地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)突变株的生化互补和力复霉素合成途径的研究——(Ⅰ)力复霉素生化互补突变株的筛选

本文报导了由力复霉素产生菌,地中海诺卡氏菌诱变得到的非活性突变株,经共合成方法由6株非活性突变株配成8对有共合成能力的生化互补菌株,并证明互补菌株共合成产生力复霉素并不是由于酶的作用,而是由于一株非活性突变株产生一种力复霉素合成途径的中间产物,经另一非活性突变株转化为力复霉素。前者为供体菌,后者为受体菌或转化菌,供体菌在力复霉素生物合成途径上经突变而引起的阻断部位必然在受体菌的后面。 五株突变株生化互补的产物具有生物活性,并经紫外和可见光吸收光谱的测定,证明是属于力复霉素一类环桥抗菌素。     

力复霉素生物合成中间体A-32的生物学特性与结构的研究

本文报道了地中海诺卡氏菌Nocardia mediterranei经诱变育种获得的两株无活力菌株(rifl、nf2),能经共合成产生力复霉素,即其中供体菌株r·fl,在发酵液中累积一个中间体A一32,能被另一个无活力菌株nf 2转化为力复霉素[1,2]。此中间体(A一32)经分离纯化,理化性质和生物活性研究以及lR、NMR、Ms的光谱测定,确证A一32结构为3一羟基5氨基苯甲酸(简称A一32),这与Kibby等[3]推测中间体C,N的化学结构是相同的物质,从而证明了化合物C,N是力复霉素的一个天然中间体．     

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)突变株的生化互补和力复霉素生物合成途径的研究——Ⅱ.力复霉素的生化互补图

用琼脂块转化的交叉互补方法以及液体共合成的初筛和复筛,将69株力复霉素产生菌,地中海诺卡氏菌的非活性突变株(rjf~-)分为五个类群,即类群Ⅰ至类群Ⅴ。根据供体菌与受体菌生化互补共合成力复霉素的特性,初步制出了力复霉素的生化互补图,为提取和研究力复霉素生物合成的中间产物,阐明力复霉素的生物合成途径打下了基础。     

~(57)Co(钴~(57))—争光霉素参入人食管鳞癌细胞株CaEs-17的增殖周期时相

我国自行筛选的抗肿瘤抗菌素——争光霉素与博莱霉素的理化性质基本相同。~(57)Co-争光霉素A_2+B_2混合品和A_5纯品参人人食管鳞癌细胞株CaEs-17的放射自显影图表明~(57)Co-争光霉素(混合品和A_5)参人到CaEs-17细胞核中,核仁参入很少,胞质不参入。从而在细胞内定位方面说明了争光霉素与DNA结合的特异性。这和博莱霉素与DNA的特异性结合、并与DNA相互作用、而不与rRNA、tRNA、白蛋白结合和作用的结果是一致的。通过~(14)C-TdR与~(57)Co-争光霉素同时参入及先后参入的双标记放射自显影图和显微分光光度计对标记和未标记细胞DNA相对含量测定等方法,证实了~(57)Co-争光霉素(混合品和A_5)参入到带有G_1/G_0期DNA含量的CaEs-17细胞中。     

地中海拟无枝菌酸菌U32染色体特性的脉冲场电泳分析

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32是产力复霉素SV的工业生产菌株。采用脉冲场电泳分析发现,地中海拟无枝菌酸菌U32仅有一条约10 Mb的线性染色体, 没有内源性质粒。利用Southern杂交法,对11个编码力复霉素生物合成、相关初级、次级代谢关键酶以及调控蛋白的基因,在U32染色体DNA的PshBI酶切片段上进行了定位。分析发现在一条长度约700kb的PshBI酶切片段上,分别存在着力复霉素合成基因簇(rif)、氮代谢的亚硝酸还原酶小亚基基因(nasD)、衔接初级与次级代谢的甲基丙二酰变位酶基因(mcm)、脂肪酸代谢的乙酰辅酶A羧化酶生物素载体蛋白基因(accA)以及一套核糖体RNA转录单元。同时还发现U32至少有5套核糖体RNA转录单元。其余定位的基因均只出现单一杂交信号。     

较长时间内~(15)N标记的氨态氮和硝态氮在小嵩草草甸中的运移规律(英文)

