柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

大蒜花叶病毒外壳蛋白基因cDNA的克隆和序列分析

我们从自然发病的大蒜中分离得到了大蒜花叶病毒。以其基因组ＲＮＡ为模板合成了３＇末端部分ｃＤＮＡ。从中选出一批插入片段在２．０ｋｂ以上的重组克隆,经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交分析证实了所选克隆与基因组ＲＮＡ同源。通过对若干个克隆的插入片段两端部分序列的测定,选出一个克隆ｐＧＭ４９５,其插入片段的长度约为２．４ｋｂ,３′末端存有一个Ｐｏｌｙ（Ａ）结构,它应包含了编码该病毒外壳蛋白全部序列。序列测定的结果表明,这个ｃＤＮＡ片段全长为２３７９ｂｐ,其中含有与酶切图谱分析结果相符的ＥｅｏＲＩ、ＰｓｔＩ及ＢａｍＨＩ酶切位点。第一个终止密码子ＴＡＡ与３′ｇ末端相距２６４ｂｐ,我们根据碱基序列推定的氨基酸序列与其它已发表的Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ的外壳蛋白氨基酸序列以及外壳蛋白翻译后加工的蛋白酶专一切点相比较后推测,编码该病毒外壳蛋白序列可能起始于３′末端上游的１１７０ｂｐ处,共编码３０２个氨基酸,其分子量为３６ｋＤ,略大于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ所测定的３３ｋＤ,非编码区域长２６４ｂｐ,富含ＡＴ,并有多个终止密码子的存在。趾３′末端３２～２７ｂｐ处有一个ＡＡＴＡＡ序列。     

Epstein－Barr病毒潜伏膜蛋白（LMP）基因在哺乳动物传代细胞中的表达

ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）是由病毒编码的主要的与病毒致宿主细胞潜伏感染有关的蛋白之一。我们用基因重组技术,把含有ＬＭＰ基因（ＢＮＬＦ１）３个外显子（ｅｘｏｎ）开放阅读框架（ＯＲＦ）的长１．８０ｋｂｐ的ＤＮＡ片段,和能分解ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ的含有ＳＶ４０早期启动子和ＨｇｒｙｏｍｙｃｉｎＢ磷酸转移酶全基因（长１０２５ｂｐ）的ＤＮＡ片段（长１．６０ｂｐ）,同时重组于亚克隆载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（ｐＢＳ）中,并使该重组质粒ｐＢＳ－ＬＭＰ－Ｈｙｇ（长５７６７ｂｐ）在乳地鼠肾传代细胞（ＢＨＫ）中获得表达。ＢＨＫ细胞在经此重组质粒转染后,ＬＭＰ阳性细胞是２％,在ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ的持续压力下,ＬＭＰ表达细胞率可达２０％。３个月后,ＬＭＰ表达细胞逐渐减少。５个月后,不能测到ＬＭＰ表达细胞。经免疫荧光和蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ）实验证实,人鼻咽癌、风湿性关节炎和正常人血清中不含有抗ＬＭＰ抗体。     

美洲商陆一种抗真菌蛋白的cDNA克隆及序列分析

根据美洲商陆种子中一种抗真菌蛋白ＰＡＦＰ的Ｎ端部分氨基酸顺序,设计,合成一条５‘端寡核苷酸引物,通过３’－ＲＡＣＥ技术从种子总ＲＮＡ扩增出一约３５０ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,成功地克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统中。序列分析该,ｃＤＮＡ含有１１４ｂｐ的编码区,由此推导的３８个氨基酸序列有３６个与ＰＡＦＰ的序列相同,仅在第３５,３６位氨基酸分别由Ｃｙｓ,Ｌｙｓ代了后者的Ｇｌｎ和Ｉｌｅ。     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｃ２总ＤＮＡ经ＰｓｔＩ部分酶切后分离２～１０ｋｂ的片段,插入质粒ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点,转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）,利用几丁质平板从约８０００个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆（命名为ｐＣＨＴ１）。用１２种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长３０ｋｂ,其中各有一个ＫｐｎＩ,ＳａｃＩ和ＳｓｐＩ位点。把该克隆片段反向插入ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实了该片段来自于Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣ２基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它７株几丁酶产生菌的总ＤＮＡ杂交。     

