基于生物芯片探讨高脂饮食对动脉粥样硬化小鼠基因组DNA甲基化的影响

目的:采用DNA甲基化芯片技术探讨高脂饮食对Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化模型全基因组DNA甲基化的影响。方法:30只雄性Apo E-/-小鼠随机分为正常组与高脂组,每组15只,正常组给予正常饲料喂养,高脂组给予高脂饲料喂养。16周后,测其血脂、血清同型半胱氨酸水平(Hcy)水平、血清DNA甲基化与血清DNA甲基化转移酶(DNMTs)水平;采用DNA甲基化芯片检测两组小鼠主动脉组织全基因组甲基化情况。结果:与正常组相比,高脂组小鼠血清CHOL、TG、LDL-C均显著升高,HDL-C显著下降;血清DNA甲基化水平与血清DNA甲基化转移酶(DNMTs)水平均显著升高。甲基化芯片结果显示:与正常组相比,高脂组主动脉全基因组中共有875个基因甲基化发生改变,差异具有统计学意义(P0.05),其中高甲基化基因数目496,占总数56.69%;低甲基化基因数目379,占总数的43.31%。结论:高脂饲料可升高主动脉基因组甲基化水平,降低基因组的表达,可能是Apo E-/-小鼠容易形成动脉粥样硬化的机制之一。     

绞股蓝总皂苷调节自噬小体对动脉粥样硬化的防治作用

为探究绞股蓝总皂苷调节自噬小体对动脉粥样硬化的防治作用。本研究分体内、体外实验。体内实验:30只健康Apo E-/-小鼠随机分为3组,模型组、绞股蓝总皂苷组和辛伐他汀组,每组10只。10只C57BL/6J小鼠为正常组。模型制备及给药干预完成后,全自动生化分析仪检测各组小鼠血脂水平,Western blot技术检测各组小鼠主动脉Atg3、Atg4c、Atg5、Atg12蛋白表达情况。体外实验:培养EA.hy926细胞,随机分为正常组、模型组、绞股蓝总皂苷组、人参皂苷GRb3组和绞股蓝皂苷XILX组。Western blot技术检测各组细胞自噬小体形成信号通路相关蛋白Atg3、Atg4c、Atg5、Atg12的表达情况。结果发现,绞股蓝总皂苷能够降低Apo E-/-小鼠血清中的TG、TC、LDL-C水平(P0.01),提高血清HDL-C水平(P0.01)。且绞股蓝总皂苷能够提高Apo E-/-小鼠主动脉Atg3、Atg4c、Atg5、Atg12蛋白表达水平(P0.05或P0.01)。绞股蓝总皂苷、人参皂苷GRb3和绞股蓝皂苷XILX能够提高ox-LDL诱导的EA.hy926细胞自噬小体相关蛋白Atg3、Atg4c、Atg5、Atg12的表达水平(P0.01)。且绞股蓝总皂苷效果最好。以上结果说明,股蓝总皂苷可能通过促进自噬小体形成,降低Apo E-/-小鼠血清血脂水平,保护EA.hy926细胞抗内皮损伤,进而发挥其防治AS的生物学作用,且在该过程中人参皂苷GRb3和绞股蓝皂苷XILX可能是绞股蓝总皂苷中发挥关键作用的有效成分。     

miR-124靶向TNF-α促进猪皮下脂肪细胞分化

前期研究中采用双萤光素酶报告基因验证了mi R-124与脂解因子猪TNF-α之间的靶关系,以此为基础研究mi R-124是否影响猪皮下脂肪细胞的分化。采用mi R-124模拟物mimics和抑制物inhibitor分别转染猪脂肪前体细胞并诱导其分化成成熟脂肪细胞,检测细胞的聚脂情况,甘油及甘油三酯的含量变化,荧光定量检测脂肪细胞关键转录因子PPARγ,脂肪合成和分解的主要酶FASN和HSL基因的表达变化。结果显示,过表达mi R-124能抑制TNF-α蛋白的表达,脂肪细胞脂滴多于对照组,甘油三酯(TG)含量显著增加(P0.01),甘油含量亦显著增加(P0.05),PPARγ、FASNT和HSL的表达显著上调(P0.01);抑制细胞mi R-124的表达脂滴则较少,TG含量显著减少(P0.05),PPARγ和FASN的表达均显著下调(P0.05)。mi R-124可能通过抑制TNF-α调节猪脂肪细胞的分化,为后续研究mi R-124调节脂肪代谢的相关机制奠定基础。     

