鞘内注射孤啡肽对大鼠足底注入蜜蜂毒诱致长时程自发痛、痛敏和炎症的不同效果

为进一步了解孤啡肽在脊髓水平是否具有抗伤害及抗炎作用,本实验在具有多种痛行为表现的蜜蜂毒模型上观察了鞘内注射孤啡肽对大鼠一侧后足底注入蜜蜂毒所诱致的同侧自发缩足反射、原发热和机械性痛敏以及注射部位炎症反应的影响,同时观察了新的高选择性孤啡肽受体拮抗剂CompB的作用.结果表明与生理盐水对照组比较,鞘内注射孤啡肽(3、10、30 nmol/10μl)对蜜蜂毒诱发的自发缩足反射次数的抑制作用随剂量提高而增大,抑制率分别为37±7,43±6and57±11%(三个剂量vs对照,P＜0.05);而对蜜蜂毒诱发的注射部位炎症反应(爪体积、爪背腹厚度和蛋白渗出的增加)无显著影响.CompB(30 nmo1)可完全翻转10 nmol孤啡肽对自发缩足反射的抑制作用.鞘内单次或重复注射孤啡肽(10 nmol/10μl)对蜜蜂毒诱致的原发性热和机械性痛敏的发生和维持均无作用.本实验结果提示,外源性孤啡肽在脊髓通过孤啡肽受体的介导产生一定的镇痛作用,但是它可能仅对持续性自发痛有抑制作用,而对热和机械性痛敏及炎症反应均无影响.     

实验性高血糖对大鼠病理性痛反应的影响

目的:研究实验性高血糖大鼠血糖变化对病理性痛反应的影响.方法:用链脲佐菌素制造高血糖大鼠模型,并以生理盐水处理大鼠做为对照.在大鼠后足注入蜜蜂毒,观察其自发痛、持续性热刺激缩足反应潜伏期和机械刺激缩足反应阈值的变化.结果:在高血糖状态下,左足底注射蜜蜂毒引起大鼠持续性自发缩足反射的次数增加;对于病理性痛反应,与基础水平比较,热刺激和机械刺激缩足反应阙值均降低(P＜0.05),但是实验组大鼠和生理盐水组大鼠热刺激的反应性比较无差异(P＞0.05),实验组大鼠机械刺激缩足反应阈值较生理盐水组大鼠降低(P＜0.05).结论:高血糖大鼠皮下注射蜜蜂毒诱导外周组织局部炎症后,可引起大鼠的持续性自发缩足反射增强和热及机械痛敏.     

鸡矢藤注射液和野木瓜注射液对大鼠足底皮下化学组织损伤诱致自发痛、痛敏和炎症的作用

研究市售中药制剂鸡矢藤注射液和野木瓜注射液有无抗伤害及抗炎作用。采用两种持续性痛动物实验模型——蜜蜂毒(bee venom,BV)模型和福尔马林(formalin,F)模型,评价鸡矢藤注射液和野木瓜注射液系统给药对持续性自发痛反应、原发性热和机械痛敏及炎症反应的作用效果。成年清醒大鼠足底皮下注射BV(0．2％,50μl)不仅可诱发注射侧长达1h以上的、持续的、单相性的自发痛反应(其表现为自发缩足反射行为)和之后出现的持续3—4d的原发性热和机械痛敏现象,而且注射爪出现明显的红、肿等炎症反应。皮下注射F(2．5％,50μl)则产生双相性自发痛反应。与盐水组比较,致痛前系统给予0．32、1．6和9．0ml／kg三个剂量的500％鸡矢藤注射液或250％野木瓜注射液,对BV或F诱致的1h自发缩足反射次数具有剂量依赖性抑制作用;致痛5min后分别给予鸡矢藤或野木瓜注射液对BV或F诱发的自发痛反应也产生显著的抑制作用。然而,致痛前或致痛后静脉注射鸡矢藤注射液或野木瓜注射液对BV诱致的原发性热／机械痛敏及炎症反应均无明显的抑制作用。纳洛酮(一种非选择性的阿片受体拮抗剂)不能翻转鸡矢藤或野木瓜注射液对BV产生的自发痛反应的镇痛作用,提示其镇痛作用不是由内源性阿片受体介导。本研究结果证实鸡矢藤或野木瓜注射液能预防和缓解临床持续性自发痛,但是对原发性热／机械痛敏及炎症反应均无抗伤害效应和抗炎作用。在中药镇痛抗炎有效成分的筛选和评价中,BV模型是一个理想的实验动物模型。     

