干扰素IFNL4对巨噬细胞系THP-1免疫应答的影响

目的:分析Interferon-lambda 4(IFNL4)表达与巨噬细胞免疫应答间的关系,探讨IFNL4调控免疫应答的信号机制,发掘IFNL4在免疫调理方面的潜在应用价值。方法:建立THP-1细胞培养及分化刺激体系,使用RT-PCR检测不同分化状态THP-1细胞IFNL4的表达水平,并在THP-1细胞中过表达IFNL4,检测IFNL4过表达对THP-1细胞分泌IL-12、TNF-α、IL-10和TGF-β等细胞因子及细胞迁移效率的影响。结果:THP-1细胞分化抑制IFNL4的表达,分化前比分化后IFNL4表达水平相对定量下降255.46倍,差异显著性P0.001;M2极化巨噬细胞较M1细胞表达IFNL4因子水平升高14.69倍,显著性差异P=0.009;IFNL4过表达可抑制IL-12和TNF-α表达水平,其中TNF-α表达水平变化具有统计学意义(P=0.017),表达水下降5.97倍。IFNL4可促进IL-10和TGF-β的表达,其中TGF-β变化具有统计学意义(P=0.046),表达水平相对上升2.42倍。且IFNL4对THP-1细胞迁移效率具有抑制作用(P=0.005),刺激前细胞迁移数为45.33,IFNL4刺激后迁移数为32.67,迁移移效率下降1.39倍。结论:干扰素IFNL4在分化的M2型THP-1巨噬细胞中具有较高的表达水平,且对THP-1的免疫应答具有一定的抑制作用。     

Ipr1/PPE68重组BCG诱导BALB/C小鼠免疫应答的探讨

目的构建Ipr1/PPE68重组卡介苗(Recombinant BCG,rBCG),探讨其诱导BALB/C小鼠免疫应答的效果。方法将Ipr1和PPE68基因及结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)复制子OriM分别插入pBudCE4.1的多克隆位点,构建共表达穿梭质粒pBIPO,将其电转入BCG,构建Ipr1/PPE68-rBCG并将rBCG免疫BALB/C小鼠,检测小鼠血清中IgG2a、IL-12、IFN-γ及IL-4的水平、特异性脾淋巴细胞增殖和CD4+和CD8+T细胞数量,同时观察脾、肺荷菌量及脾、肺组织病理学变化。结果酶切测序及菌落PCR鉴定Ipr1和PPE68以及OriM基因序列与理论值相符,Western-blotting结果显示Ipr1和PPE68蛋白成功表达。Ipr1/PPE68-rBCG免疫小鼠后,血清中的IgG2a和IL-12水平及脾淋巴细胞增殖情况明显高于对照组,但与BCG组相比没有显著意义;IFN-γ水平显著低于BCG组,与对照组相比无显著性差异;各组别IL-4的水平差异均不明显。脾、肺荷菌实验未见菌落生长,肺、脾组织未见病理学改变。结论成功构建Ipr1/PPE68-rBCG,该重组BCG能诱导BALB/C小鼠的细胞免疫应答。     

脓肿分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞自噬相关分子的识别

为了探索THP-1巨噬细胞在脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus, MAB)感染后,与自噬相关的关键分子及其介导的生物学过程,从GEO和GeneCards数据库中挖掘MAB感染后THP-1巨噬细胞的自噬相关基因;利用DAVID在线工具对筛选的差异自噬相关基因进行基因本体论(GO)、京都基因和基因组数据库(KEGG)富集分析;采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法验证筛选的关键基因;将关键基因与自噬标志分子MAP1LC3A进行Pearson相关性分析。生物信息学分析显示,与自噬密切相关的差异表达基因共11个,其中前5个是BNIP3 (Bcl-2/adenovirus E1 B interacting protein 3)、BAMBI (BMP and activin membrane bound inhibitor)、MAP1LC3A (microtubule associated protein 1 light chain 3)、DYSF (Dysferlin)和MYOZ1 (Myozenin1);功能预测显示, 11个差异表达基因主要和自噬等过程相关;...     