miR-486通过靶基因Pten/Foxo1调控小鼠肝细胞脂质代谢

该文研究了mi R-486在小鼠肝细胞内是否可通过调控其靶基因Pten(phosphatase and tensin homolog,同源性磷酸酶–张力蛋白)/Foxo1(forkhead box O1,叉头转录因子)进而影响甘油三酯(triglyceride,TG)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的合成。采用腺病毒载体感染小鼠肝癌细胞Hepa1-6,并测定靶基因Pten/Foxo1表达及VLDL和TG变化。腺病毒载体感染mi R-486的模拟剂(mimic)和抑制剂(antago)至细胞株Hepa1-6,Ad-mi R-486 mimic组mi R-486水平显著增加(P0.001),PTEN/Fox O1的m RNA和蛋白质水平显著降低,细胞内VLDL含量显著降低(P0.01),TG含量明显增加(P0.05);反之,Ad-mi R-486 antago组mi R-486表达水平受到抑制,PTEN/Fox O1的m RNA和蛋白质水平显著增加(P0.01),且细胞内VLDL含量显著增加(P0.01),TG含量明显降低(P0.05)。该研究结果表明,mi R-486可能通过调节Pten/Foxo1来影响细胞内的VLDL和TG生成。     

miR-181b-5p调控TIMP3对apoE~(-/-)鼠动脉粥样硬化炎症影响及相关因子检验

为探究mi R-181b-5p靶向调控TIMP3对apo E~(-/-)鼠动脉粥样硬化炎症的影响,本研究基于生物信息学预测筛选,并采用双荧光素酶报告基因系统验证mi R-181b-5p靶基因。同时在ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞及apo E~(-/-)动脉粥样硬化模型小鼠中检测mi R-181b-5p靶基因m RNA及蛋白水平的表达情况,并且检测转染mi R-181b-5p后细胞水平和动物体内炎症因子TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18、CCL2的表达变化。此外,通过病理切片方法检测转染mi R-181b-5p后小鼠主动脉窦处病变情况。研究通过双荧光素酶报告基因系统验证TIMP3为mi R-181b-5p靶基因,并在ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞及apo E~(-/-)动脉粥样硬化模型小鼠中证明了mi R-181b-5p可以降低TIMP3转录水平从而降低其蛋白水平表达,同时研究发现mi R-181b-5p在细胞水平和动物体内均会增强炎症因子TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18、CCL2的表达,并可以增加小鼠主动脉窦处病变面积。研究认为在动脉粥样硬化发生中,mi R-181b-5p可以增加病变面积并且提升相关炎症因子的表达、分泌,其作用机理很可能是通过抑制靶基因TIMP3表达,进而降低TIMP3蛋白水平实现的,为研究动脉粥样硬化机制提供了理论依据。     

