一种检测小鼠转录因子活性的微阵列芯片的构建及应用

转录因子是一类具有序列特异性的双链DNA结合蛋白．在哺乳动物细胞中,一个转录因子可以调控多个靶基因,一个基因也同时受到多个转录因子的调控,从而形成复杂的基因表达网络调控机制．在蛋白质水平检测特定状态下组织或细胞中的转录因子活性对深入研究基因表达调控的分子机制具有重要的意义．针对TRANSFAC数据库提供的226个小鼠转录因子的PSSM,设计了240个转录因子结合探针,构建了可以在蛋白质水平同时检测约200个小鼠转录因子的微阵列芯片,实验结果显示：a．针对含有不同DNA结合结构域的7个转录因子,进行依赖于抗体的转录因子活性检测,结果证明该芯片具有良好的特异性;b．针对NFκB转录因子纯品,芯片的检测灵敏度可以达到0.5 nmol/L,线性范围为0.5～20 nmol/L,表明芯片具有较高的灵敏度和良好的定量能力;c．针对经典的IKK,JNK信号通路和JAK/STAT信号通路,该芯片可以检测到其关键转录因子的活性变化,证明芯片的可靠性;d．针对小鼠前脂肪细胞系3T3-L1的分化,该转录因子活性芯片不但检测到了已经报道的活性发生变化的转录因子,如PPAR家族和C/EBP家族外,还发现了以前没有报道过的SRF等,充分显示了芯片技术的高通量优势和发现新数据的能力．     

利用ChIP-seq技术研究转录因子EDAG在全基因组的结合谱

为揭示红系分化相关基因（erythroid differentiation associated gene, EDAG）在造血中的作用机制,利用ChIP-seq分析EDAG的全基因组结合谱.首先从产妇脐带血分离CD34+细胞,EPO诱导CD34+细胞培养5 d.利用EDAG抗体进行染色体免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）实验、Western 印迹法检测EDAG抗体的富集情况.将富集到的DNA样品进行高通量测序,最后利用生物信息学分析测序结果.成功富集染色体DNA,经高通量测序和生物信息学分析,共得到1 292个EDAG 结合位点的Peaks数目,代表了975个结合的基因且错误发现率(false discovery rate, FDR)小于00001. EDAG Peaks主要分布在基因间区和内含子区.进一步利用Q-PCR对ChIP-Seq数据进行了验证,证实EDAG可结合在检测的靶基因调控区上.将EDAG结合的基因进行基因功能（gene ontology, GO)注释,表明EDAG参与了细胞周期、细胞生长、细胞分化、细胞凋亡及信号通路等多种生物学过程.综上,利用ChIP-seq技术在促红细胞生成素（EPO）诱导分化的CD34+细胞中鉴定了1 292个EDAG结合的peaks对应975个基因,并对该结果进行了随机验证,提示EDAG广泛参与了多种生物学过程.该研究为揭示EDAG的功能及作用机制提供了线索.     

生物分子相互作用分析技术应用实例（二）——多聚物和转录蛋白的研究

BIA技术(biomolecular interaction analysis)即生物分子相互作用分析技术的应用范围相当广泛.这里介绍利用BIAcore研究信号传导中各蛋白质之间的相互作用及多聚物的形成及机理以及转录调节蛋白与启动子（DNA）的研究.     

葡萄NAC转录因子家族生物信息学分析

NAC基因家族是植物所特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及器官建成、逆境胁迫应答等反应.目前,基因组信息的挖掘和分析已经成为葡萄功能基因组学研究的重要组成部分.本文利用生物信息学方法对葡萄143条NAC蛋白序列的系统发生和NAC基因组定位进行分析,然后对其氨基酸组成成分、理化性质以及二级和三级结构进行预测和分析,同时还分析了葡萄与拟南芥的NAC基因家族之间的联系.结果显示这143条蛋白序列与拟南芥94个NAC基因蛋白序列一起分成了16个亚族,说明拟南芥与葡萄NAC基因间具有较高的保守性.基因组定位结果发现143条NAC基因分布在17条染色体上.研究还发现不同亚家族间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;而它们的二级结构都主要以随机卷曲为组成部分,且143条氨基酸序列三维结构十分相似.本文试验结果将为葡萄NAC基因家族的进一步功能分析提供重要研究基础.     

