硬骨鱼类的细胞核移植 Ⅳa．不同亚科间的细胞核移植一一由草鱼细胞核和团头鲂细胞质配合而成的核质杂种鱼

本文报道了,用细胞核移植的方法,获得亲缘关系更远的,不同亚科鱼类之间的核质杂种鱼,即由鲤科(Cyprinidae)中,雅罗鱼亚科(Leucinae) 的草鱼 (Ctenopharyngodon ldellus)的胚胎细胞核和鳊 亚科(Abramidinae)的团头鲂(Megalobrama amblycephala) 的卵细胞质配台而成的 核质杂种鱼。被移植的卵子共659个,得杂种成鱼24尾,成活率为3.6％。这些核质杂种鱼的若干形态特征,如体长/头长,体长/体高,体长/体宽,背鳍硬刺,腹棱、臀鳍条数,鳃耙数,咽喉齿,侧线鳞片数和脊椎骨数等,与草鱼者相似,这表明此核质杂种鱼的上述特征受草鱼细胞核的影响。 检查草鱼,团头鲂和由草鱼细胞核和团头鲂细胞质配台而成接质杂种鱼的染色体组成表明,它们的染色体数目均为2n=48。但这三种鱼的绝大多数染色体在形态上很难彼此区别。不过,根据我们初步观察发现,在我们于长江水产研究所选用的草鱼和团头鲂染色体组型中,它们的第十一对亚端部。着丝点染色体可以区别：草鱼中,该对染色体的臂比指数>3 (见图Id、Id’),而团头鲂中该对 染色体的臂比指数为2 (见图Ie、Ie’)。经检查也发现核质杂种鱼染色体组型中的第十一对染色体 的臂比指数也>3 (见图If、If’)。由此可见,核质杂种鱼的细胞核系来源于被移植的草鱼细胞核, 与核质杂种鱼所表现的若干形态特征所表明的结果相一致。 初步观察还表明,核质杂种鱼的生长速度明显比团头鲂快,也稍优于一般报道的草鱼的生长速 度。没有发现在这些杂种鱼中,有象草鱼那样往往困惑染疾病而死亡的例子。 目前,已有一尾雄性核质杂种鱼成熟并能产生正常的精子使草鱼卵受精。鉴于在这远缘鱼类之间 进行有性杂交,例如草鱼和团头鲂之间进行有性杂交,它们的杂交胚胎往往不正常,或在不同发育阶 段致死,或即使能获得少数成鱼,它们也因性腺发育不良而不能繁殖后代形成杂种体系。而用细胞核 移植的方法则能在远缘鱼类之间获得核质杂种鱼,它们因能繁殖而有可能发展为新的鱼类克隆,为用 生物工程的方法培育鱼类新品种探索一条新途径。有关此核质杂种鱼的生化等性状分析,将另文报 道。     

硬骨鱼类细胞核移植的研究进展

自１９９７年世界首例体细胞核移植绵羊“多莉”诞生以来,动物细胞核移植引起世界范围内人们的关注。硬骨鱼类具有很多优点,是研究核移植良好的材料。作者综述了硬骨鱼类细胞核移植技术的发展和完善以及在核质互作、细胞核发育全能性、鱼类育种及纯系建立等方面的应用,并对鱼类核移植存在的问题和前景进行了概括。     

影响哺乳动物细胞核移植因素的分析

细胞核移植(nuclear transplatation)是克隆具有相同遗传基础的优秀家畜的有效方法。在不远的将来,它可能成为一个广泛应用的生物技术。这一生物技术,可以使一群体内的优秀个体迅速增殖,导致快速的遗传改良,在一个繁殖周期内,获得大量与亲本遗传性状完全一致的复制子代。同时,细胞核移植又是研究哺乳动物早期胚胎发育及细胞分化过程中的基因表达与调控,不同细胞周期内,细胞核与细胞质的相互关系及其作用机理等理论问题的理想手段。在对几种哺乳动物(如小鼠、兔、羊和牛等)进行的具有开拓性研究实验中,已经显示出,哺乳动物细胞核移植作为克隆动物的一项生物技术,是进行科学研究的重要手段,并有可能投入商品化。然而,目前只有20～40％通过细胞核移植后重组的胚胎能够发育成形态学正常的桑椹胚或囊胚,能够发育产仔的就更少。这说明存在一     

