浑球红假单胞菌GOGAT缺失株中依赖Z—酮戊二酸的固氮酶诱导

2—酮戊二酸加于限量氮培养基中后,引起泽球红假单胞菌谷氨酸合成酶(GOGAT)缺失菌株(asm~-,Nif~-)固氮酶的诱导表达,诱导生成的固氮酶的活性随着培养时间的延长而下降。此时如果加入谷氨酸,固氮酶活性又重新出现,而谷氨酸通常是阻遏GOGAT缺失菌株固氮酶表达的。诱导出的固氮酶与野生菌株固氮酶有相同的调节方式,但前后两次出现的固氮酶活性在氨的敏感性上有差异。此外,在GOGAT缺失菌株内含有较高的谷氨酰胺库,同时谷氨酸胺合成酶(GS)的腺苷酸化状态也较野生型菌株高。     

酰胺态氮瞬间调节荚膜红假单孢菌光合固氮活性的GS传感机制

天门冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)对荚膜红假单孢菌固氮酶活性抑制,在表观上类似于氨关闭效应,这种抑制效应由GS参与,相似于氨抑的传感机制。中断Gln代谢的6-diazo-5-oxo-L-norleucine(DON)存在时,氨抑的持续时间延长,与此相类似,Gln抑制加剧,这可能归之于Gln的积累。但是,Gln抑制被methionine sulfoximine(MSX,GS的抑制剂)消除,消除时MSX对Gln的浓度比值约为0.2,与氨抑消除所需的MSX对氨的浓度比值相当。此外,MSX消除氨抑不为DON拮抗,表明Gln抑制固氮酶活性由GS传感。然而,不能抑制GS转谷酰基活性的methionine suffone(MSF,谷氨酸的类似物)却与MSX相同,能消除Gln和氨对固氮活性的抑制。上述观察结果也可延伸至Asn的关闭固氮酶活性效应。     

光与氨对Rhodopseudomonas capsulata固氮活性的调节

光强是调节氨瞬间抑制Rps.capsulata光合固氮活性的一个因子。与弱光(500 lx)比较,强光(30000 lx)对固氮活性氨抑的启动推迟。被氨抑制了的固氮活性在强光下较在弱光下提前解抑。经光合作用解联剂处理的菌体,强光拮抗固氮活性氨抑的现象消失。菌体ATP库水平分析表明:在氨关闭固氮活性时,库量升高。氨的同化被阻抑时,氨对光合固氮的瞬间抑制消失,菌体ATP库保持恒定。对光强与氨抑制固氮活性之间可能涉及的机制进行了探讨。     

氨和谷氨酰胺对浑球红假单胞菌（Rhodobacter sphaeroides）固氮酶...

浑球红假单胞菌菌株601具有迅速对外源氨作出“关闭”固氮酶活性的反应。氨对固氮酶的抑制作用,可被谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂MSX所解除。反之,加入Glu代谢抑制剂DON,可延长氨抑制的持续时间。Gln对固氮酶也有抑制作用。在脱腺苷化GS的透性细胞中,加入Gln可抑制固氮酶活性,同时,GS腺苷化状态提高。然而,氨则对透性细胞的固氮酶活性和GS腺苷化状态没有影响。     

光合细菌(Rhodopseudomonas capsulata)固氮活性与钼的吸收

利用紫色非硫细菌能在厌气光照下和好气黑暗下交替生长的特点和同位素~(99)Mo示踪,来探讨Rhodopseudomonas capsulata中Mo的积累与固氮酶合成的关系。 用硫酸铵和谷氨酸盐作为氮源,把Rps. capsulata置于厌气光照下生长。由于硫酸铵阻遏固氮酶,所以菌体内既无固氮酶活性也无~(99)Mo积累。而谷氨酸盐解遏固氮酶的合成,菌体则显示固氮活性并有~(99)Mo积累。 黑暗好气生长的Rps. capsulata菌体既无固氮活性,也没有~(99)Mo的积累。将这样的菌体转移到含~(99)Mo(无谷氨酸)的培养液进行光照,固氮酶活性迅速出现,同时有~(99)Mo的积累。在Rps. capsulata中钼的吸收与固氮酶的合成及活性是紧密偶联的。     