miR-24对心脏成纤维细胞生长和迁移的影响及机制研究

目的:探讨miR-24对心脏成纤维细胞的生长和迁移的影响及机制。方法:采用RT-PCR检测心肌细胞和心脏成纤维细胞中mi R-24的表达水平。在心脏成纤维细胞中转染mi R-24 mimics、mimics control、mi R-24 inhibitors、inhibitors control后,通过Western blot检测细胞中Col-1、α-SMA的表达,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Transwell小室检测细胞迁移能力。通过靶基因预测库预测mi R-24的靶基因,荧光素酶鉴定靶基因的正确性,并通过RT-PCR和Western blot检测转染后细胞中Furin的表达。结果:心脏成纤维细胞HEH2中mi R-24的表达水平与心肌细胞H9C2相比差异显著(P0.01),心脏成纤维细胞中mi R-24表达上调。mi R-24 mimics组中Col-1、α-SMA的表达水平明显低于mimics control组(P0.01)。mi R-24 mimics组中细胞OD值较mimics control组显著降低(P0.01),mi R-24 inhibitors组中细胞OD值较inhibitors control组显著升高(P0.01)。mi R-24 mimics组、mimics control组、mi R-24 inhibitors组、inhibitors control组细胞凋亡无显著性差异(P0.05)。mi R-24 mimics组细胞迁移数目明显低于mimics control组,差异显著(P0.01),mi R-24 inhibitors组细胞迁移数目高于inhibitors control组,差异显著(P0.05)。mi R-24 mimics组细胞中Furin蛋白和m RNA水平明显降低,野生型Furin和mi R-24 mimics共转染的细胞中荧光素酶活性最低。结论:mi R-24在心脏成纤维细胞中高表达,通过靶基因Furin抑制心脏成纤维细胞合成Col-1、α-SMA,抑制心脏成纤维细胞增殖和迁移。     

血管紧张素Ⅱ持续皮下灌泵诱导Apo E-/-小鼠建立腹主动脉瘤模型的探讨

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)皮下灌泵诱导Apo E-/-小鼠建立腹主动脉瘤模型的特点和可行性。方法:选取8-10周龄雄性Apo E-/-小鼠,通过植入式微量渗透释放泵皮下泵入AngⅡ(1000 ng/kg·min),持续泵入28天;对照组小鼠泵入生理盐水28天。取材后,测量小鼠腹主动脉直径,固定包埋做石蜡切片进行HE及弹力纤维染色,用Real-time PCR方法检测腹主动脉中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果:AngⅡ处理组小鼠成瘤率为80%,腹主动脉直径较生理盐水对照组明显增加(P0.05);病理染色显示炎症细胞明显增多,弹力纤维断裂增多,胶原合成增多。小鼠腹主动脉α-SMA m RNA表达较对照组显著降低(P0.05),而OPN m RNA表达较对照组明显增高(P0.05)。结论:通过AngⅡ连续灌注28天可以诱导Apo E-/-小鼠发生腹主动脉瘤,腹主动脉平滑肌细胞由收缩型向分泌型转化可能作为小鼠腹主动脉瘤发生的鉴定及治疗靶点之一。     

孕激素诱导的microRNA-1a抑制子宫内膜上皮细胞增殖

本文旨在研究孕激素诱导micro RNA-1a(mi R-1a)在子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelial cells,EECs)的表达及其对EECs增殖的作用。用雌激素(E2组)或雌、孕激素联合(E2P4组)处理去卵巢小鼠,q PCR检测mi R-1a的成熟体mi R-1a-3p的表达;将mi R-1a-3p拟似剂或抑制剂注入各组小鼠的一侧子宫角,另一侧注入拟似剂或抑制剂对照,流式细胞术检测mi R-1a-3p对EECs细胞周期的影响;免疫组化检测mi R-1a-3p对细胞周期蛋白cyclin D2、cyclin E1和cyclin E2表达的影响。在体外实验,将分离培养的原代小鼠EECs分为两组,分别给予雌激素处理(E2组)和雌、孕激素联合处理(E2P4组),q PCR检测mi R-1a-3p的表达;再用mi R-1a-3p拟似剂作用于雌激素预处理细胞,对照组给予非特异性拟似剂,Ed U掺入实验检测细胞增殖活性。体内q PCR结果显示,E2P4组小鼠EECs mi R-1a-3p的表达量相比E2组明显增加(P0.05)。流式细胞术结果显示mi R-1a-3p拟似剂能够将E2处理细胞的细胞周期进程阻滞在G1/S期(P0.05);mi R-1a-3p抑制剂能够部分逆转P4对细胞周期进程的G1/S期阻滞(P0.05)。小鼠子宫组织免疫组化结果显示mi R-1a-3p拟似剂能较明显地抑制cyclin E1和cyclin E2蛋白的表达(P0.05),而对cyclin D2蛋白表达无影响(P0.05)。体外q PCR结果显示E2处理组和E2P4联合处理组细胞中都未检测到mi R-1a-3p表达,体外Ed U掺入实验表明外源性mi R-1a-3p拟似剂能够一定程度抑制雌激素促细胞增殖作用(P0.05)。以上结果表明,孕激素可通过诱导mi R-1a-3p表达引起细胞周期G1/S期阻滞,从而抑制EECs细胞增殖,这种抑制增殖作用与其抑制cyclin E1和cyclin E2蛋白表达有关。     