肾上腺素对THP-1巨噬细胞TGF-β1、SR-A1和CD36表达的影响

目的:探讨肾上腺素对THP-1巨噬细胞TGF-β1、SR-A1和CD36表达的影响。方法:不同浓度肾上腺素处理THP-1巨噬细胞24h,运用逆转录多聚酶链反应检测其TGF-β1、SR-A1和CD36的mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测TGF-β1蛋白的表达,Westem-blotting检测SR-A1蛋白的表达。结果:100nmol/L及1μmol/L的肾上腺素作用THP-1巨噬细胞,引起TGF-β1 mR- NA和蛋白表达下调(p<0.05),SR-A1 mRNA和蛋白表达上调(P<0.05),1pmol/L～1μmol/L的肾上腺素处理后,各组CD36 mRNA水平无显著性变化(p>0.05)。结论:应激浓度的肾上腺素可能通过影响TGF-β1和SR-A1的表达而参与和/或促进AS的发生发展。     

结核分枝杆菌免疫相关蛋白脯氨酸-谷氨酸家族的研究进展

脯氨酸-谷酸家族蛋白是一个在结核分枝杆菌中新发现高度保守的富含甘氨酸、丙氨酸的酸性蛋白质家族。目前认为该家族与结核分枝杆菌抗原变异相关,有利于细菌逃避宿主免疫系统,并通过抑制宿主免疫细胞对其抗原的呈递过程影响机体的免疫应答,干扰宿主对结核感染的保护性。该家族蛋白作为结核感染的免疫学标志,在结核诊断和新药物靶向以及抗结核DNA疫苗的研制开发方面具有重要意义和广阔的应用前景。     

即早基因c-fos在THP-1单核巨噬细胞亚型极化中的差异表达*

目的:探讨即早基因c-fos在THP-1巨噬细胞亚型极化过程中的表达变化。方法:运用PMA刺激诱导THP-1单核细胞极化为巨噬细胞,观察c-fos在单核细胞极化过程中的表达变化;在PMA刺激的基础上,分别运用LPS和IL-4诱导THP-1巨噬细胞向M1及M2亚型极化,实时定量PCR及Western blot技术分析刺激24 h时,细胞亚型标记物CD274、CD86和CD163的表达变化,并动态观察诱导极化过程中,c-fos的表达情况。结果:c-fos在PMA刺激THP-1单核细胞分化为巨噬细胞过程中蛋白和mRNA水平显示上调;LPS诱导THP-1巨噬细胞极化为M1型过程中,c-fos蛋白和mRNA水平表达降低,其特异性标记物在24 h呈现出M1型极化的特点(CD86蛋白表达升高,CD274、CD163蛋白表达降低);IL-4诱导THP-1巨噬细胞极化为M2型过程中,c-fos蛋白和mRNA水平表达升高,其特异性标记物在24 h表现出M2型极化的特点(CD86蛋白表达降低,CD274、CD163蛋白表达升高)。结论:c-fos参与了THP-1单核细胞向巨噬细胞极化的过程,并且可能通过抑制巨噬细胞M1亚型形成,促进巨噬细胞向M2亚型极化的作用参与巨噬细胞的亚型极化及其功能调节中。     

母牛分枝杆菌制剂对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮水平的影响

母牛分枝杆菌制剂对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮水平的影响李晓明,庄玉辉,李国利,张小刚（解放军结核病研究中心,北京１０００９１）王国治,赵桂芳,刘勇,沈小兵（中国药品生物制品检定所,北京１０００５０）母牛分枝杆菌（Ｍｙｃｂｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖａｃ...     

结核分枝杆菌对宿主巨噬细胞死亡方式的调控

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染后能抑制宿主巨噬细胞（M西）的免疫反应,并在其中生存、复制。研究表明Mtb减毒株感染主要诱导宿主Mφ凋亡,凋亡能抑制胞内Mtb的活力;而Mtb毒力株感染能抑制凋亡的完成,诱导Mφ坏死,最终导致Mtb扩散、感染临近细胞。通过对Mtb感染诱导宿主Mφ不同死亡方式的讨论,进一步认识Mtb的致病机制。     