伪狂犬病毒蛋白激酶基因的PCR扩增及其克隆鉴定

以ＢＨＫ－２１细胞单层上增殖的伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）,经离心浓缩后,用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ消化法分离纯化ＰＲＶ基因组ＤＮＡ。参照ＰＲＶＫａ株和ＮＩＡ－３株蛋白激酶（ＰＫ）基因的ＤＮＡ序列,设计并合成了一对长度为２６ｂｐ和３２ｂｐ的引物,以纯化的ＰＲＶ基因组ＤＮＡ为模板,用ＰＣＲ技术成功地扩增出我国伪狂犬病毒地方株的ＰＫ基因,并将它克隆于ｐＵＣ１９载体。酶切分析结果表明,所获ＰＫ基因克隆在ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ和ＳａｌＩ上的切点与ＰＲＶＮＩＡ－３株相同。为下一步进行ＰＫ基因的体外缺失和重组,以构建减毒的ＰＫ缺失疫苗株奠定了基础。     

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

ＣＳ３是某些肠毒素大肠杆菌菌体表面上的多聚物,它能使病原菌粘附于宿主的小肠上皮细胞上,是致病的重要因素．为了探索ＣＳ３菌毛抗原基因的表达调控机制,根据ＣＳ３亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着ｒｂｓ位点及原核启动子的－１０区和－３５区ＤＮＡ序列．采用基因重组技术将ＣＳ３结构基因上游１２０ｂｐ的ＤＮＡ片段亚克隆进缺乏启动子而只含报告基因ｌａｃＺ的质粒ｐＣＢ２６７中．凝胶滞留和启动报告基因表达的实验证明了ＣＳ３亚基结构基因具有自身的启动子（Ｐｓ）．将该启动子上游区域不同长度的核苷酸片段克隆进ｐＣＢ２６７中,报告基因表达结果表明ＣＳ３结构基因的表达受其上游区域的抑制．核苷酸序列分析发现,在Ｐｓ－３５区上游５５０ｂｐ和８４０ｂｐ处各存在一个富Ａ－Ｔ簇．结合原核启动子的一般作用规律推知,ＣＳ３的表达可能受ＤＮＡ结合蛋白型的正向调节因子的作用．用ＣＦＡ／１菌毛抗原基因的正向调节基因ｃｆａＤ对ＣＳ３基因进行的互补表达试验表明ｃｆａＤ基因不仅可消除上游区对Ｐｓ的抑制,而且可大幅度地提高Ｐｓ的启动能力．在分析表达调控的基础上获得ＣＳ３重组高效表达．同时提出了其表达调控模型．     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用ＰＣＲ技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中,分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体,获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明,该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点,而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明,质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒,插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。     

芝田硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶,即麦芽寡糖基海藻糖合酶（ ＭＴＳａｓｅ） 的基因,扩增的２－２ｋｂ ＤＮＡ 插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０ 中,构建成重组质粒ｐＳＢＧＴ１ 。ｐＳＢＧＴ１ 中ＭＴＳａｓｅ 基因在大肠杆菌中得到表达。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物ＭＴＳａｓｅ蛋白的分子量约为７４ｋＤａ ,同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约４－４ ％ 。ｐＳＢＧＴ１ 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物,使ＤＥ 值降低,得到非还原糖或低还原糖。     