miR-33s在NF-κB抑制ABCA1表达及胆固醇流出中的作用

为探讨mi R-33s在核因子κB(NF-κB)抑制三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)表达及胆固醇流出中的作用,THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞经不同浓度脂多糖(LPS)处理,活化NF-κB,或以PDTC(NF-κB抑制剂)预处理细胞后再加入LPS,实时荧光定量PCR检测细胞mi R-33s及其宿主基因胆固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)的表达,蛋白质印迹法检测SREBPs的蛋白质表达,染色体免疫共沉淀检测NF-κB p65与SREBPs启动子区结合情况;LPS处理基础上,转染mi R-33s抑制物或mi R-33s模拟物,RT-PCR检测ABCA1 m RNA表达水平,蛋白质印迹法检测ABCA1蛋白水平,液体闪烁计数仪检测细胞内的胆固醇流出.结果显示,NF-κB活化促进mi R-33s及SREBPs的表达,使用PDTC抑制NF-κB,细胞内mi R-33s和SREBPs的表达下降;NF-κB p65可与SREBPs启动子区直接结合;转染mi R-33s抑制剂后,NF-κB活化对ABCA1的抑制作用减弱,胆固醇流出增强;相反,转染mi R-33s抑制物,NF-κB活化对ABCA1的抑制作用增强,胆固醇流出减弱.结果提示,NF-κB活化可促进mi R-33s表达,抑制ABCA1及胆固醇流出.     

miR-223在结肠癌组织中的表达及促进结肠癌细胞迁移侵袭的机制研究

目的:探讨微小RNA-223 (mi R-223)在结肠癌组织中的表达及对结肠癌HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响及机制。方法:检测mi R-223在结肠癌组织与癌旁组织中的表达。通过脂质体转染法将mi R-223模拟物(mi R-223 mimics,mi R-223 mimics组)及microRNA无关序列(mi R-223 NC,NC组)转染入结肠癌HT-29细胞。采用Real-time PCR检测转染后细胞中mi R-223和TWIST的表达,Western blot检测TWIST的蛋白表达,Tranwell检测细胞的迁移与侵袭能力。双荧光素酶报告基因检测mi R-223对TWIST基因启动子活性的影响。采用Transwell迁移与侵袭实验检测mi R-223 mimic及Twist si RNA共转染后人结肠癌细胞系HT-29迁移与侵袭能力的变化。结果:与癌旁结肠组织比较,mi R-223在结肠癌组织中呈现明显高表达(P0.05);与空白对照组和mi R-223 NC组比较,转染mi R-223 mimics后的HT-29细胞中的mi R-223表达显著增加(P0.05)。与阴性对照组和空载转染组相比较,mi R-223 mimics转染组穿透的细胞数目明显增加(P0.05),且mi R-223 mimics转染组的细胞侵袭能力显著增强(P0.05)。与mi R-223 NC组和空白对照组比较,转染mi R-223 mimics的HT-29细胞的TWIST基因m RNA和蛋白表达均显著增加(P0.05)。双荧光素酶检验结果显示TWIST为mi R-223的下游靶基因。共转染TWIST si RNA和mi R-223 mimics的结肠癌HT-29细胞的迁移与侵袭能力较单独转染mi R-223 mimics的HT-29细胞显著减弱(P0.05)。结论:mi R-223可能通过上调下游靶基因TWIST水平促进结肠癌HT-29细胞的迁移与侵袭。     

