差异表达基因的分离策略

生命活动的各个进程伴随着不同基因的选择性开启和关闭。如何有效地分离克隆各种差异表达的基因,成为分子生物学研究的一个努力方向,大量差异基因分离策略因之问世。本文扼要介绍了近年来发展的几种主要分离策略,并详细介绍一种新的差异基因分离方法--抑制差减杂交。     

克隆基因的策略

分离和鉴定人类遗传病的致病基因是人类基因组计划的一个重要目标,由于克隆基因工作的复杂性和艰巨性,迄今为止只克隆到２６种遗传病的致病基因。本文分类综述了克隆基因的几种策略,并对它们的优点和局限性进行了讨论。     

小儿脓毒症休克相关基因的筛选及网络构建

为探究脓毒症休克与SIRS的差异表达基因及网络的构建,筛选潜在的核心基因,从GEO数据库下载相关基因表达谱GSE26378,数据分为脓毒症休克与SIRS各29个样本,通过在线软件GCBI对其进行标准化及差异基因筛选;对差异基因进行GO分析;基于KEGG进行功能通路分析以及基因信号网络分析;差异基因共表达网络分析。结果表明:两组中总共有1 456个基因被识别为差异基因(P0.05),与SIRS组相比,脓毒症休克组中有条859条下调基因,597条上调基因。GO功能富集分析显示差异基因主要参与了细胞周期、细胞免疫、细胞代谢。KEGG功能通路分析显示差异基因主要参与了MAPK信号通路、P53信号通路、wnt信号通路、细胞凋亡信号通路,细胞周期受体信号通路等。共表达分析发现基因CCNB1、NUSAP1、OIP5、SHCBP1、ZWINT、TOP2A、DLGAP5等位于网络中央部位,而基因信号网络分析发现基因PLCB1、PIK3CA、STAT3、CAMK2D、PRKCB、CREB1位于网络核心。基因芯片分析有助于发现脓毒症休克与SIRS患儿外周血单核细胞在转录组学上的改变,而生物信息学网络分析有助于发现潜在的靶点。     

不同种型布鲁菌间的基因获得与缺失研究

目的:了解不同种型布鲁菌间的基因差异及基因的获得与缺失情况。方法:采用生物信息学方法比较分析已测序的10株布鲁菌基因水平的差异,分析它们的核心基因组与泛基因组,对得到的差异基因用PCR验证其在19株不同生物型标准菌株中的分布情况。结果:不同种型布鲁菌在基因水平上存在较大差异,差异基因主要位于Ⅱ号染色体上;根据差异基因,鉴定了42个差异区段,这些差异区段在19株不同生物型标准菌株中存在差异分布。结论:布鲁菌在进化过程中分别获得或失去了不同的基因区段,从而适应不同的宿主环境。     

多基因遗传病基因研究的策略和方法

基因在决定个体表型方面起着决定性的作用。虽然单基因疾病的致病基因的克隆工作取得了显著的进展,但对于多基因疾病来说,仍然存在许多问题,同时也是巨大的挑战。本文综述了多基因疾病的遗传特点和多基因疾病易感基因识别、分离和克隆的一般步骤和存在的问题,介绍了人类基因组计划在此过程中的作用和单核苷酸多态性的应用前景,提出 了最有可能克隆出多基因疾病易感基因的策略和方法。     

高等植物发育基因的分离方法

介绍了mRNA差别显示等7种可用于分离高等植物发育基因的方法，着重分析了每项技术的工作原理、应用范围及其进展。     

金针菇单、双核菌丝差异表达基因分析

对金针菇Flammulina velutipes单核菌丝W23的菌丝体以及与L11质配后的双核菌丝H1123菌丝体进行了转录组测序,以本实验室已获得的W23基因组为参考基因组研究两样本间差异基因,并对这些差异基因进行了GO功能和Pathway显著性富集分析。差异基因分析显示,两个样本中共有显著性差异表达的基因3 504个,其中在双核菌丝中上调、下调的基因数分别为2 151和1 353个。研究发现差异表达基因含有很多的转录因子基因、蛋白激酶以及WD40 repeat-like蛋白。Gene Ontology（GO）功能分析结果表明,extracellular region和membrane-enclosed lumen条目下的差异基因全部为上调表达,而envelope下的差异基因全部为下调表达,以利于双核菌丝分裂时锁状联合的形成而便于核的迁移。Pathway 功能富集分析结果表明,脂肪酸、氨基酸以及大部分糖类合成相关基因具有比较活跃的上调表达。说明双核菌丝主要进行营养物质的富集,为下一步在合适条件下分化成原基,进入生殖生长阶段储备物质基础。     

mRNA差异显示

分离差异表达的基因是研究生命调节过程的重要手段,mRNA差异显示技术是一种能成功分离差异表达基因的方法,文章对该方法的基本原理、方法步骤及其应用作了较为详细的介绍。     