结核分枝杆菌Rv2628蛋白的免疫生物学特性

Rv2628蛋白是结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(M.tb)DosR调控的潜伏感染相关抗原。本研究对Rv2628蛋白进行了原核表达和纯化,并以巨噬细胞系和小鼠为研究模型,对其免疫生物学特性进行了分析。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,Rv2628-His融合蛋白以包涵体形式表达,能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异性反应,具有较好的免疫反应性。与巨噬细胞系RAW264.7的互作实验结果表明,在1–12 h内Rv2628蛋白能诱导前炎性因子IL-6的上调表达。将纯化的Rv2628融合蛋白皮下免疫BALB/c小鼠,夹心ELISA的测定结果表明,Rv2628蛋白免疫组诱导产生的特异性IFN-γ水平显著高于IL-4的水平(P0.000 1),呈现Th1型细胞免疫应答趋势;以Rv262811-30多肽作为包被抗原,通过间接ELISA测定的血清抗体效价能达到11 600,表明Rv2628也能诱导体液免疫应答。总之,Rv2628能促进巨噬细胞炎症反应的发生,激发小鼠产生强烈的Th1型细胞免疫应答和较好的体液免疫应答,具有作为亚单位疫苗的潜力,为M.tb与宿主之间的相互作用奠定了一定的理论基础。     

pcsk9 siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响

为研究pcsk9基因沉默后对氧化型低密度脂蛋(oxLDL)诱导THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响,用不同浓度oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot分别检测pcsk9 mRNA、NARC-1蛋白的表达.应用Lipofectamine2000转染3对pcsk9 siRNAs进THP-1源性巨噬细胞中,筛选出最有效的siRNA再转染入THP-1源性巨噬细胞,24 h后加入oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色观察细胞评价细胞凋亡,流式细胞术计数检测细胞凋亡率.结果发现,75 mg/L oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h后,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞.同时RT-PCR、Western blot检测发现,pcsk9 mRNA和NARC-1蛋白质表达量均随oxLDL浓度的增加而增加,75 mg/LoxLDL组增加最明显.不同浓度siRNA转染THP-1源性巨噬细胞后,RT-PCR筛选出3对siRNAs的终浓度为80 nmol/L均可出现明显的沉默效应.选取此浓度在蛋白质水平检测基因抑制情况,筛选出最有效的一对siRNA.将筛选出来的siRNA转染细胞24 h后,再用oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色及流式细胞计数结果显示,转染siRNA组凋亡明显被抑制.结果表明,在本研究的浓度范围内,随着oxLDL浓度增加pcsk9的表达随之增加,同时,THP-1源性巨噬细胞凋亡也明显增加,75 mg/L oxLDL最明显,pcsk9 mRNA和蛋白质的表达也在该浓度最高.提示pcsk9 siRNA能有效抑制pcsk9基因的表达,从而有效抑制由oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡.     

肉苁蓉多糖对THP-1细胞吞噬作用的影响及其机理研究

将单核细胞株THP-1按照随机数字表随机分为观察组和对照组两组,正常的观察组给予肉苁蓉多糖培养液,根据肉苁蓉多糖浓度不同又分为10、50、100μg/L组,对照组不添加肉苁蓉多糖培养液,实验组中的不同浓度组、对照组,每组各24例.比较各组THP-1细胞吞噬率、吞噬指数以及细胞因子分泌水平,以此研究肉苁蓉多糖对THP-1细胞吞噬作用的影响并探讨其发生机理.结果显示,观察组中10、50、100μg/L组单核巨噬细胞吞噬率分别为(17.42±3.19)%、(23.32±3.82)%、(29.41±4.11)%,均高于对照组的(9.34±1.26)%,比较差异有统计学意义(F=162.63,P<0.01);10、50、100μg/L组单核巨噬细胞吞噬指数分别为(0.45±0.13)、(0.67±0.19)、(0.82±0.21),均高于对照组的(0.22±0.09),比较差异有统计学意义(F=62.60,P<0.01);10、50、100μg/L组IFN-γ分别为(4.21±1.11)、(7.38±1.86)、(9.51±2.10)mg/L,均高于对照组(0.79±0.06)mg/L,比较差异有统计学意义(F=152.74,P<0.01);10、50、100μg/L组IL-1分别为(24.11±4.15)、(74.60±11.21)、(103.61±19.65)mg/L,均高于对照组(10.21±1.39)mg/L,比较差异有统计学意义(F=343.15,P<0.01),各指标进一步采用Newman-Keals法进行两两比较均有统计学意义(P<0.01).由此认为,肉苁蓉多糖可能通过增强THP-1细胞吞噬能力和促细胞因子释放发挥免疫调节功能.     