miR-181a通过调控上皮间质转化过程影响卵巢癌细胞的迁移和侵袭

目的:探讨mi R-181a在卵巢癌细胞中的表达及对卵巢癌细胞的迁移和侵袭的影响和可能机制。方法:采用细胞免疫荧光检测卵巢癌细胞中抗波形蛋白和E-钙粘蛋白的表达,Western blotting检测mi R-181a对抗波形蛋白和E-钙粘蛋白的表达情况的调控;划痕愈合实验检测mi R-181a对卵巢癌细胞迁移能力的影响;Transwell侵袭实验检测mi R-181a对卵巢癌细胞侵袭能力的影响。结果:增加mi R-181a的表达后,EMT过程中的相关蛋白激活水平下调,mi R-181a一定程度上可以抑制卵巢癌细胞的EMT过程;过表达mi R-181a后可以明显影响Vimentin[D1(4.58±0.85)vs(0.29±0.02),P0.05;D5(4.16±0.79)vs(0.29±0.02),P0.05]和E-Cadherin[D1(4.75±0.41) vs.(4.56±0.38),P0.05;D5(2.19±0.18) vs.(4.56±0.38),P0.05]蛋白的表达;COC1细胞的迁移能力随mi R-181a的表达的增高而降低[(19.24±4.31)%vs.(25.95±6.02)%,P0.05;(51.25±8.75)%vs.(73.49±12.54)%,P0.05];过表达mi R-181a后可以一定程度上减弱卵巢癌COC1细胞的侵袭能力[(74.64±8.21)vs(231.98±21.72),P0.05]。结论:mi R-181a通过调控上皮间质转化过程影响卵巢癌细胞的迁移和侵袭行为。     

腺苷酸环化酶3缺失对小鼠主要嗅觉表皮组织内DNA甲基化的影响

腺苷酸环化酶3 (adenylate cyclaseⅢ,AC3)是嗅觉系统中的重要成分,AC3缺失后小鼠的主要嗅觉表皮组织(main olfactory epidermal,MOE)随年龄增长逐渐变薄,MOE内基因表达谱发生改变. DNA甲基化在动物发育、基因表达调控中具有重要作用.为了探讨AC3缺失后小鼠MOE内基因启动子甲基化水平的改变以及对基因表达的影响,本文采用DNA甲基化免疫共沉淀芯片(methylated DNA immunoprecipitation chip,MeDIP-chip)筛选AC3缺失小鼠MOE内启动子区甲基化差异表达基因,利用甲基化特异PCR (methylation-specific PCR,MSP)、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)进一步检测部分甲基化差异基因的DNA甲基化水平改变和表达差异.结果表明,AC3缺失小鼠中有1 978个基因启动子的甲基化水平发生了改变,占总探针数的9%,其中727个基因启动子甲基化水平升高,1 251个甲基化水平降低.功能分析表明,这些启动子甲基化发生改变的基因主要涉及的功能分别与嗅觉受体、神经发育、cAMP信号通路、ATP结合、钙离子调控、乙酰化修饰、转录因子等相关. MSP检测表明,嗅觉受体基因Olfr1153、Olfr231、Olfr378、Olfr651、Olfr691启动子区的甲基化水平升高,Cngb1、Pde4a和Olfr1394基因启动子区的甲基化水平降低. qRT-PCR结果显示,基因Cngb1、Hcn4、Olfm1、Olfr1394、Olfr1153、Olfr231、Olfr378、Olfr691的表达水平显著下降,而Pde4a和Olfr651基因的表达水平显著升高.总之,AC3缺失后MOE内嗅觉受体基因、神经发育相关基因、cAMP信号通路等相关基因启动子甲基化水平发生显著改变,影响核苷酸切除修复、DNA复制、错配修复等信号通路的传导,从而综合调控小鼠MOE内的基因表达数量和水平.     