家兔胚胎细胞核移植的研究

本研究以兔为实验材料,对细胞核过程中显微操作、电融合、电活化以及移核胚的培养等基本问题进行了研究。对兔进行PMSG－hCG超数排卵,收集成熟母细胞和16－细胞胚;后者经胰蛋白酶消化,去除胶膜和透明带,在不含Ca62 、Mg^2 的分离中分成单个卵裂球;然后,分别对两者做CB预处理;首次尝试采用WQilladsen法,去除卵母细胞核、并将单个卵裂球注入透明带,同时、与McGrath-Solter法进行比较;通过电融合使供体核进入去核的卵母细胞内;将所得移核胚在体外或在中间内体内培养并观察。结果表明：一、Willadsen法与McGrath-Solter法比较,核移植操作的成功率及以后的电融合率均无明显差异（Tab.1)。相对于后者,Willadsen法更简便、易于掌握并提高去核率。二、hCG超排注射后13－15h,观察卵母细胞发现：其中,67．8％保留有第一极体。此时的卵子若去除1／3胞质量,去核率可以达到58．3％。若推迟去核时间,第一极体退化,失去去核标志。三、比较不同电脉冲条件,发现强度为0．63kv/cm,持续160μs的一次电脉冲可获较高移核胚的融合率（70．8％）（Tab.2）;并可使61．1％的成熟卵母细胞活化。四、比较移核胚在体外和在中间有体内两种培养条件,前者只有34．6％能发育到6－8细胞期,而后者有23．0％能发育到桑椹胚或囊胚（Tab.3)。说明：需进一步优化家兔胚体外培养条件。     

硬骨鱼类体细胞核移植的研究

本文用不同属、科、目的硬骨鱼类作材料进行体细胞核移植研究。鲫鱼（Ｃａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓ）、鲮鱼（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ）和尼罗罗非鲫（Ｔｉｌａｐｉａｎｉｌｏｔｉｃａ）的体细胞核（头肾细胞）移植到鲤鱼（Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）的成熟去核卵中,通过继代核移植,在鲫鱼体细胞核和鲤鱼去核卵的属间组合中,获得发育到血液循环期的幼鱼;在鲮鱼体细胞核和鲤鱼去核卵的亚科间组合中,获得发育到心脏跳动期的晚期胚胎;在尼罗非鲫体细胞核和鲤鱼去枚卵的目间组合中,获得发育到肌肉效应期的胚胎。由于是直接用成鱼体细胞核作供核体进行核移植,因而能够克服供体鱼和受体鱼不同步产卵的困难。实验结果表明,这对进行硬骨鱼类核质杂交研究无疑是一种简便而又有效的方法。     

各国家畜胚胎细胞核移植研究进展

细胞核移植技术就是将成熟的卵母细胞或受精卵中的细胞核除去后移植其它细胞核,使卵母细胞不经过精子穿透等有性过程就可被激活、正常分裂并发育成新的个体。因此,核移植技术可以使细胞核供体的基因通过无性繁殖手段得到完全的复制,从而产生出克隆(无性繁殖)动物。鱼类的细胞核移植的成功报道已有很多且很早。然而哺乳动物,尤其是家畜的胚胎细胞核移植是近几年才发展起来的。     

体细胞核移植与中心体遗传

体细胞克隆虽然在多种哺乳动物中成功获得后代, 但仍存在一系列的问题需要解决。克隆胚胎的发育能力由核移植后几小时内的细胞和分子过程决定, 包括染色体分离和纺锤体的重新组装。中心体的正常组成和分布能保证染色体分离的准确性及新生和出生后克隆动物发育过程中的基因组稳定性。文章在分析哺乳动物体细胞克隆存在的问题和简介中心体结构功能的基础上, 综述了中心体在配子和受精卵发育过程中的遗传机制, 同时阐述了体细胞克隆胚胎中心体及其相关蛋白的研究现状。     