基于高通量转录组测序的草鱼雌雄性腺差异表达基因分析

草鱼雌性个体生长优势明显高于雄性,挖掘精巢和卵巢差异表达的功能基因对草鱼生殖调控具有重要的价值及应用前景。采用Illumina HiSep 2500转录组测序技术分别对12月龄的3尾雌性草鱼和3尾雄性草鱼的性腺组织的mRNA进行测序分析,精巢和卵巢共得到8 363个差异表达基因。与卵巢相比,精巢上调基因6 446个(77%),下调基因1 917个(23%),差异明显。将上述差异基因在Nr、GO和KEGG数据库进行比对,获得48种Go功能注释分类和313条KEGG代谢通路。分析发现,Go功能分类中"绑定"功能富集差异基因的数量最多,占总数的15.8%;KEGG代谢通路中"信号转导"通路富集差异基因的数量最多,占总数的10.2%。结合转录本数据,挑选与草鱼性腺发育相关的关键差异基因Dmrt1、amh、foxl2、cyp19a1a进行分析,研究显示,与卵巢相比,Dmrt1和amh基因在草鱼精巢中极显著高表达(p0.01);与精巢相比,cyp19a1a和foxl2基因在草鱼卵巢中显著高表达(p0.05),与转录组数据分析结论一致,说明Dmrt1和amh基因与早期草鱼精巢发育调控相关,cyp19a1a和foxl2基因与早期草鱼卵巢发育调控相关。本实验为进一步了解草鱼性别基因的调控机理提供数据依据。     

几种差异序列分析方法的比较及其研究前景

分离和鉴定不同生物基因的差异序列,有助于功能基因的分离,揭开物种间进化的规律,阐明某些疾病相关基因的作用机理。本文简述了几种近年来常用的筛选差异基因的方法,特别是最新发表的杂交监控差异分析法(HMDA)的原理、适用范围及其特点,重点探讨了HMDA法在真核基因组差异序列筛选中的技术性突破及其研究前景。     

DDRT-PCR技术在研究附植前胚胎基因表达中的应用

甘肃农业大学动物医学院张进隆等5位科研工作者根据哺乳动物附植前胚胎的发育受相应基因的控制。在不同阶段（发育阶段）有不同的差异基因,他们分离并克隆此差异表达基因,以了解胚胎发育的分子机理。他们应用mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）的基本原理、特点,即一对细胞的总RNA反转录而成的cDNA模板、PCR高效扩增、     

冠心病易感基因的筛选

作为一种多基因疾病 ,冠心病是由遗传和环境因素共同作用的结果 ,在许多国家是主要的死因之一。由于目前冠心病的发病机制尚不十分清楚 ,阻碍了其易感基因的定位分离研究。冠心病遗传因素的确定 ,显然将有助于其易感基因定位分离研究。迄今除发现了个别的相关基因外 ,绝大部分的遗传易感性相关基因尚未被发现 ,其研究仍然存在许多问题。为此 ,本文就其易感基因可能的研究策略和方法作一综述。这些方法同样也适用于诸如中风、外周血管阻塞、高血压、心力衰竭等心血管疾病以及其它多基因疾病     

第二代测序技术用于前列腺癌转录组数据的分析

利用生物信息学方法,从前列腺癌RNA-seq数据中找出前列腺癌与正常前列腺组织细胞的差异基因,对差异基因进行pathway富集分析,最后做基因互作网络分析,发现IL8在前列腺肿瘤细胞中的对抑制肿瘤细胞生长有着重要的调控作用。     

转香蕉MaASR1基因的拟南芥株系在干旱胁迫条件下的表达谱分析

干旱是最重要的环境胁迫,香蕉MaASR1基因在植物响应逆境胁迫时发挥着重要作用,为了深入研究MaASR1基因的过表达使拟南芥抗旱的分子机制,利用全基因组表达芯片来广谱的筛选MaASR1基因转入后自然条件下及干旱处理条件下差异基因的表达情况。对基因芯片的结果进行了详细的生物信息学分析及相关基因的RT-PCR验证,结果表明MaASR1基因异源表达的拟南芥株系在自然生长条件下共有747个差异基因,其中上调基因559个,下调基因188个;在干旱胁迫条件下共得到653个差异基因,其中上调基因256个,下调基因397个;MaASR1基因的转入可以通过影响激素、光合作用、锌指蛋白及不依赖ABA途径的DREB2A等相关基因的表达来提高拟南芥的抗旱性。为解析MaASR1基因作为转录因子提高植物抗旱能力的分子机制奠定基础。     