脊髓水平给予胍丁胺对鞘内吗啡镇痛的影响

目的：观察脊髓水平给予胍丁胺对鞘内吗啡镇痛作用的影响。方法：30只sD大鼠随机分为3组（n=10）：C1组：鞘内注射生理盐水（10出）;M1组：鞘内注射吗啡（15μg／10μl）;AMI组：鞘内同时给予吗啡15μg＋胍丁胺12．5μg／10出。所有大鼠均于鞘内给药后5min于跖部皮下注射蜜蜂毒50m（0．2mg）致痛,观察并纪录1h内大鼠的自发缩足反射次数。另30只SD大鼠分组为C2,M2和AM2（n=10）,每组给药分别同前,用来测定机械痛阈和热刺激阈值。结果：与C1组比较,M1组1h内大鼠的自发缩足反射次数显著减少,提示鞘内注射吗啡对蜜蜂毒诱致的自发痛具有显著性抑制作用（P〈0．05）;鞘内同时给予吗啡和胍丁胺（AM1组）,大鼠自发缩足反射次数进一步减少,与M1组比较具有显著性意义（P〈0．05）。与对照组C2组比较,M2组大鼠的热刺激闽值和机械性痛闽明显提高;AM2组热刺激潜伏期显著延长,机械刺激阈值显著提高;AM2组与M2组比较热刺激潜伏期和机械刺激阈值有统计学差异（P〈0．05）。结论：鞘内胍丁胺和吗啡联合用药可显著增强吗啡对蜜蜂毒诱致自发痛的抑制作用,具有加强效应。     

CBP/P300介导的PTIP乙酰化可能促进下游肿瘤相关基因CCDC121和GPR75的转录

PTIP (Pax transactivation domain-interacting protein,PAXIP1)蛋白参与MLL3 (lysine methyltransferase 2C,KMT2C)/MLL4(lysine methyltransferase 2B,KMT2B)组蛋白H3K4甲基转移酶复合体,促进基因的转录激活。但关于PTIP蛋白的乙酰化修饰及人宫颈癌细胞中PTIP转录激活靶基因的研究尚无报道。本研究以稳定表达SFB-PTIP蛋白的293T细胞株为对象,通过免疫沉淀和Western印迹法发现,PTIP蛋白能够发生乙酰化修饰,乙酰转移酶CBP/P300介导PTIP蛋白的乙酰化过程,CBP是主要乙酰转移酶。去乙酰化酶HDAC1/2/3介导PTIP蛋白的去乙酰化过程。选择性HDAC1-3抑制剂MS-275促进PTIP蛋白乙酰化水平上升,且呈剂量和时间依赖性。以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象,RNA-seq和RT-qPCR证明,CCDC121 (coiled-coil domain containing121)和G蛋白偶联受体75 (G protein-coupled receptor 75,GPR75)是PTIP的转录激活靶基因(P<0. 01)。和对照相比,MS-275介导的蛋白质乙酰化水平上升,促进基因CCDC121和GPR75的mRNA转录呈现不同程度的剂量依赖性上升(P<0. 01,P<0. 05)。由此推测,MS-275有可能是通过促进PTIP蛋白的乙酰化水平,促进CCDC121和GPR75的转录。但其详细机制有待进一步研究。本研究对今后深入探讨PTIP乙酰化修饰对下游肿瘤相关基因转录的调节和功能,如肿瘤发生、进展等方面的调控机制提供了基础。     