蒙古冰草MYB转录因子基因的序列分析

MYB转录因子是一类与植物抗逆相关的蛋白家族,通过激活植物抗逆应答基因的表达而提高其抗逆性。为挖掘蒙古冰草(Agropyron mongolicum)抗旱相关的MYB基因,本研究在已有转录组测序数据的基础上,用Plant TFDB数据库中的Prediction和Blast对MYB基因筛选及保守结构域分析,通过生物学方法对筛选出的MYB转录因子进行分析,预测其分子量和等电点等理化性质、基序、二级结构和三级结构;并用MEGA 7.0.21与已报道具有抗旱功能的29个MYB蛋白进行多序列比对分析并构建系统进化树。结果表明:蒙古冰草中筛选出9个MYB基因,蛋白大小在113~576 aa,分子量和等电点分别介于12.83~61.52 kD和4.68~9.80 kD之间,都为不稳定的亲水性蛋白;基序预测得到2个特征基序,最长的基序含50个氨基酸;α-螺旋和无规则卷曲是主要的二级结构,三级结构中都含有螺旋-转角-螺旋结构;进化树分析中,38个基因很好的聚为两类,其中Unigene 25843、Unigene 42380、Unigene 52355、Unigene 54016分别于AtMYB33、AtMYB61、Os MYB48-1、AtMYB20在同一分支上,高度同源,推测从蒙古冰草中筛选得到的MYB基因参与干旱胁迫应答,该研究为下一步蒙古冰草MYB基因功能的研究提供帮助。     

利用酵母双杂交技术筛选与AtbZIP1相互作用的蛋白质

碱性亮氨酸拉链bZIP类转录因子在植物的生长发育、光形态建成、光信号传导及非生物胁迫反应中发挥重要的作用.为研究AtbZIP1基因的作用机理,本研究首先验证了该基因的自激活转录活性,通过缺失突变确定了该转录因子的转录激活结构域;以AtbZIP1缺失突变体AtbZ3为诱饵蛋白,采用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System(Clonetch),共筛选获得5个与诱饵蛋白相互作用的蛋白质;并通过AbA(Aureobasidin A)抗生素标记基因,His营养缺陷和LacZ蓝白斑检测验证了阳性克隆.亚细胞定位分析发现,AtbZIP1蛋白除了定位于细胞核外,还定位于叶绿体细胞.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究AtbZIP1蛋白的未知生物学功能提供重要信息.     

辣椒CaNAC36转录因子耐盐性分析

【目的】辣椒是中国种植面积最大的蔬菜作物,随着土地盐碱化问题的日趋严重,加强辣椒耐盐机制研究对促进产业可持续发展具有重要意义。因而,急需加快辣椒耐盐相关关键基因的功能研究。【方法】研究组前期挖掘到与辣椒耐盐性相关的转录因子CaNAC36,在此基础上,以耐盐辣椒PI201224和敏盐辣椒PI438643为供试品种,克隆获得CaNAC36全长gDNA和cDNA序列,通过荧光定量分析CaNAC36及可能的互作基因在盐胁迫条件下不同组织部位的表达情况,并进一步结合生物信息学分析探究CaNAC36及其互作基因之间存在的潜在关系。【结果】结果表明,CaNAC36序列在耐盐和敏盐材料中DNA和cDNA同源性分别为99.86%和100%;荧光定量的结果表明,CaNAC36在耐盐材料根和茎组织中表现为诱导上调表达,在敏盐材料根和叶中表现为诱导下调表达;对可能与CaNAC36存在互作关系的48个基因的注释信息进行分析后,发现跨膜蛋白、转运蛋白、水孔蛋白、氯离子通道蛋白、解毒蛋白等14个基因可能与CaNAC36存在功能互作。进一步分析发现,在PI201224和PI438643盐胁迫处理不同时间点、不同组织中,5个相关基因（Capana08g002748、Capana00g004514、Capana09g000275、Capana07g001450、Capana02g001031）的表达呈现显著差异。同时发现,CaNAC36及5个关联基因启动子域含有大量的逆境相关顺式作用元件。【结论】结合基因克隆、基因表达水平分析以及生物信息学分析,表明CaNAC36是辣椒响应盐胁迫的重要转录因子,并可能与其他基因相互作用以提高植株的耐盐性,可为深度研究辣椒耐盐性以及选育耐盐品种提供数据支撑。     

耐辐射球菌转录因子DdrO 的基因克隆与生物信息学分析

目的:克隆耐辐射球菌ddrO基因,并对其进行生物信息学分析,预测其功能。方法:根据耐辐射球菌ddrO基因序列,由Primer Premier 5设计一对引物,以提取的耐辐射球菌基因组为模板,PCR扩增获得耐辐射球菌ddrO基因,序列测定并利用生物信息学软件对ddrO基因的理化性质、高级结构及生物学功能等进行分析与预测。结果:成功获得了ddrO基因。生物信息学分析发现,ddrO基因核苷酸序列长度为396bp,编码一个131aa组成的相对分子质量为14.993kD的预测的DdrO转录因子。核酸同源性搜索及比较分析仅在与耐辐射球菌同属的Deinococcus geothermalis和Deinococcus deserti中发现高度相似的序列;蛋白同源性搜索发现一些与DdrO显著同源的蛋白,如Deide₂0570（95%）,Dgeo₀336（90%）,Deide₃p02170（82%）等;结构域分析发现DdrO含有HTH（helix-turn-helix）DNA结合结构域。结论:根据生物信息学结果预测DdrO蛋白可能具有转录调控作用,参与DNA修复和复制,在耐辐射球菌的DNA损伤修复过程中发挥一定作用。