光合细菌Rhodopseudomonas capsulata谷氨酰胺合成酶的某些特性

研究了荚膜红假单孢光合细菌菌株N-3谷氨酰胺合成酶(GS)的腺苷态/脱腺苷态间互相转换和调节方式,对十六烷基三甲基溴化铵添加后的稳定,以及不同氮源对酶量的变化和腺苷态的影响。在光暗的调节上,光强在500～50001x范围内,此酶的活性几乎处于同一水平,其腺苷态和脱腺苷态之比亦不发生显著变化,但一经黑暗处理,GS活性迅速下降,相似于固氮酶活性受光、暗的调节。借助于谷氨酰胺合成酶的抑制剂MSX加入反应系统,消除了氨对固氮酶活性的瞬间抑制,但消除不了暗对固氮酶活性的瞬间抑制,表明谷氨酰胺合成酶参与了氨对固氮酶活性的瞬间调节,但并不参与固氮酶活性的光,暗瞬间调节。     

浑球红假单胞菌氨同化途径的研究

本文测定了浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株601谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和丙氨酸脱氢酶(ADH)的活性。低氨时,GS/GOGAT活力高,GDH活力低,高氨时,GS/GOGAT活力低,GDH活力高。在以分子氮或低浓度氨为氮源的培养条件下,加入GS抑制刑MSX(L—methionine—DL—sulphoximine),细菌生长受到抑制。但是,生长在以谷氨酸为氮源的细菌则不受影响。上述结果表明,浑球红假单胞菌菌株601氨同化是通过GS/GOGAT途径和GDH途径。     

固氮螺菌(Azospirillum.brasilenseYu-62)中固氮酶活性的氨关闭现象

固氮螺菌(A.brasilense)Yu-62在以谷氨酸为氮源好气液体培养条件下,氨离子使固氮酶迅速失活,Western blotting实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加NH_4^+后细胞内α-ketoglutarte和glutamine的含量.α-ketoglutarate/glutamine比值在加NH_4^+后瞬间下降然后上升,而细胞内ATP/ADP的比值没有明显变化.谷氨酸合成酶的抑制剂azaserine使固氮酶失活.Western blotting实验表明这种失活的分子基础也是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加azaserine后细胞内α-ketoglutarate及glutamine比值的变化以及外源α-ketoglutarate及glutamine对细胞固氮活性的影响,表明细胞内一些小分子化合物的变化可能是作用于固氮酶活性氨关闭的重要因素.     

固氮螺菌(Azospirillum.brasilenseYu-62)中固氮酶活性的氨关闭现象

固氮螺菌(A.brasilense)Yu-62在以谷氨酸为氮源好气液体培养条件下,氨离子使固氮酶迅速失活,Western blotting实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加NH_4~ 后细胞内α-ketoglutarte和glutamine的含量.α-ketoglutarate/glutamine比值在加NH_4~ 后瞬间下降然后上升,而细胞内ATP/ADP的比值没有明显变化.谷氨酸合成酶的抑制剂azaserine使固氮酶失活.Western blotting实验表明这种失活的分子基础也是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加azaserine后细胞内α-ketoglutarate及glutamine比值的变化以及外源α-ketoglutarate及glutamine对细胞固氮活性的影响,表明细胞内一些小分子化合物的变化可能是作用于固氮酶活性氨关闭的重要因素.     