供体细胞与哺乳动物体细胞核移植

哺乳动物体细胞核移植(克隆)技术在转基因动物生产、珍稀动物资源复原与保护、生物学基础研究等方面业已显示出重要的应用价值,而目前该技术还与诱导多能干细胞技术一同被认为是创制患者特异性多能干细胞,为再生医学临床"细胞治疗"提供素材的最佳手段。但是,体细胞克隆的效率仍不理想,关键机制还不清楚,严重制约了该技术的推广。因此,如何提高克隆效率已成为人们普遍关心的首要问题。在体细胞克隆技术所涉及的各环节中,供体细胞是影响克隆效率的最关键因素之一。该文从供体细胞的生物学因素和技术因素两方面进行了回顾,旨在为进一步探寻建立物种或供体细胞个性化准备方案,为提高动物克隆效率提供参考。     

哺乳动物体细胞核移植研究现状及应用前景

扼要介绍了继世界首例体细胞克隆羊诞生后,哺乳动物体细胞核移植技术在最近3年内取得的研究进展、目前存在的问题及应用前景。     

动物体细胞核移植技术的研究现状

动物体细胞核移植的成功表明动物体细胞的分化是可逆的,这是近年来人类在细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一。１９９７年首例体细胞核移植绵羊在世界上诞生,之后不久出现了体细胞核移植小鼠及牛,并通过体细胞核移植技术制作了转基因动物。成就是不言而喻的,但其中也暴露出一些需克服和解决的问题。本文围绕世界上首例体细胞克隆羊诞生的背景、体细胞核移植技术目前的研究状况、体细胞核移植过程中的核质互作、体细胞核移植技术目前存在的问题、体细胞核移植技术在制作转基因动物上的应用等方面,扼要介绍了体细胞核移植技术在最近两年内取得的进展。     

家兔胚胎细胞核移植的研究(英文)

本研究以兔为实验材料,对细胞核移植过程中显微操作、电融合、电活化以及移核胚的培养等基本问题进行了研究。对兔进行ＰＭＳＧｈＣＧ超数排卵,收集成熟卵母细胞和１６细胞胚;后者经胰蛋白酶消化,去除胶膜和透明带,在不含Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋的分离液中分成单个卵裂球;然后,分别对两者做ＣＢ预处理;首次尝试采用Ｗｉｌａｄｓｅｎ法,去除卵母细胞核、并将单个卵裂球注入透明带,同时、与ＭｃＧｒａｔｈＳｏｌｔｅｒ法进行比较;通过电融合使供体核进入去核的卵母细胞内;将所得移核胚在体外或在中间受体内培养并观察。结果表明：一、Ｗｉｌａｄｓｅｎ法与ＭｃＧｒａｔｈＳｏｌｔｅｒ法比较,核移植操作的成功率及以后的电融合率均无明显差异（Ｔａｂ．１）。相对于后者,Ｗｉｌａｄｓｅｎ法更简便、易于掌握并提高去核率。二、ｈＣＧ超排注射后１３～１５ｈ,观察卵母细胞发现：其中,６７８％保留有第一极体。此时的卵子若去除１／３胞质量,去核率可以达到５８３％。若推迟去核时间,笫一极体退化,失去去核标志。三、比较不同电脉冲条件,发现强度为０６３ｋｖ／ｃｍ,持续１６０μｓ的一次电脉冲可获较高移核胚的融合率（７０．８％）（Ｔａｂ．２）;并可使６１１％的成熟     

人-山羊异种核移植胚胎发育的初步研究

以体外分离培养的人胚胎成纤维细胞为核供体,经血清饥饿培养后,通过显微操作技术移入山羊去核卵母细胞中,采用化学方法激活重组胚.通过体外培养观察,2-细胞胚胎发育率可达51.33%,4-细胞发育率为31.42%,但发育至桑椹胚阶段的胚胎数目大大减少,仅为9.73%.虽然目前尚未能获得异种核移植囊胚,但实验结果说明山羊成熟卵母细胞可以支持人体细胞核完成重编程,人-山羊异种体细胞核移植重组胚可在体外完成其早期发育.     