脊髓p38丝裂原活化蛋白激酶激活参与坐骨神经压迫性损伤所致神经病理性痛

本研究旨在观察脊髓p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）在坐骨神经压迫性损伤所致神经病理性痛中的作用。雄性Sprague-Dawley大鼠鞘内置管后,4-0丝线松结扎左侧坐骨神经制作慢性压迫性损伤（chronic constriction injury,CCI）模型。CCI后第5天,鞘内注射不同剂量的p38 MAPK特异性抑制剂SB203580,并在给药前及给药后不同时间点,分别用von Frey机械痛敏监测仪和热辐射刺激仪监测大鼠损伤侧后爪机械和热刺激反应闽值,用免疫印迹技术（Western blot）观察给药前后脊髓磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）和磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding protein,pCREB）表达变化。结果发现：坐骨神经压迫性损伤引起脊髓p-p38 MAPK蛋白表达明显增加;鞘内注射SB203580能剂量依赖性逆转CCI引起的机械性痛觉异常和热痛觉过敏及脊髓水平p-p38 MAPK表达的增加,也明显抑制CCI引起的脊髓pCREB表达的增加。结果提示,脊髓水平p38 MAPK激活参与坐骨神经压迫性损伤所致神经病理性痛的发展,其作用可能通过pCREB介导。     

美普他酚及其同分异构体对角叉菜胶引起的炎症大鼠具有抗热痛敏作用

实验以清醒大鼠的缩腿潜伏期为指标,观察了腹腔注射美普他酚及其同分异构体112824和112825对角叉菜胶引起的热痛敏的影响.外周炎症由单侧足底注射角叉菜胶(2 mg/100 μl)引起.注射角叉菜胶3 h后,注射侧后肢局部红肿及热痛过敏反应达到高峰,持续数小时.腹腔注射0.1 mg/kg美普他酚对炎症和非炎症侧后肢的缩腿潜伏期无明显影响(P＞0.05,n=8).腹腔注射1mg/kg和10 mg/kg美普他酚对炎症和非炎症侧后肢产生明显的抗痛敏和抗伤害效应,且对炎症侧缩腿反应的抑制(抗痛敏)作用明显强于非炎症侧(抗伤害)(P＜0.05,n=8～11).预先腹腔注射1.5 mg/kg纳洛酮明显阻断美普他酚引起的抗伤害和抗痛敏效应.腹腔注射美普他酚的同分异构体112824(1 mg/kg)和112825(1.5 ms/kg)可产生与美普他酚类似的抗痛敏作用,该效应可被预先腹腔注射1.5 mg/kg纳洛酮完全阻断.提示美普他酚及其同分异构体具有明显抗伤害和抗痛敏作用,且以后者为强.该作用主要通过mu阿片受体介导.本研究为扩展美普他酚及其同分异构体在临床上的应用提供了依据.     

炎症状态下水肿与即早期和持续期痛行为之间的相关性分析:治疗意义探讨

迄今,有关个体的疼痛程度和炎症程度之间的精确关系一直存在争论,主要原因是缺乏能够同时反映多种痛(尤其是可鉴别疼痛即早期和持续期)的炎症模型以及定量方法的合理应用。因此,本研究在啮齿类动物评价了外周皮下组织致炎后炎症水肿与伤害性反应以及痛敏之间的相关性。为了更好地认识炎症特异性特征在治疗中的价值,我们对非甾体类抗炎药的作用效果也进行了评价。将一个剂量的蜜蜂毒(0．05mg／0．025m1)注入12个近交系(129P3/J、A／J、AKR／J、BALB／cJ、C3H／HeJ、C57BL／6J、C57BL／10J、C58／J、CBA／J、DBA／2J、RIIIS／J和SM／J)4、鼠或6个剂量的蜜蜂毒(0．001、0．005、0.01、0．05、0．1、0、2mg／0．05m1)注入远交系(Sprague-Dawley)大鼠的一侧足底皮下,分别检测自发伤害性反应、热和机械性痛敏,以及炎症的水肿和局部皮温,然后对组间和组内数据进行相关性分析。此外,观察非甾体类抗炎药吲哚美辛对痛和炎症的作用效果。结果显示：(1)炎症水肿程度与注射侧自发缩足反射次数、舔足抬足时间等伤害性反射程度呈高度正相关(P≤0．003),而与热或机械性痛敏的程度没有相关性;(2)吲哚美辛(0．5、2．5、25mg／kg,i．p．,稀释于60％二甲基桠枫)可以剂量依赖性地抑制炎症水肿和自发伤害性反应,但是对热或机械性痛敏却只有在最高剂量下才有作用。这些结果提示,炎症水肿过程可能只参与动物受炎症刺激而引起的即早自发伤害性反应过程,而不参与与临床更加密切相关的痛敏过程。这个分析结果为确定抗炎治疗有益于缓解多种炎性痛中的哪个靶表证提供了一个有用的分析方法。     