大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究

７３５ｂｐ的ＰＲＬｃＤＮＡ片段从质粒ＰＲＬ－ＳＰ６５＃１中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,筛选出正向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ和反向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＡＳ。将重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬｓ和空载体ｐｃＤＮＡ３分别转入ＮＩＨ３Ｔ３细胞系,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞后与未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２的情况下,用原位杂交的方法,分别用ＰＲＬｃＤＮＡ探针和原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓｃＤＮＡ探针进行检测,未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞也无ＰＲＬ的表达,而转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ的ＮＩＨ３Ｔ３细胞则有大量的ＰＲＬ基因的表达,与对照组相比有显著差异（Ｐ＜０．０１）。正常和转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有一定程度的原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓ的表达,当分别加入Ｅ２和转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ后,ＮＩＨ３Ｔ３细胞中的ｃ－Ｈ－ｒａｓ基因表达水平都显著升高（Ｐ＜０．０５）。     

植物低温诱导蛋白和低温诱导基因的表达调控

对于温带作物而言,耐冷是一种重要的农艺性状,它对作物的安全越冬和生存起决定作用。阐明冷驯化的形成机理无疑对提高作物的耐冻性使之免遭冰冻伤害具重要意义。自从1906年Wiegand提出研究冻害机制的重要性以来,已经发表了数以千计的文章来探讨低温胁迫对植物形态结构和生理     

香蕉束顶病毒基因克隆和序列分析

对香蕉束顶病毒（ＢＢＴＶ）中国分离株ＤＮＡ组份Ｉ（ＤＮＡ－１）、外壳蛋白（ＣＰ）和运转蛋白（ＭＰ）基因进行了克隆和序列分析。ＢＢＴＶＤＮＡ－１含有１１０３个核苷酸,与南太平洋和亚洲分离株分别有８７％－８８％ ９６．９－９８％的核苷酸序列同源性。由ＤＮＡ－１编码的复制酶含有１８６个在酸残基。与南太平洋和亚洲分离株分别有８４．４％－９５．８％和９７．６％、９８．０％的氨基酸序列同源性。外壳蛋白基因由５     

嗜水气单胞菌外毒素和外膜蛋白双基因融合表达载体的构建和高效表达

用基因融合方式 ,以嗜水气单胞菌基因组DNA为模板 ,设计引物通过聚合酶链式反应 (PCR)把去除部分毒性活性编码区的细胞毒肠毒素基因 (act)与去除信号肽的外膜蛋白基因 (OmpTS)连接一起 ,两基因之间插入一个link er(Gly4Ser) 3 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,得到 2 .1kb的双基因融合片段 ,克隆于表达质粒pQE 30中 ,构建了双基因重组表达载体pQE30 /act GS ompTS ,转化大肠杆菌M15 (pREP4 ) ,经IPTG诱导 ,表达出预期大小 (81.0kD)的融合蛋白Act GS OmpTS ,此蛋白占菌体总蛋白的 4 2 %。Westernblot检测结果显示 ,该蛋白与抗Act兔血清和抗OmpTS兔血清都呈阳性反应 ,表明融合蛋白保留了外毒素和外膜蛋白的反应原性 ,为进一步研究此融合蛋白作为疫苗候选成分提供了理论依据     

精子介导鱼类基因转移和聚合酶链反应检测技术

金鱼精子与美洲大绵ｗｅｉ的抗冻蛋白基因一起保温３０分钟后,再与卵子受精,共获得１４５尾成鱼和若干胚胎。从胚胎和成鱼中提取ＤＮＡ经聚合酶链反应（ＰＣＲ法）扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交表明,外源的抗冻蛋白基因进入了部分受体鱼的染色体组内。测定了４５尾一年龄实验鱼中,有１２尾显示出明确的杂交带,阳性率为２６％。     