EGb761对LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白表达的调节

目的:探讨EGb761对LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白表达的调节,为EGb761的临床运用提供可行的依据。方法:LPS(1μg/m L)诱导不同时间后,western blotting检测THP-1细胞上清液中HMGB1蛋白含量变化及不同浓度EGb761对LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白的表达和NF-κB的活性;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。共聚焦显微镜观察EGb761对LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白核转位变化。结果:(1)LPS组IL-1β、IL-6、TNF-α的含量在刺激6-12 h后明显高于空白对照组,而EGb761+LPS组IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均显著低于LPS组(P0.05)。(2)EGb761处理LPS诱导THP-1细胞6 h后细胞上清液NF-κB活性表达量较空白对照组低,随着处理时间延长至12 h,NF-κB的活性表达量呈明显下降趋势(P0.05)。(3)LPS诱导THP-1细胞18 h后,细胞上清液中HMGB1蛋白含量呈明显升高趋势(P0.05)。(4)不同浓度EGb761对LPS诱导THP-1细胞18 h后,HMGB1蛋白含量较空白对照组有下降趋势,HMGB1蛋白含量随着EGB761浓度增加至100μg/m L呈下降趋势并呈浓度依赖效应(P0.05)。(5)LPS诱导THP-1细胞后,在共聚焦显微镜下可见胞浆中大量HMGB1蛋白标记分布,而EGb761+LPS共同诱导THP-1细胞后胞浆中可见少量HMGB1蛋白分布。结论:LPS可诱导THP-1细胞IL-1β、IL-6、TNF-α表达增多及NF-κB活化,导致HMGB1蛋白表达增多及核转位,而EGB761能抑制THP-1细胞IL-1β、IL-6、TNF-α表达及NF-κB活化,调节HMGB1蛋白的表达及核转位。     

pcsk9 siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响

为研究pcsk9基因沉默后对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响,用不同浓度oxLDL 处理THP-1源性巨噬细胞48 h,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot分别检测pcsk9 mRNA、NARC-1蛋白的表达．应用Lipofectamine2000转染3对pcsk9 siRNAs进THP-1源性巨噬细胞中,筛选出最有效的siRNA再转染入THP-1源性巨噬细胞,24 h后加入oxLDL处理 48 h,Hoechst33258染色观察细胞评价细胞凋亡,流式细胞术计数检测细胞凋亡率．结果发现,75 mg/L oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h后,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞．同时RT-PCR、Western blot检测发现,pcsk9 mRNA和NARC-1蛋白质表达量均随oxLDL浓度的增加而增加,75 mg/L oxLDL组增加最明显．不同浓度siRNA转染THP-1源性巨噬细胞后,RT-PCR筛选出3对siRNAs的终浓度为80 nmol/L均可出现明显的沉默效应．选取此浓度在蛋白质水平检测基因抑制情况,筛选出最有效的一对siRNA．将筛选出来的siRNA转染细胞24 h后,再用oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色及流式细胞计数结果显示,转染siRNA组凋亡明显被抑制．结果表明,在本研究的浓度范围内,随着oxLDL浓度增加pcsk9的表达随之增加,同时,THP-1源性巨噬细胞凋亡也明显增加,75 mg/L oxLDL最明显,pcsk9 mRNA和蛋白质的表达也在该浓度最高．提示pcsk9 siRNA能有效抑制pcsk9基因的表达,从而有效抑制由oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡．     

氧化低密度脂蛋白对THP-1巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响

目的:探讨氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)对巨噬细胞源性泡沫细胞吞噬功能和炎症相关因子分泌功能的影响。方法:利用佛波酯(phorbol ester,PMA)诱导THP-1细胞分化形成巨噬细胞,之后采用ox-LDL处理48小时后,诱导其形成泡沫细胞。利用中性红吞噬实验,分析泡沫细胞形成前后吞噬功能的变化;通过ELISA法,检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)含量,观察ox-LDL对THP-1巨噬细胞功能的影响。结果:细胞形态学结果表明,我们成功利用ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞形成泡沫细胞;进一步发现ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞表面的清道夫受体CD36表达升高,并促进细胞吞噬功能增加,进一步促进细胞内胆固醇含量显著升高(P0.05);同时,ox-LDL能够刺激巨噬细胞大量分泌TNF-α(P0.05)。结论:ox-LDL通过增强清道夫受体CD36表达,提高巨噬细胞的吞噬功能,引起大量胆固醇聚集,产生细胞毒性损伤,并促进TNF-α炎性因子的大量分泌。     