光合细菌Rhodopseudomonas capsulata固氮活性的调节

光合细菌Rhodopseudomonas capsulata的光促固氮活性被外加少量氨迅速失活,随着菌体细胞吸取氨,周围环境中氨量下降,光合固氮活性恢复。固氮活性失活的持续时间取决于最初外加的氨量。弱光下氨对固氮活性的失活效果更为显著。谷氨酸胺和天门冬酰胺对光合固氮活性的失活和恢复与氨的作用方式具同一动力学类型。细菌光合非循环电子流抑制剂苯醋酸汞和磷酸化解联剂五氯苯酚均抑制光合固氮活性,并且与氨产生协同的抑制效果。光合细菌固氮活性被氨短时间的调节机制进行了讨论。     

铵培养的粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）中固氮酶的生物合成

粪产碱菌A—15的氮素同化途径在铵培养下以GDH途径为主,而氮培养下则以GS/GOGAT途径为主,DEAE—纤维素层析,SDS—PAGE及免疫学试验均证明,粪产碱菌在铵浓度高达30mmol/L时仍有固氮酶合成,但没有固氮活性。铵和氮培养两者细菌粗提液在电泳条带上有些差异。铵培养的粪产碱菌合成的固氮酶,在解阻遏后,仍可出现固氮活性。     

在林可霉素生物合成过程中铵离子调控作用的酶学研究

在FUS-50L发酵罐内,用林可链霉菌发酵生产林可霉素。研究发现,NH4^＋对林可霉素发酵过程具有显著的调控效应：补入硫酸铵前,发酵液中的NH4^＋浓度由3．0mmol／L消耗至1．0mmol／L以下的控制过程非常关键,这样可能使林可霉素合成酶大量合成,同时,解除了NH4^＋对谷氨酰合成酶（GS）的阻遏效应;20～24h,尽可能提高硫酸铵的平均补入速率,但最高NH4^＋的瞬时浓度应控制在19．0mmol／L以下,一方面可缩短生物量的积累时间,另一方面可避免过高浓度的NH4^＋对GS的抑制作用;24h后逐渐降低NH4^＋的平均补入速率,使主代谢流转入次级代谢;在发酵中期和后期,应将最低NH4^＋浓度控制在3．0～4．0mmol／L的范围内,避免铵离子对GS的阻遏效应,GS比活力与林可霉素的产量呈正相关关系。最终建立了动态的硫酸铵补加工艺。     

无机钼酸在棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)体内的累积和转化

醋酸铵培养的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii),经超声击碎高速离心制备粗提取液、DEAE-纤维素柱层析表明,体内~(99)MoFe蛋白合成受到阻遏,在0.15 M NaGl洗脱分部中,除~(99)Mo储存蛋白峰外,还存在一个无机~(99)MoO_4~=组分。醋酸铵培养的棕色固氮菌经去阻遏后,在体内固氮活性出现的同时,可观察到原先菌体内累积的~(99)Mo储存蛋白峰降低,无机~(99)MoO_4~=的组分几乎消失以及~(99)MoFe蛋白合成。若去阻遏过程存在氯霉素,则菌体不显示固氮活性,(99)MoFe蛋白不再合成,储存蛋白和无机铝酸组分中~(99)Mo的转移停止。     

杭州稻麦菜轮作地区大气氮湿沉降

通过雨水中NH+4-N/NO-3-N比率和铵态氮自然丰度值(δ15NH+4)的变化探讨大气氮湿沉降与农作施肥活动的关联性. 2003年6月至2005年7月,采用自行设计定制的雨水收集器在浙江杭州稻-麦-蔬菜轮作地区进行了为期2a的全天候连续雨水采样分析.结果显示,杭州稻-麦-蔬菜轮作地区雨水中NH+4-N/NO-3-N比率和δ15NH+4值呈现相似的季节性变化,雨水中NH+4-N/NO-3-N的峰值出现在6月底～9月上旬,而后逐渐下降,秋冬季(10～11月份)降到最低;来春麦菜集中施肥期(2～3月份),又呈现多个小高峰;5～6月份为单季稻和蔬菜基肥和追肥集中施用期,故而峰值也达4以上;入冬后仅在麦田施肥期出现一个小高峰而后明显下降,大都降到1以下;频繁施肥期雨水中的NH+4-N/NO-3-N比率值是农闲期的2～4倍,显示雨水NH+4-N/NO-3-N比率与农田施肥活动有密切关联与同步性,但与气温无直接关联(R2=0.0129).雨水中δ15NH+4值的变化,与雨水中NH+4-N/NO-3-N比率相似,呈现明显的季节性变化:稻麦生育后期与种前空闲期为正值,麦稻蔬菜集中施肥期转为负值.雨水中NH+4-N/NO-3-N比率与δ15NH+4值对大气湿沉降中氮的来源、形态及地面NH3排放源的强度有一定的表征意义.     

