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在大肠杆菌中提高人α1b型基因工程干扰素的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
将人α1b型干扰素(IFN-α1b)基因插入带有原核增强子样序列的新型载体Pbv322,使干扰素在大肠杆菌中的表达水平明显高于原表达载体,达到1.6×108u/L培养液。重组质粒的特点是:含增强子序列X,trp启动子控制。利用DEAE-Sepharose、CM-Sepharose离子交换层析及单克隆抗体亲和层析纯化IFN-α1b,获得了电泳纯产品,其比活性为2×107u/mg,分子量为19kDa。此外,用Pat153代替Pbv322,构建了带有和不带有X序列的两种表达载体,平行对比表明增强子X序列可以将IFN-α1b表达提高4倍 相似文献
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cIts857基因的克隆,修饰及温敏诱导表达载体 总被引:7,自引:5,他引:2
从噬菌体λDNA克隆出990bp的cIts857基因,经缺失,点突变等修饰改造和DNA序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型cIts857基因(770bp)。进而利用它大肠杆菌表达载体pBLMVL2和一套含3种不同阅读框架Iinker区的表达载体pBLMFV4、5B、6。上述表达载体,用于表达人工合成的牛生长激素、人干扰素-γ△C-13和酵母pho85等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。 相似文献
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人乳头瘤病毒6b型H增强子样序列在大肠杆菌中增强基因转录和β-干扰素表达 总被引:1,自引:0,他引:1
将人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)基因组上游调控区(URR)540bp的Sau3A-NarI片段(H序列),正反向插入β-干扰素表达载体Trp启动子上游,使β-IFN表达明显增强,可使基因表达水平提高3.6倍(正向)和2.1倍(反向)。H序列正反向插入增强子检测载体不仅使β-半乳糖苷酶表达活性增加5-10倍,还能使半乳糖苷酶mRNA量明显增高,证明H序列对被调控基因的增强作用是发生在转录水平。 相似文献
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将人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)基因组上游调控区(URR)540bp的Sau3A-Narl片段(H序列),正反向插入β-干扰素表达载Trp劝子上游,使β-IFN表达明显增强,可使基因表达水平提高3.6倍和2.1倍。H序列正反向插入增强子检测载体不仅使β-半乳糖苷酶表达活性增加-10倍,还能使半乳糖苷酶mRNA量明显增高,证明H序列对被调控基因的增强作用是发生在转录水平。 相似文献
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利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克隆了枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列,将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,获得分泌型表达载体pUS186。为了测试构建的载体pUS186的功能,将地衣杆菌α-淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Bal31酶切,T4DNA聚合酶补齐等处理,获得pUSA186Ⅱ及pUSA186Ⅰ系列质粒,将这些重组质粒转化枯草杆菌QB1130(amy-)后都能向胞外分泌淀粉酶,酶活测定结果表明,基因表达水平比用原有的启动子高1-2倍,蛋白质分泌率在84-96%之间。 相似文献
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cIts857基因的克隆、修饰及温敏诱导表达载体 总被引:1,自引:1,他引:1
从噬菌体λDNA(cIindlts857Sam7)克隆出990bP的cIts857基因,经缺失,点突变等修饰改造和DNA序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型cIts857基因(770bp)。进而利用它构建大肠杆菌表达载体pBLMVL2和一套含3种不同阅读框架linker区的表达载体pBLMFV4、5B、6。上述表达载体;用于表达人工合成的牛生长激素(bGH)、人干扰素-γΔC-13和酵母pho85等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。这些表明,克隆、修饰并组建到表达载体中的λ噬菌体cIts857基因表达出具有功能作用的转录阻遏蛋白,使上述PL启动子控制下的大肠杆菌表达载体可经温敏诱导而高效表达外源基因产物. 相似文献
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HIV—1 SF2株env基因(120)在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
运用基因重组技术,将HIV-1 SF2株编码外膜蛋白gp120的env基因片段与原核载体pBV220进行重组,构建成质粒pBVSF2env,并在大肠杆菌(E.CoilDH10b)中获得表达,经Westemblot反应证实,该重组蛋白与来自HIV-1感染者的血清(含多克隆抗体)发生特异性反应。 相似文献
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人肝金属硫蛋白突变体β基因通过同源重组在蓝藻中的克隆与表达 总被引:5,自引:0,他引:5
将人肝金属硫蛋白(MT)突变体β基因插入到中间载体pRL-439上的强启动子PpsbA 下游,利用载体pRL-β上的PpsbA 和β基因与phasm id pTZ18-8上整合平台PsbB,构建整合表达载体pTZ-β.整合平台PsbB与集胞藻(Synechocystissp.PCC6803)染色体DNA 上psbB基因下游片段为同源序列.为了发生单交换同源重组,将外源基因β插入到整合平台PsbB下游的克隆位点.利用自然转化方法将表达载体pTZ-β整合到Synechocystitsp.PCC6803的染色体上.经氨苄青霉素筛选得到遗传性状稳定的转基因蓝藻.Southern blotting 证明β基因已整合到Synechocystis sp.PCC6803的染色体上;Western blotting 表明β基因已在蓝藻中表达.ELISA 测定在Zn2+ 浓度为150 μm l/L时表达量最高,为590 μg/g 鲜藻;原子吸收表明转β基因的藻对Zn2+ 的富集能力约为野生型的2倍. 相似文献