过表达MicroRNA-21通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控人退变髓核细胞自噬的研究

目的:探讨过表达mi R-21通过PTEN/PI3K/AKT通路对人退变髓核细胞自噬的影响。方法:构建稳定过表达mi R-21 mimic人退变髓核细胞,转染无意义序列作为mi R-21 mimic control组,采用RT-qPCR检测转染效率;利用MDC荧光染色法观察细胞自噬泡;Western-Blot检测细胞自噬相关蛋白LC3和P62的表达以及PTEN/PI3K/AKT信号通路中关键蛋白PTEN、PI3K及AKT的表达水平。结果:RT-qPCR结果表明mi R-21 mimic转染成功且效率较高,与mi R-21 mimic control组及空白细胞对照组相比,差异显著(P0.05)。荧光显微镜观察MDC染色情况,mi R-21 mimic组的细胞中几乎没有发现自噬体,而mi R-21 mimic control组以及空白对照组细胞中自噬体均较多,与前者相比差异均明显,具有统计学意义(P0.05)。mi R-21 mimic组细胞中LC3-II/LC3-I表达量的比值均显著低于mi R-21 mimic control组及空白对照组细胞(P0.05);而P62在mi R-21 mimic组细胞中表达量显著高于mi R-21 mimic control组及空白细胞对照组,具有统计学意义(P0.05)。mi R-21 mimic组中PTEN蛋白的表达水平较低,与另外两组相比具有统计学意义(P0.05);磷酸化的PI3K(p-PI3K)和AKT(p-Akt)在mi R-21 mimic组中均明显高于mi R-21 mimic control组和空白细胞对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:mi R-21可以通过靶向沉默PTEN,促进PI3K和AKT发生磷酸化,进而使PTEN/PI3K/AKT信号通路被激活,最终抑制人椎间盘退变髓核细胞的自噬。     

重组腺病毒介导脂联素基因对ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化的作用机制

目的研究腺病毒介导的脂联素(APN)过表达对Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)的抑制作用和对NF-κB信号通路的影响。方法将12周龄雄性Apo E-/-小鼠120只分为空载腺病毒对照组和脂联素干预组,每组60只。在3个不同时间点(0天、4周、8周)处死小鼠收集组织。全自动生化仪检测血脂指标;ELISA法测定血清APN浓度;油红O染色法检测小鼠主动脉血管组织的病理学变化;Masson染色法检测进展性斑块区的胶原含量和纤维帽厚度变化;免疫荧光法测定小鼠主动脉血管APN和NF-κB p65蛋白的表达;免疫印迹法检测主动脉血管APN、NF-κB p65核蛋白和炎症因子的表达。结果 APN过表达抑制了Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成。与对照组相比,脂联素干预组的动脉粥样硬化病理损伤面积减少(P0.01),动脉粥样硬化损伤程度降低(P0.001),总体油红O染色测定血管表面损伤百分比,4周时为(27.78±8.64)vs(33.02±5.18)%;8周时为(31.58±5.87)vs(52.16±5.79)%。脂联素减缓了高脂饮食导致的小鼠血清中TC(P0.001)、TG(P0.001)、LDL-C(P0.001)的浓度增加,使血脂水平趋向正常化。随着血清脂联素浓度增加,可以阻遏NF-κB通路的激活,抑制NF-κB p65核蛋白和炎症因子的表达。结论脂联素通过抑制NF-κB通路激活来减轻AS的炎症反应。     

SOX7基因启动子甲基化水平对乳腺癌MDA-MB-231细胞株体外迁移和侵袭的影响

目的:探讨乳腺癌MDA-MB-231细胞中,Y性别决定区基因7(SOX7)基因启动子甲基化水平对细胞的体外迁移和侵袭的影响。方法:脂质体转染pcDNA3.0-DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)质粒至MDA-MB-231细胞中,并于24h、48h及72h后,采用蛋白质免疫印迹实验(WB)检测细胞内DNMT3a蛋白表达水平;甲基化特异性定量PCR(Q-MSP)检测DNMT3a处理组、5-aza-C处理组及对照(Control)组MDA-MB-231细胞中的SOX7基因启动子DNA甲基化水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及WB实验检测各组MDA-MB-231细胞中的SOX7 m RNA和蛋白表达水平;细胞划痕实验及细胞侵袭实验检测各组MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。结果:pcDNA3.0-DNMT3a质粒转染MDA-MB-231细胞24h时,细胞内的DNMT3a蛋白表达水平最高。DNMT3a能够显著提高SOX7基因启动子DNA甲基化水平,而5-aza-C则抑制了SOX7基因启动子DNA甲基化水平(P0.05)。与Control组相比,DNMT3a处理组的MDA-MB-231细胞中,SOX7的m RNA及蛋白表达水平均明显下降,而5-aza-C处理组SOX7的m RNA及蛋白表达水平均明显增加(P0.05)。与Control组相比,DNMT3a处理组的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力均显著增强(P0.05),而5-aza-C处理组的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力变化不大(P0.05)。结论:在恶性肿瘤中,SOX7低表达表受其基因启动子高甲基化调节,且乳腺癌MDA-MB-231细胞中低表达的SOX7能够影响细胞的外迁移和侵袭能力。     