斑马鱼急性无机砷暴露后肝脏差异表达基因的生物信息学分析

砷是一种致癌物,是心血管、外周血管疾病、神经疾病、糖尿病和各种癌症的致病因素。目的:利用GO数据库和KEGG数据库等生物信息学方法对GEO数据库数据中的差异表达基因进行评价。利用生物信息学分析软件对差异基因进行功能富集、功能注释分析和生存分析。利用Cytoscape上的蛋白-蛋白相互作用网络(Protein-protein interaction network, PPI)软件对179个差异基因进行筛选和分析。结果发现126个基因作用于蛋白靶点,其中有10个基因为关键基因分别为:PSMB3、HSP701、HSPE1、STIP1、HSPD1、HSP70、DNAJB1B、HSP90AA1.1、HSPA9H和TCP1。核心基因主要作用于内质网中的蛋白质加工通路。这可能会为砷对肝脏损伤的潜在生物标志物和生物学机制提供新的思路。     

PCR介导的cDNA文库矩阵排列筛选方法

描述了一种快速、有效的ｃＤＮＡ文库筛选策略。其主要过程是将ｃＤＮＡ文库重组子进行矩阵排列,进而用特异引物进行ＰＣＲ逐级筛选以分离目的基因．     

细胞凋亡和代谢基因在转移倾向结肠癌中的研究

目的:应用基因微阵列技术初步筛选与不同转移倾向结肠癌相关的细胞凋亡和代谢相关基因,研究转移相关基因功能.方法:取结肠癌肝转移和无转移结肠癌组织,采用人全基因组表达谱芯片获得两组织的基因表达谱,分析比较两者之间细胞凋亡和代谢基因的差异表达情况;利用基因数据库检索结肠癌相关基因,分析基因功能.结果:应用含有16450个克隆(其中3869个未知)的cDNA微阵列分析发现,细胞凋亡或肿瘤相关基因中,2倍以上(Ratio值小于0.5或大于2.0)差异基因共216个,上调基因85个,下调基因129个.表达差异5倍以上(Ratio值小于0.2或大于5.0)共32个,上调基因10个,下调基因22个.在细胞代谢相关基因中,2倍以上(Ratio值小于0.5或大于2.O)差异基因共205个,上调基因86个,下调基因119个.表达差异5倍以上(Ratio值小于0.2或大于5.0)共15个,上调基因10个,下调基因5个.利用基因数据库检索分析发现5个基因与结肠癌转移关系密切.结论:结肠癌的发生和转移是多基因参与的,本实验应用基因微阵列技术发现细胞凋亡和代谢相关基因中发现5个基因与结肠癌转移关系密切.     

植物基因分离方法

植物基因分离一直是当今生物技术研究的热点。分离作物重要农艺性状的功能基因利于对基因的结构和表达进行研究,并可以经转基因技术进行分子育种。根据中心法则,介绍了从DNA、RNA到蛋白质的三个层次进行植物基因分离的方法。     

血管内皮细胞乙酰胆碱作用靶标相关新基因的电子克隆

血管内皮细胞乙酰胆碱作用靶标(ETA)作为特异性血管内皮细胞药物作用新靶点具有良好的抗动脉粥样硬化应用前景。通过培养前后血管内皮细胞表达差异基因的筛选,有可能分离获得ETA或其相关基因。在利用抑制削减杂交技术获得14个牛未知基因片段基础上,采用电子克隆途径,使6个未知基因片段得以延伸,并在GenBank的非冗余基因库中找到了对应或同源基因,其中3个延伸出了全长阅读框,另外3个延伸出部分长度;对于延伸出全长阅读框的基因,设计特异性引物进行PCR扩增,验证了电子延伸的可信性,同时也克隆了整个阅读框架区。     

转基因植物中标记基因的剔除

在目前的植物转化系统中,要求在关注基因或目的基因转入细胞时,同时有标记基因存在.标记基因主要是抗生素或除草剂的抗性基因.借标记基因的表达可以将转化细胞从大量的未转化细胞中筛选出来,但标记基因的继续存在,特别是在转基因食品中,是人们广泛关注的问题.培育无标记基因的转基因植株已成为植物生物工程研究中的新课题.该文介绍了剔除标记基因的两种方法:分离剔除和重组剔除,并对近年来这两种方法在培育无标记基因的转基因植物中的应用和进展作了介绍.