芬太尼联合电针通过介导HDAC2途径调节糖尿病大鼠周围神经痛的作用机制研究

摘要 目的：探讨与研究芬太尼联合电针通过介导组蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2,HDAC2）途径调节糖尿病大鼠周围神经痛的作用机制。方法：将建模成功的糖尿病周围神经痛大鼠（n=36）随机平分为三组-模型组、芬太尼组与电针组,芬太尼组、模型组分别经尾静脉泵注1.0 μg/kg/min芬太尼与等剂量的磷酸盐缓冲液5 min,1次/d。电针组在芬太尼治疗的基础上给予电针治疗,1次/d,均共治疗2周。治疗第1周与第2周,对大鼠进行体重称重,采用双抗体酶联免疫夹心法测血清胰岛素浓度,动态足底触觉仪检测大鼠机械痛阈,免疫印迹检测HDAC2蛋白相对表达水平。结果：芬太尼组与电针组在治疗第1周、第2周的体重都明显高于模型组（P<0.05）,电针组也明显高于芬太尼组（P<0.05）。芬太尼组与电针组在治疗第1周、第2周的血清胰岛素浓度都明显低于模型组（P<0.05）,电针组也明显高于芬太尼组（P<0.05）。芬太尼组与电针组在治疗第1周、第2周的机械痛阈都明显高于模型组（P<0.05）,电针组明显高于芬太尼组（P<0.05）。芬太尼组与电针组在治疗第2周、第4周的 HDAC2蛋白表达水平明显高于模型组（P<0.05）,电针组也显著高于芬太尼组（P<0.05）。结论：芬太尼联合电针在糖尿病周围神经痛大鼠的应用能提高机械痛阈,能提高大鼠体重,也可降低胰岛素浓度,其作用机制可能与促进HDAC2表达有关。     

组蛋白去乙酰化酶3对外周CD4+ T细胞分化的影响

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）对外周CD4⁺ T细胞分化及功能的调控作用。方法 采用CD4cre酶介导Hdac3杂合基因缺失小鼠（Hdac3^fl/flCD4^cre+/-）及其野生型正常对照小鼠（Hdac3^fl/fl，WT），流式细胞术检测HDAC3缺失对外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例和数量的影响；在体外佛波酯（PMA）和离子霉素（Ionomycin）刺激条件下，流式细胞术检测HDAC3缺失对CD4⁺ T细胞中IFN-γ、IL-4和IL-17A的表达以及Tfh细胞产生的影响；采用ELISA检测HDAC3缺失对小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-17表达的影响；分选Hdac3^fl/flCD4^cre+/-和WT小鼠外周初始CD4⁺ T细胞，分别在Th1和Th2分化条件下培养，细胞内染色检测HDAC3缺失对Th1、Th2以及Th17相关细胞因子及其特异转录因子表达的影响；采用Microarray检测HDAC3缺失对CD4⁺ T细胞分化亚群相关基因表达的影响；采用链脲佐菌素（STZ）处理小鼠构建I型糖尿病（TIDM）疾病模型，检测HDAC3缺失对T1DM发病的影响。结果 与WT小鼠相比，Hdac3^fl/flCD4^cre+/-小鼠外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例和数量显著降低。Hdac3^fl/flCD4^cre+/-小鼠CD4⁺ T细胞及血清中IFN-γ的表达显著降低，而IL-4和IL-17A的表达显著增加，Tfh细胞比例也显著增加；HDAC3缺失抑制体外培养CD4⁺ T细胞向Th1分化但促进其向Th2分化；Microarray检测发现HDAC3缺失导致Th1型细胞谱系基因表达降低，而Th2、Th17以及Tfh细胞谱系基因表达增加；在STZ诱导条件下，HDAC3缺失抑制小鼠T1DM的发生和CD4⁺ T细胞向Th1分化。结论 HDAC3促进外周CD4⁺ T细胞向Th1细胞分化并加重T1DM的发生。     