5-氮杂胞苷对T淋巴细胞Jurkat miR-126及IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3表达的影响

目的:探究甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidin,5-aza)对T淋巴细胞(Jurkat)mi R-126、Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群及因子IFN-γ、GATA3、ROR-γ和Foxp3的调控作用。方法:采用不同浓度5-aza干预T淋巴细胞,24 h、48 h后检测其对细胞增殖抑制作用;实时荧光定量PCR、Western Blot检测5-aza干预后mi R-126表达水平以及IFN-γ、GATA3、ROR-γ和Foxp3的m RNA及蛋白表达水平;流式细胞术检测5-aza干预后Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群分化比例。结果:甲基化酶抑制剂干预T淋巴细胞后,细胞抑制率随5-aza浓度增大及作用时间延长呈递增趋势(P<0.01);细胞抑制率在24 h、48 h,低、中、高浓度下分别为(14.73±0.93)%、(32.67±8.40)%、(60.87±5.78)%以及(18.98±0.73)%、(39.80±8.42)%、(64.11±6.04)%;抑制率在24 h与48 h之间无差异(P>0.05)。甲基化酶抑制剂干预后mi R-126表达降低(P<0.01);IFN-γ蛋白表达降低(P<0.05)、Th1细胞亚群数目降低(P<0.01);GATA3 m RNA和蛋白表达升高(P<0.05)、Th2细胞亚群数目增加(P<0.01);ROR-γ蛋白表达降低(P>0.05)、Th17细胞亚群数目降低(P<0.05);Foxp3 m RNA和蛋白表达升高(P>0.05)、Treg细胞亚群数目增加(P<0.05)。结论:甲基化酶抑制剂可以下调Jurkat细胞mi R-126基因表达;下调Th1、Th17细胞亚群分化,上调Th2、Treg细胞亚群分化;调控细胞因子IFN-γ、GATA3、ROR-γ和Foxp3的表达。     

乏氧和辐射诱导的miR-1290 促进宫颈癌细胞EMT发生

目的:研究mi R-1290在宫颈癌Hela细胞上皮间质转化中的作用。方法:模拟肿瘤放射治疗的分割疗法,单次2 Gyγ射线连续照射宫颈癌Hela、Siha细胞诱导辐射抗性细胞株;采用micro RNA芯片技术比较辐射抗性细胞与亲本细胞中mi RNA的表达谱差异;经不同条件乏氧和辐射处理宫颈癌Hela细胞后检测mi R-1290的表达水平;借助mi R-1290及mi R-1290-inhibition慢病毒表达载体,调变mi R-1290在Hela细胞的表达;调变mi R-1290后,划痕实验及Transwell侵袭实验比较Hela细胞的侵袭和转移能力;蛋白质印迹法检测细胞中E钙黏素(E-cadherin)和N钙黏素(N-cadherin)的表达。结果:在宫颈癌辐射抗性细胞中mi R-1290表达水平显著升高(P0.05);乏氧和辐射可诱导mi R-1290在宫颈癌Hela细胞中表达(P0.05);上调表达mi R-1290,Hela细胞出现了明显的间质细胞的形态改变,细胞的侵袭和转移能力明显增强(P0.05)。在Hela细胞中上调表达mi R-1290,降低了细胞中E-cadherin的表达,同时升高了N-cadherin的表达(P0.05)。结论:乏氧和辐射可诱导mi R-1290在宫颈癌Hela细胞中表达,mi R-1290通过调控E-cadherin和N-cadherin的表达促进宫颈癌Hela细胞发生EMT。     