Factors Affecting Electro－Fusion and Electro－Activation In Serial Nuclear Transplantation In Goat（Carpa hircus） Embryo

ＦａｃｔｏｒｓＡｆｆｅｃｔｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏ－ＦｕｓｉｏｎａｎｄＥｌｅｃｔｒｏ－ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＩｎＳｅｒｉａｌＮｕｃｌｅａｒＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＩｎＧｏａｔ（Ｃａｒｐａｈｉｒｃｕｓ）ＥｍｂｒｙｏＷＡＮＧＹｕ－ｇｅ（王玉阁）;ＺＯＵＸ...     

克隆动物研究进展

本文介绍了世界上和中国采用细胞核移植技术克隆动物的研究历史。综述了细胞核移植的程序、方法和影响因素,包括受体卵母细胞的去核、供体细胞核的制备、核移植、激活、受体细胞与供体细胞的融合、重组胚的体内和体外培养以及胚胎移植产生克隆动物。对克隆动物研究和应用前景进行了讨论。近期的研究结果表明,多代克隆可产生大量遗传性相同的动物,不久的将来克隆技术在商业上的应用将成为现实。     

转基因红鲤体细胞的核移植

以F4代转hGH基因红鲤体细胞（肾脏和尾鳍）及培养18代的F4代转hGH基因红鲤尾鳍细胞为核供体,泥鳅或黄河鲤成熟卵为受体,进行了核移植,以探讨外源F4代转基因鱼体外源基因的分布与存在形式,稳定性和克隆转基因鱼的可能性。F4代红鲁肾脏细胞核与泥鳅卵配合的核移植胚胎有12．4％发育到囊胚,0．33％发育到神经胚;F4代尾鳍细胞核移入泥鳅卵后的重组胚发育到囊胚,神经胚、肌节期和肌肉效应期的胚胎分别为24．5％、0．3％、0．2％和0．1％;对照卵无发育。F4代红鲤尾鳍培养细胞与黄河鲤卵子配合的重组胚胎有50．53％发育到囊胚,5．69％发育到原肠胚,0．53％发育到神经胚,0．4％发育到肌节期。说明由于同种细胞核与卵细胞的相容性高于异种核卵的相容性,早期发育率高;而由于培养细胞的异倍化,后期的发育率降低。用PCR技术对供体鱼不同个体及同一体不同组织外源基因检测,结果100％个体为阳性鱼,而且不同组织的阳性率也是100％,说明外源基因均匀分布在不同组织中。无论F4代转基因鱼的肾脏细胞、尾鳍细胞还是培养的尾鳍细胞作核移植供体,核移植胚胎中hGH基因的检出率为100％。说明F4代转基因红鲤个体不同细胞都存在hGH基因,而且经长期培养不会丢失。表明F4代转基因红鲤中的外源hGH基因已基本稳定,体细胞核移植可以作为获得同质化转基因鱼的有效手段,但核移植效率还很低。另外还讨论了核质的相容性、细胞周期的协调、染色体的变异等因素对核移植的影响。     

Studies on the Developmental Potentiality of Cultured Cell Nuclei of Fish

By means of the serial nuclear transplantation technique, the authors obtained a nuclear transplant fish from subcultured cell originated from the blastula cells of the crucian carp (Carassius auratus Linnaeus). This nuclear transplant fish survived for three years, but its sexual glands were undifferentiated. The authors have also obtained a sexually mature adult fish from short-term cultured kidney cell nucleus of an adult crucian carp.Results of the experiment implied that the subcultured cell nuclei of fish blastula cells and the specialized somatic cell nuclei of adult fish still retained their developmental totipotency, and thus, it indicated that there is a possibility of fish somatic cell breeding through the use of nuclear transplantation.     

