠定了基础。     

Expression, purification, and characterization of VP2 capsid protein of canine parvovirus in Escherichia coli

The capsid protein VP2 of canine parvovirus (CPV) was expressed in Escherichia coli using pMAL-c2x vector. After codon optimization, the mutant resulted in high-level expression of fusion protein. A simple procedure was used to purify fusion protein and remove endotoxin from fusion protein preparations. The fusion protein was antigenical similar to the native capsid protein as Western-blot assay performed with polyclonal antibodies obtained from dogs vaccinated with CPV. The immunogenicity of fusion protein was demonstrated in a vaccination experiment conducted with rabbits subcutaneously immunized. Rabbits vaccinated with fusion protein developed high titers of virus-specific antibodies response that neutralized CPV in vitro.     

重组人ASCT2的C-末端胞外结构域的原核表达、纯化及鉴定

中性氨基酸转运蛋白（ASCT2）是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,其最大的胞外结构域存在于C-末端的105个氨基酸（以下简称TAIL）。通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的TAIL序列,与pET-41b（克隆位点的N-和C-端分别有谷胱甘肽转移酶和His6标签序列）连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得表达,免疫印迹显示重组蛋白TAIL在细菌裂解液上清和沉淀（包涵体）中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的TAIL蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,提示其可能具有结合合胞素的活性。