miR-217慢病毒表达载体及稳转胶质瘤细胞系的构建

目的:构建mi R-217慢病毒表达载体并建立稳定表达mi R-217的胶质瘤细胞系,为深入研究mi R-217在胶质瘤细胞生长及功能中的作用及机制提供条件。方法:利用人基因组中mi R-217前体序列,设计并合成引物。采用PCR的方法扩增含mi R-217前体的目的片段,酶切后连接至慢病毒表达载体p LVX-EGFP-Puro。将带有mi R-217前体的慢病毒载体及辅助质粒用脂质体的方法转染293细胞,24小时后收集上清液测定病毒滴度。利用实时定量PCR检测mi R-217的表达水平,确定慢病毒载体的表达能力。将病毒感染胶质瘤细胞系U251,通过荧光观察和嘌呤霉素(Puromycin)筛选,获得稳定转染mi R-217的胶质瘤细胞系。结果:克隆的mi R-217前体目的片段经PCR检测和测序分析,序列完全正确、无突变。实时定量PCR检测发现慢病毒感染293T细胞后,mi R-217的表达水平明显升高(P0.01),表明mi R-217慢病毒表达载体构建成功。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜观察发现细胞均有稳定的绿色荧光表达,并且mi R-217的表达水平显著升高(P0.01),是对照组的12.5倍。结论:成功构建了mi R-127慢病毒表达载体和稳转胶质瘤细胞系,为后续研究奠定了良好基础。     

miR-125b靶向MCL1抑制胃癌 MGC-803细胞增殖

探讨mi R-125b对胃癌MGC-803细胞增殖的影响及机制,为阐明胃癌发病的分子机制提供实验依据.采用q RT-PCR和原位杂交,检测mi R-125b在正常胃黏膜(NGM)和胃癌(GAC)组织中的表达.将mi R-125b导入胃癌MGC-803细胞,观察mi R-125b高表达对MGC-803细胞增殖的影响.利用Targetscan 6.2软件及荧光素酶报告基因检测,分析mi R-125b对MCL1基因的靶向性作用.构建MCL1干扰载体,观察干扰MCL1基因表达对MGC-803细胞增殖的影响.结果发现,mi R-125b在胃癌组织中低表达,其表达与胃癌的分化程度及患者预后呈正相关,与TNM分期、淋巴结转移呈负相关(P0.01).mi R-125b高表达后MGC-803细胞的增殖降低、凋亡率增加、裂解caspase-3与裂解PARP表达增加(P0.01);mi R-125b与MCL1基因的3′UTR(2 613~2 620)结合,抑制MCL1的m RNA及蛋白质表达(P0.01);沉默MCL1基因表达后MGC-803细胞的增殖降低、凋亡率增加、裂解caspase-3与裂解PARP表达增加(P0.01).从而得出结论,mi R-125b在胃癌组织中低表达,其表达与胃癌组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移及患者预后密切相关;mi R-125b靶向抑制MCL1基因表达,活化caspase-3信号通路,抑制MGC-803细胞增殖.     

甲基转移酶对鼻咽癌细胞中DLC-1基因表达的影响

肝癌缺失基因-1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)在多种肿瘤中呈现表达缺失或表达下调,这种异常表达主要与由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)参与的启动子区异常甲基化有关。RT-PCR结果显示DLC-1在永生化鼻咽上皮细胞NP69和干扰DNMTs的5-8F细胞中的表达水平较未干扰的鼻咽癌细胞明显升高。甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSPCR)结果则表明DLC-1启动子区在表达下调或缺失的鼻咽癌细胞中均存在异常高甲基化,而干扰DNMTs后5-8F细胞中DLC-1启动子区甲基化状态被逆转,其中特异性干扰DNMT1后效果略为显著,提示DNA甲基转移酶活性对于鼻咽癌中DLC-1启动子区甲基化水平具有重要的调控作用,而DNMT1的调控作用更为突出。