Relationships between nitrogenase,glutamine synthetase,glutamine, and energy charge in Azotobacter vinelandii

When continuous cultures of Azotobacter vinelandii were supplied with ammonium or nitrate in amounts, which just repressed nitrogenase synthesis completely, both the intracellular glutamine level and the degree of adenylylation of the glutamine synthetase (GS) increased only slightly (from 0.45–0.50 mM and from 2 to 3 respectively), while the total GS level remained unaffected. Higher amounts of ammonium additionally inhibited the nitrogenase activity, caused a strong rise in the intracellular glutamine concentration and adenylylation of the GS, but caused no change in the ATP/ADP ratio. These results are considered as evidence that in A. vinelandii the regulation of nitrogenase synthesis is not linked to the adenylylation state of the GS and to the intracellular glutamine level, and that the inhibition of the nitrogenase activity as a consequence of a high extracellular ammonium level is not mediated via a change in the energy charge.Abbreviations GS glutamine synthetase - GS-S(Mg) Mg²⁺ dependent synthetic activity of GS - GS-T(Mn) Mn²⁺ dependent transferase activity of GS     

Effect of light intensity and inhibitors of nitrogen assimilation on NH4+ inhibition of nitrogenase activity in Rhodospirillum rubrum and Anabaena sp

Nitrogenase activity in Rhodospirillum rubrum was inhibited by NH4+ more rapidly in low light than in high light. Furthermore, the nitrogenase of cells exposed to phosphorylation uncouplers was inhibited by NH4+ more rapidly than was the nitrogenase of controls without an uncoupler. These observations suggest that high levels of photosynthate inhibit the nitrogenase inactivation system. L-Methionine-DL-sulfoximine, a glutamine synthetase inhibitor, prevented NH4+ from inhibiting nitrogenase activity, which suggests that NH4+ must be processed at least to glutamine for inhibition to occur. An inhibitor of glutamate synthase activity, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, inhibited nitrogenase activity in the absence of NH4+, but only in cells exposed to low light. The mechanism of 6-diazo-5-oxo-L-norleucine inhibition appeared to be the same as that induced by NH4+, because nitrogenase activity could be restored in vitro by activating enzyme and Mn2+. The inhibitor data suggest that the glutamine pool or a molecule that responds to it activates the Fe protein-modifying (or protein-inactivating) system and that the accumulation of this (unidentified) molecule is retarded when the cells are exposed to high light. It was confirmed here that Anabaena nitrogenase is also inhibited by NH4+, but only when the cells are incubated under low light. This inhibition, however, unlike that in R. rubrum, could be completely reversed in high light, suggesting that the mechanisms of nitrogenase inhibition by NH4+ in these two phototrophs are different.     

浑球红假单胞菌及其谷氨酸合成酶突变株氢酶活性和合成

浑球红假单胞菌野生型菌株的氢酶表达被有机碳、氮底物所抑制。在光照和黑暗时,氧浓度变化对氢酶的作用不同,但高氧浓度都阻遏氢酶的表达。微量Ni~(2+)能专一性地促进氢酶活性,固氮酶的产氢也可以调节氢酶的表达水平。该野生菌株的GOGAT突变株缺乏固氮酶和氢酶活性,在加入谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX后,固氮酶和氢酶以相关联的方式合成出来,固氮酶产生的氢看来诱导了氢酶的合成。然而在固氮酶不表达的情况下,外源氢也可诱导氢酶的合成。