运用15N稳定性同位素技术,对15N标记的硝酸盐和铵盐在输入小嵩草(KobresiapygaeaC.B.Clarke)草甸11~13个月后的运移规律进行了研究。在经历11~13个月后,进入无机氮库中的15N很少,一般不超过所输入氮素的1%,而较多的15N为土壤有机质、土壤微生物和植物所固持。NO3--15N和NH4 -15N在小嵩草草甸中的运移规律差异很大。在11、12和13个月后,NO3--15N的总恢复率分别为92.83%、92.64%和79.96%;而NH4 -15N的则分别为49.6%、63.33%和66.22%。两者的差异在土壤有机质、土壤微生物和植物等库之间的分配中更加明显。输入NO3--15N时在11、12个月后植物所固持的15N最多,而土壤微生物和土壤有机质所固持的15N比较接近,而在13个月后,土壤有机质和植物所固持的15N接近,而土壤微生物所固持的15N下降许多;当输入NH4 -15N,土壤有机质所固持的15N比植物和土壤微生物所固持的都多,而且植物所固持的15N比较稳定,而土壤微生物所固持的15N则有较大变化。这表明在较长的时间内嵩草草甸对NO3-和NH4 的固持能力是不一样的。     

较长时间内15N标记的氨态氮和硝态氮在小嵩草草甸中的运移规律

运用15N稳定性同位素技术,对15N标记的硝酸盐和铵盐在输入小嵩草(Kobresia pygaea C.B.Clarke)草甸11～13个月后的运移规律进行了研究.在经历11～13个月后,进入无机氮库中的15N很少,一般不超过所输入氮素的l%,而较多的1 5N为土壤有机质、土壤微生物和植物所固持.NO3--15N和NH4 -1 5N在小嵩草草甸中的运移规律差异很大.在11、12和13个月后,NO3--15N的总恢复率分别为92.83%、92.64%和79.96%;而NH4 -15N的则分别为49.6%、63.33%和66.22%.两者的差异在土壤有机质、土壤微生物和植物等库之间的分配中更加明显.输入NO3--15N时在11、12个月后植物所固持的15N最多,而土壤微生物和土壤有机质所固持的15N比较接近,而在13个月后,土壤有机质和植物所固持的15N接近,而土壤微生物所固持的15N下降许多;当输入NH4 -15N,土壤有机质所固持的1 5N比植物和土壤微生物所固持的都多,而且植物所固持的15N比较稳定,而土壤微生物所固持的15N则有较大变化.这表明在较长的时间内嵩草草甸对NO3-和NH4 的固持能力是不一样的.     

季节性流感病毒H1N1 BALB/c鼠肺适应株的建立及其分子机制

目的建立季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株,并对适应的分子机理进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,观察小鼠存活情况及肺病理改变,来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株。结果季节性流感H1N1 A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株,经过在小鼠体内进行8次传代后,毒力逐渐增强,从无致病力到致死率达到100%,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因发生了3个有义突变。结论野生季节性低致病力H1N1流感病毒可经在小鼠中经过多次传代而获得高致病力H1N1鼠肺适应株,HA蛋白89位Thr至Ile的突变对毒力的增强起决定性作用。     

季节性流感病毒 H1N1 BALB / c 鼠肺适应株的建立及其分子机制简

目的 建立季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株,并对适应的分子机理进行研究.方法 以病毒滴鼻感染小鼠,通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,观察小鼠存活情况及肺病理改变,来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株.结果季节性流感H1N1 A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株,经过在小鼠体内进行8次传代后,毒力逐渐增强,从无致病力到致死率达到100%,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因发生了3个有义突变.结论 野生季节性低致病力H1N1流感病毒可经在小鼠中经过多次传代而获得高致病力H1N1鼠肺适应株,HA蛋白89位Thr至Ile的突变对毒力的增强起决定性作用.     

外源无机氮素形态对土壤氨基糖动态的影响

微生物生长对底物的可利用性存在不同的响应,外源氮素的形态可以显著影响微生物代谢过程,而土壤氨基糖作为微生物细胞壁残留物,其形成、分解和周转特征与外源碳氮供给密切相关,对土壤氨基糖的研究与同位素标记技术相结合,可以进一步反映微生物对底物的利用特征.本文以葡萄糖及15N标记的NH4+和NO3-为底物,利用气相色谱-质谱联机技术,通过测定氨基糖中同位素富集比例,跟踪新形成(标记)和原有(非标记)的土壤氨基糖的动态变化.结果表明:在培养过程中,15N标记的氨基糖含量显著增加,NH4+向氨基糖的转化显著高于NO3-,反映出微生物对NH4+的选择性利用.土壤中原有的氨基糖也发生了不同变化.其中,非标记氨基葡萄糖在N H4+为底物时,其含量有所增加,但在NO3-为底物时含量逐渐下降;非标记胞壁酸含量在2个处理中均不断下降,尤其以NO3-为底物时更为显著;非标记氨基半乳糖含量的增减幅度均小于20％.这种特异性变化表明,不同来源的微生物细胞壁残留物对土壤氮素周转和稳定的作用不同,真菌细胞壁残留物易于在土壤中积累,有利于土壤有机质的稳定,而细菌细胞壁残留物容易分解,在土壤有机质周转过程中起重要作用.     

禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突变株的构建 及部分生物学特性的分析

基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用入噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2（血清型O2：K89）Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株A2△fimH：：Cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20（温度敏感性）以去除上述缺失突变株中抗性基因标志,结合PCR扩增和测序结果,证明fimH基因缺失株A2AfimH的正确构建。通过fimH基因互补试验使A2afimH缺失突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性。红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明,野生株呈现良好的凝集效果,并能被0．5％甘露糖完全抑制,而A2afimH缺失突变株未呈现任何凝集现象。体外生长试验结果表明,在同样的培养条件下,A2afimH缺失突变株生长周期的各个阶段都要稍慢于野生株。禽致病性大肠杆菌国内分离株Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株成功构建,为进一步深入研究禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制,肠道外感染的致病机理及对国内禽大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础。     

地中海富盐菌PhaE蛋白乙酰化修饰对其功能的影响

【目的】研究地中海富盐菌PHA合酶(Pha EC)中Pha E亚基乙酰化修饰对其功能的影响,探讨乙酰化修饰对菌体生理代谢的调控作用。【方法】蔗糖密度梯度离心收集PHA颗粒,质谱鉴定颗粒结合蛋白Pha E的乙酰化位点。将乙酰化位点(赖氨酸,K)分别突变为精氨酸(R)(模拟去乙酰化)或谷氨酰胺(Q)(模拟乙酰化),利用同源双交换原理,将突变后的基因原位敲入基因组。以野生型为对照,检测突变对菌体生长、葡萄糖消耗和PHA合成能力的影响。利用Western blot检测PHA颗粒上Pha E的含量,进一步分析乙酰化修饰对蛋白功能的影响。【结果】在Pha E蛋白105位和170位赖氨酸(K)2个位点检测到乙酰化修饰。利用遗传操作系统将突变的基因原位敲入,共得到6种突变株。发酵结果表明,任何一种单突变对菌体生长及PHA合成的影响均不明显。但当2个位点同时突变成精氨酸(K105R/K170R)时,突变株生长及合成PHA的能力均受到明显抑制,2个位点同时突变成谷氨酰胺(K105Q/K170Q)则无明显影响。进一步的Western blot结果表明,突变成精氨酸的双突变株的PHA颗粒上,Pha E蛋白的含量相较于野生型约降低了一半。【结论】Pha E蛋白的去乙酰化能够导致菌株利用葡萄糖合成PHA的能力显著降低,其可能原因是降低了Pha E与PHA颗粒或PHA颗粒上Pha C的结合能力,从而降低了Pha EC合酶的活性。     

PB2蛋白T271A突变增强了欧亚类禽猪流感病毒在小鼠中的致病力

目前,欧亚类禽猪流感病毒(Eurasian avian-like H1N1 swine influenza viruses,EA H1N1 SIVs)在我国猪群中广泛流行,同时可跨越种属屏障感染人。PB2-T271A是H5N1、H7N9和2009年甲型H1N1流感病毒中关键的分子标记,可增加病毒在小鼠中的致病力。但是,PB2-T271A对EA H1N1 SIVs的影响尚不清楚。在本研究中,我们分析了PB2-T271A突变对EA H1N1 SIVs在细胞和小鼠中复制能力的影响。本研究发现,PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs在哺乳动物细胞和禽细胞中的复制能力,增加了EA H1N1 SIVs在小鼠中的致病力。此外,PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs的聚合酶活性。因此,我们应该加强对EA H1N1 SIVs中PB2-T271A位点的监测。     

五川源头溪流系统氮的迁移和转化

利用氮稳定同位素法、综合常规水样监测以及微环境培养方法探讨了五川农业溪流沿程氮的迁移转化过程.结果表明,溪流沿程NO3-N浓度变化范围为0.5～4.5 mg L-1,平均为1.26 mg L-1,且多数月份总体上呈逐渐升高的趋势,同时NO-3的δ15N存在降低趋势,两者呈线性负相关(R2>0.80),表现明显的硝化过程典型特征.各采样点的NO2-N、DO、DOC浓度与NO3-N也存在一定的线性相关关系,说明了硝化过程的发生和氮在不同形态之间的转化.溪流水体微环境培养实验证明了水体中的NH4-N和NO3-N浓度在培养期内并无明显变化,以上数据和相关关系充分表明了流域沿程地表径流氮素输入和溪流系统沉积物和水体界面的硝化过程共同作用可能是五川溪流沿程NO3-N与NH4-N浓度升高,而NO-3的δ15N值减小的主要原因.因此,在农业流域的污染源评价中,需要重新审视和调查河道系统内部氮的转化和贡献.     