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抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
将抗真菌蛋白Rs-AFP1和Rs-AFP2全长cDNA插入表达质粒pET-22b/NcoI+SacI位点,构建成融合蛋白表达载体pRAF1和pRAF2.将不含信号肽编码序列的Rs-AFP1和Rs-AFP2cDNA分别插入pET-22b/Ncol+Sacl和pET-22b/Ndel+SacI位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体pRAF3、pRAF4和非融合蛋白表达载体pRAF5和pRAF6.将构建的上述各种表达载体转化E.coliBL21,挑菌落培养,IPTG诱导,使Rs-AFPs基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,pRAF3和pRAF4表达产物的抑菌活性较明显. 相似文献
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利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列。将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,获得分泌型表达载体pUS186。为了测试构建的载体pUS186的功能,将地衣杆菌α-淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Bal 31酶切,T4 DNA聚合酶补齐等处理,获得pUSA186I 相似文献
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利用DNA重组技术,将转录因子NF-κBp50基因片段插入pGEX-2T质粒载体,经DNA序列分析证明克隆的正确性.将重组的pGEX-2T/p50转化入大肠杆菌JM109,表达出pGEX-2T/p50融合蛋白.经WesternBlot检测证实表达产物对抗p50c的抗体呈特异性反应,表明克隆的正确性,并成功地应用纯化的p50蛋白制备了免疫血清.为进一步对NF-κB的功能进行研究打下了良好的基础 相似文献
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抗结肠癌相关抗原单链抗基因的构建和表达 总被引:3,自引:2,他引:1
通过PCR扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列,轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为VH-linker-VL形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行了表达,SDS-PAGE分析结果表明,以pComb3为载体,在大肠杆菌JM83中,scFv未获得有效表达,而以pET-22b(+)为载体的scFv在大肠杆菌BL21(DE3)中,30℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白 相似文献
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将化学合成的RGD肽(Arg-Gly-Asp)编码寡核苷酸与尿激酶B链cDNA相连成为融合基因后,克隆至原核表达质粒pBV220中,在PRPL自动子的作用下,经42℃热诱导,在大肠杆菌DH5α中获得了融合基因的表达,其表达量占菌体总蛋白的9.2%,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物,经Western-blotting分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性, 相似文献
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人肺癌细胞CPP32基因的克隆及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
蛋白酶尤其是ICE家族的蛋白酶是细胞死亡机制的核心成分.ICE蛋白酶家族中,CPP32(又称Yama,apopain)在不同形式的凋亡途径中起核心作用.为深入研究CPP32的结构与功能,克隆了CPP32基因,并在大肠杆菌中进行了表达.采用RT-PCR技术从人肺癌细胞株中获得了CPP32蛋白酶基因.DNA序列分析表明,该基因由已报道的编码CPP32αp20亚单位和CPP32βp10亚单位的核苷酸组成,提示ICE家族蛋白酶寡聚化可能受DNA水平调控.将获得的CPP32基因分别重组到pBV321和pEX31B载体上,并分别转化到大肠杆菌中,均获得了CPP32基因的较高表达,表达产物主要以包涵体形式存在. 相似文献
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HIV—1Gag蛋白在大肠杆菌和重组杆状病毒系统中的高效表达及通用型 … 总被引:1,自引:0,他引:1
将中国株HIV-1B亚型gag全基因序列,克隆杆状病毒表达载体pfastbacI中,构建了重组质粒pfastGag,利用细菌/杆状病毒表达和筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞中高效表达HIV-1Gag蛋白。通过改造原核表达载体pBV220和pET28,构建了一种新的通用型温控原核表达载体质粒pVV5,该载体携带PrPl串联温控启动子及His-Tag纯化标签,利于目的的蛋白表达与纯化。 相似文献
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欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
根据已知基因序列,利用PCR技术,从克隆质粒和欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB125染色体中重新扩增得到含有2-酮基醛糖还原酶A和B(2-KRA和B)基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体pBL并转化大肠杆菌BH5α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活 相似文献
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一种新型人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达 总被引:8,自引:2,他引:8
采用多位点突变引物和PCR方法对合成的人肿瘤坏死因子进行了突变,通过这一突变,人肿瘤坏死因子的第二位精氨酸的密码子CGT被变为赖氨酸密码子AAA,将突变后的基因插入表达载体pSB-92的PL启动子下游得到重组质粒pSB-TNF-K2,并在大肠杆菌中进行表达。突变体[Lys2]hTNF-α的表达产率达到菌体内总蛋白质的60%以上,且为一可溶性蛋白质并易于纯化。同野生型hTNF-α相比,[Lys2]hTNF-α具有稍低的毒性,但对于某些人肿瘤细胞株表现出高于数十到数百倍的抑制活性. 相似文献