结核分枝杆菌蛋白Rv3425对细菌表型及毒力影响的研究

为探索蛋白Rv3425在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M. tuberculosis)中的功能,本研究以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M. smegmatis)为模式菌株,构建重组了耻垢分枝杆菌Ms-Rv3425。分别将构建菌株(Ms-Rv3425)、野生株(Ms)及空载对照(Ms-Pact)接种于7H9-OADC培养基中37 ℃培养,观察Ms-Rv3425与Ms及Ms-Pact之间在生长速率、菌落形态、生物膜以及聚集度方面的差异。分别用低pH值以及含有十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、氨苄西林、异烟肼及利福平的培养基进行培养,计算存活率以分析抗逆和抗药能力;用上述压力条件培养结核分枝杆菌标准株H37Ra,分析Rv3425内源表达量的变化;进行THP-1细胞感染和BALB/c小鼠攻毒实验分析菌株的毒性变化。结果显示,与Ms及Ms-Pact相比,Ms-Rv3425的菌落形态更为粗糙且隆起,成膜及聚集能力增强;在压力条件下,Ms-Rv3425表现出更高的抗逆和抗药能力,H37Ra中Rv3425的表达量也显著上调;胞内存活率及小鼠致死率更高,各脏器病理损伤更为严重。综上所述,过表达Rv3425能够改变耻垢分枝杆菌的表型,提高抗逆性、抗药性和毒力。深入探讨PPE家族蛋白Rv3425的功能,将为结核病的防治带来新的视角。     

CpG ODN增强rHBsAg疫苗对小鼠免疫应答影响的研究

通过CpG寡核苷酸(CpG ODN)与重组HBsAg蛋白疫苗(rHBsAg)联合免疫C57BL/6BL/6小鼠,观察CpG ODN对小鼠免疫状况的影响。试验分对照、乙肝疫苗以及用乙肝疫苗加CpG三组,MTT法分别进行HBsAg特异性刺激淋巴细胞转化试验、HBsAg特异性刺激细胞毒性T细胞杀伤试验、自然杀伤细胞非特异性杀伤试验,以及ConA刺激淋巴细胞转化试验;ELISA测定HBsAb、INF-γ、IL-12和IL-4结果中,疫苗加CpG组抗原特异性转化试验指数为4.05±0.31;疫苗加CpG组抗原特异性CTL率为82.27±22.64,在统计学上差异显著(P<0.05);而HBsAb、INF-γ、IL-12的结果分别为51.85±14.41、802.25±104.25和373.62±66.58,与对照组及疫苗组比较,差异显著(P<0.05)。CpG ODN能作为一种新的免疫佐剂更好地增强重组乙肝表面抗原蛋白疫苗诱导小鼠产生高效的体液和细胞免疫应答。     

结核分枝杆菌eis基因对鼠巨噬细胞Raw264．7白噬影响的研究

目的探讨结核分枝杆菌eis基因对巨噬细胞自噬的影响。方法将鼠巨噬细胞Raw264．7以自噬体荧光表达质粒GFP-LC3转染,将含eis基因的重组耻垢分枝杆菌MS—pmv261-eis与不含eis基因的耻垢分枝杆菌MS—pmv261分别感染宿主巨噬细胞,透射电镜下观察自噬小体形成情况,荧光显微镜下观察自噬荧光并计数,Westernblot检测如基因表达的蛋白及自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达水平。结果结核分枝杆菌eis基因可抑制感染宿主细胞自噬小体的形成,并显著抑制自噬荧光小点形成（P〈0．05）,显著降低了自噬蛋白LC3-Ⅱ表达水平。结论结核分枝杆菌e曲基因对Raw264．7细胞自噬有抑制作用。     

检测不同毒力结核分枝杆菌感染对巨噬细胞凋亡的影响及其Caspase-3和Bcl-2的表达

该文为探讨不同毒力的结核分枝杆菌感染对巨噬细胞凋亡的调控作用及其机制。实验用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗BCG分别感染巨噬细胞RAW264.7株,同时设空白对照组,在感染后1,6,12,24 h,用流式细胞技术检测各组巨噬细胞的凋亡率,应用Western blot检测细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表达。结果发现,结核分枝杆菌感染组的凋亡率显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);BCG感染组凋亡率高于H37Rv感染组,在感染后1,12,24 h凋亡率显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后其Caspase-3蛋白表达增高,结核分枝杆菌感染组的Caspase-3蛋白表达高于对照组:对照组相似文献