鞘内注射干扰素调节因子8小干扰RNA对术后持续性疼痛大鼠痛阈及脊髓小胶质细胞活化的影响*

目的: 探究鞘内注射干扰素调节因子8小干扰RNA(IRF8 SiRNA)对PPsP大鼠痛阈及脊髓小胶质细胞活化的影响。方法: 120只雄性SD大鼠随机分为假手术组(SH,n=12),模型组(SM,n=48),溶媒组(SD,n=12)和IRF8沉默组(SS,n=48),其中,SM组于大鼠后足中部隐静脉内侧按皮肤/肌肉切开牵拉(SMIR)法建立术后持续性疼痛(PPsP)模型,SH组仅切开不牵拉;SD组与SS组建模前一周先于L4/5椎间隙行鞘内置管术, SS组于建模后第5、6日连续鞘内给予IRF8 SiRNA溶液20 μl(溶于DEPC水中,150 pmol),SD组给予等量DEPC水。测量并记录建模前(D0),建模后第1(D1)、3(D3)、7(D7)、12(D12)、22(D22)、33(D33)日等时点各组大鼠术侧后足机械刺激缩足反应阈值 (PWT); 建模后第12日各取6只,Western blot法检测脊髓背角Iba-1蛋白表达情况,并取SH组和SM组各3只,取术野隐神经行电镜观察其超微结构改变;再取SM组和SS组于上述各时点各6只,流式细胞术检测脊髓背角小胶质细胞活化情况。结果: 与D0相比, SM组在D1～D22PWT降低(P＜0.05或P＜0.01),并在D33恢复至正常水平(P＞0.05);与SH组相比,SM组PWT在D1～D22均降低(P＜0.05或P＜0.01);与SD组相比,SS组PWT在D7～D22增高(P＜0.05或P＜0.01);与SH组相比,SS组D7～D22降低(P＜0.05或P＜0.01);隐神经髓鞘平均厚度: SH组为(377.03± 69.60) nm,SM组为(369.50±73.26) nm,两组间相比无统计学意义(P＞0.05);与SH组相比,SM组Iba-1明显上调(P＜0.01);与SD组相比,SS组Iba-1表达受到抑制(P＜0.05),与SH组相比,SS组Iba-1表达也具有统计学差异(P＜0.05),而SM组与SD组之间,Iba-1的表达无统计学意义(P＞0.05);与D0相比,SM组小胶质细胞活化比率在D3～D22均显著增加(P＜0.01),而SS组小胶质细胞活化于D3达到高峰(P＜0.01);鞘内给药后,SS组脊髓背角小胶质细胞活化比率明显下降,与SM组相比,在D7～D12显著下降(P＜0.01)。结论: SMIR诱导的PPsP大鼠显著且持续的机械痛觉过敏为非明显的外周神经损伤所致,可能是基于脊髓背角小胶质细胞活化所介导,而鞘内给予IRF8小干扰RNA可抑制脊髓背角小胶质细胞的激活,并逆转SMIR诱导的痛觉过敏。