鱼类体细胞移核胚胎发育影响因素的探讨

将脱膜后的泥鳅 (Misgurnusanguillicaudatus)受精卵置于不同孵化液中孵化 ,结果表明 ,孵化液 1×Holtfreter中正常鱼苗和总鱼苗的孵化率最高 ,分别为 5 4 8%和 5 9 2 %。 1/ 2×Holtfreter、 1/ 10×Holtfreter、曝气冷开水和改变孵化液处理 ,正常鱼苗的孵化率差别不大 ,分别为 48 0 %、 49 6 %、 5 0 0 %和 48 8%。曝气冷开水畸形率最高 ,为 8 8%。PBS不适合用作孵化液。机械损伤对胚胎的孵化率无明显影响 (73 39%vs 75 70 % ) ,但对胚胎发育有明显的致畸作用 (8 0 6 %vs 0 )。以雌核发育鳙 (Aristichthysnobilis)尾鳍培养细胞作供体 ,泥鳅未受精卵作受体 ,微卫星标记分析表明 ,移核胚胎的核来源于供体核 ,受体卵中未除去的核被排斥。供体细胞培养代数严重影响移核胚胎的发育率。随着培养代数的增加 ,移核胚胎的发育率逐渐降低。继代核移植可提高移核胚胎的发育率 ,尤其是第 1次体细胞继代核移植 ,晚期囊胚的发育率急剧上升 (4 3 84%vs 7 6 9% ) ,说明继代核移植可促进受体卵对供体核的再程序化。泥鳅和大鳞副泥鳅 (Paramisgurnusdabryanus)未受精卵作受体 ,其移核胚胎发育率无明显区别 (7 6 9%vs 7 0 2 % )。     

Hypothesis of Historical Effects From Selenium on Endangered Fish in the Colorado River Basin

Anthropogenic selenium contamination of aquatic ecosystems was first associated with cooling reservoirs of coal-fired power plants in the late 1970s, and later with drainage water from agricultural irrigation activities in the 1980s. In the 1990s, selenium contamination has been raised as a concern in the recovery of currently endangered fish in the Colorado River system. Widespread contamination from seleniferous drain waters from agriculture has been documented in the upper and lower Colorado River basins. Historically, irrigation started in the upper Colorado River basin in the late 1880s. In the 1930s, selenium concentrations in various drains, tributaries, and major rivers in the upper and lower Colorado River basins were in the 100?s and 1000?s of µg/L. Native fish inhabiting large rivers such as the Colorado pikeminnow and razorback sucker were abundant before 1890, but became rare after 1910 to 1920, before the influence of mainstem reservoirs in the upper and lower Colorado River. A hypothesis is presented that selenium contamination of the tributaries and major rivers of the Colorado River basin in the 1890 to 1910 period caused the decline of the endangered fish and continues to inhibit their recovery.     

Application of Inducible and Targeted Gene Strategies to Produce Transgenic Fish: A Review

Compared to mammals, fishes offer easier transgenic technology because each female produces hundreds of eggs, the manipulated embryos do not need to be incubated inside the mother, and the probability of their harboring human-related pathogens is lower. In the last 15 years, traditional methods using injections of fertilized fish eggs and strong viral promoters have resulted in the generation of many transgenic fish species; however, they showed random genome integration with some mosaicism and episomic expression. The use of inducible gene systems that control temporal and tissue expression and of gene-targeting methodologies based on homologous recombination is desirable to control the expression, efficiency of insertion, and locus of incorporation of transgenes into fish genomes. A variety of systems developed for mammals are now available to be tested in fishes. The use of such systems would require further development of stem cell or nuclear transplant technologies in fish. Most of that work remains to be explored.