光合细菌Rhodobacter sphaeroides glnB-lacZ融合子的构建与表达

亚克隆了Rhodobacter sphaeroides glnB启动子,以pMP220为载体构建成glnB-lacZ融合子。将glnB-lacZ、 nifH-lacZ、 nifA-lacZ分别导入R.sphaeroides谷氨酸合酶突变株gltB-、 gltD-和野生型菌株中,分析了突变对固氮基因转录表达的影响。试验证明,在gltBD突变株中nifH的表达受阻遏,nifA表达水平很低。这证明glt基因的突变引起固氮酶结构基因和固氮正调节基因的转录被阻遏,而glnB基因的表达几乎不受影响。试验还测定了环境中结合态氮和有机酸等信号分子对glnB和nifH表达的影响,发现加入氨或谷氨酰胺后,nifH的表达受到明显的阻遏作用,glnB-lacZ的β-半乳糖苷酶活性虽下降30%左右但不随结合态氮浓度升高而变化,仍维持在一个较高的水平。α-酮戊二酸和丙酮酸对nifH的表达有部分去阻遏作用而对glnB的表达无诱导作用。     

玉米联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A转座突变体系的构建

【背景】长期以来,农业生产上过度施用化学氮肥造成了农田生态环境的破坏,引起土壤板结、次生盐渍化和重金属污染。此外,由于田间大量的氮素流失和淋溶导致水体富营养化和地下水污染,使得农产品硝酸盐含量超标,最终可能通过食物链危及人类的健康。因此,通过合理地开发和利用生物固氮菌,从而减少化学氮肥施用量,对于保护生态环境,促进农业的可持续生产具有十分重要的意义。【目的】对从玉米根部分离得到的联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A进行Tn5转座突变,从而创制大量的突变体,经筛选后应用于对固氮及其调控的分子机制和氮代谢调控网络解析等研究。【方法】以固氮菌K.radicincitans GXGL-4A为研究对象,通过PCR法克隆得到GXGL-4A菌株的亚硝酸还原酶基因nirBD。通过构建重组质粒pMOD-egfp-tet,并利用电击转化法将转座复合体导入GXGL-4A野生株,进行Tn5转座突变,从而获得大量突变菌株。【结果】筛选到4株亚硝酸盐还原酶活性显著降低的突变株,并克隆了突变株M36突变位点的侧翼序列。【结论】对玉米联合固氮菌K.radicincitans GXGL-4A进行Tn5转座突变是可行的,初步建立了该菌株稳定有效的插入突变技术体系。     

教酒链霉菌NRRL 3882中钙霉素生物合成后修饰基因calD的功能分析

【目的】钙霉素是二价阳离子载体,是一类含有吡咯环的聚醚类抗生素,广泛用于细胞二价阳离子的生物学功能研究。本文以钙霉素生物合成基因簇中cal D基因为研究对象,通过蛋白质同源序列比对、基因敲除、回补验证及HPLC/MS分析,对cal D基因的功能进行表征。【方法】对cal D基因功能进行生物信息学预测。选用钙霉素产生菌Streptomyces chartreusis NRRL 3882,通过PCR-targeting的方法对cal D基因进行敲除获得突变株,再将cal D基因克隆到链霉菌整合质粒上,通过接合转移技术将cal D回补到缺失株中。使用HPLC/MS技术对菌株发酵产物进行分析。【结果】生物信息学预测Cal D蛋白酶属于氧化还原酶。获得cal D基因敲除突变株Δcal D及基因回补菌株Δcal D:cal D。HPLC/MS检测到cal D基因的缺失菌株大幅降低钙霉素产生能力,与野生型菌株相比,突变株中积累更多的3-Hydroxylcezomycin和更少的氮-去甲基钙霉素。【结论】cal D参与钙霉素的生物合成。cal D的缺失导致3-Hydroxylcezomycin的积累,推测cal D负责钙霉素生物合成途径中苯并噁唑环3位上羟基转化成酮基的氧化反应。初步阐明了cal D基因在钙霉素生物合成途径中的功能机制。     

PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒致病性的影响分析

目的利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/San-Jiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50～106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致;rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。     

不同烤烟品种衰老叶片的无机氮积累及其生理调控

以不同烤烟品种‘红花大金元’和‘中烟100’为试验对象,研究同一生育期不同部位叶片的无机氮积累及其与氮素代谢和氨挥发的关系。结果表明,烟草植株下部衰老叶片（第5片叶）NO3^-和NH4^＋的含量要高于中部叶（第10和第15片叶）和上部叶（第20片叶）,并且‘红花大金元’下部叶NO3^-和NH4^＋的含量比‘中烟100’显著偏高;‘中烟100’植株各部位叶片的氨气补偿点比‘红花大金元’高。两个品种在第5到第20叶位间的谷氨酰胺合成酶（GS）、硝酸还原酶（NR）和谷氨酸脱氢酶（GDH）活性大小及其变化不一致,是叶片无机氮积累存在品种间差异的生理基础。