热休克T细胞中mRNA的表达

 富集的人外周血T淋巴细胞经40—42℃保温(热休克)可诱导产生90kd和71kd的两种主要热休克蛋白(HSP),此外,62和34kd HSP也可在不同条件下诱导。从不同处理的T淋巴细胞中提取mRNA并在免网织细胞裂解液系统中进行体外转译,显示出相同的主要HSP。其中71和62kdHSP不仅在升温时还可在低温(4℃)下诱导,表明淋巴细胞中几种主要HSP的诱导机制不完全相同。比较L-~(35)S-Met参入实验和体外转译的结果提示淋巴细胞中HSP基因表达主要在转录水平调控。     

番木瓜环斑病毒华南强株系cDNA文库的构建及其基因组3''''端区域结构的研究

以λ-ZAPⅡ噬菌体为载体,构建了番木瓜环斑病毒华南强株系(PRV-SM)基因组cDNA文库。以PCR扩增的外壳蛋白(CP)基因为探针筛选出阳性克隆。酶谱和序列分析确定,其中两个阳性克隆除重叠部分外为长达2676个核苷酸的基因组3′端区域。其中包括棱内含体蛋白b(NIb)基因的1607个棱苷酸,CP基因的858个核苷酸和基因组3′端非编码区的211个核苷酸(不包括polyA尾巴)。PRV-SM的NIb含有依赖于RNA的RNA聚合酶的8个特征性保守序列,可能是参与基因组RNA复制的核心亚基。与其他株系比较,NIb的氨基酸变化主要集中在其C端和N端。PRV-SM 3′端非编码区有一段28个核苷酸的正向重复序列,能在其内形成茎环二级结构,并且在各株系间具有高度保守性。NIb,CP和3′端非编码区的总的序列比较表明,SM株系与国外报道的其他株系亲缘关系相对较远。     

双价外壳蛋白基因植物表达载体的构建及马铃薯转基因植株的鉴定

在克隆了马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）、马铃薯Ｙ 病毒（ＰＶＹ）和马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）的外壳蛋白基因的基础上,构建同时包含ＰＶＸ和ＰＶＹ 与ＰＶＹ 和ＰＬＲＶ 两个外壳蛋白基因植物表达框架的表达载体,通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导转化烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ ）和生产上常用的几个马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ）优良品种：“Ｆａｖｏｒｉｔａ”、“虎头”、“克４”。经ＰＣＲ检测证明外源基因已整合到植物的染色体上,得到批量转基因植株。在转ＰＶＸ＋ＰＶＹ 外壳蛋白基因的烟草上接种ＰＶＸ （５ μｇ／ｍ Ｌ）、ＰＶＹ（２０ μｇ／ｍ Ｌ）病毒,得到有一定抗性的植株     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＢＴ－１５２０菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其５’＝末端所在ＨｉｎｄⅢ片段分别为６．８ｋｂ和４．６ｋｂ,它们对应的基因分别命名为ｃｒｙ２１８和ｃｒｙ４．６。经ＰＣＲ鉴定,该菌含有ｃｒｙ１Ａａ、ｃｒｙ１Ａｂ和ｃｒｙ１Ａｃ基因,以及ｃｒｙ２基因,其中ｃｒｙ２１８属于ｃｒｙ１Ａｃ。分析了ｃｒｙ１Ａｃ基因     

细胞分裂素生物合成基因在调节一组烟草病理相关蛋白基因表达中的作用

对一组病理相关蛋白基因在烟草 ( N icotiana tabacum cv. Wisconsin 38)中的表达情况进行了研究 ,包括 :碱性几丁质酶、β- 1 ,3-葡萄糖苷酶、渗透蛋白及伸展蛋白。RNA杂交实验表明在正常烟草植株中上述 4个基因具有发育和器官专一性的表达。在含有细胞分裂素生物合成基因的转基因烟草丛生芽中 ,这 4个基因的表达受过量合成的内源细胞分裂素和载体效应的共同调节 ,细胞分裂素降低这些基因的表达 ,而载体效应则促进它们的表达。热激处理也明显降低这 4种基因的表达水平。上述结果表明这些病理相关蛋白基因具有复杂的调控系统     

烟草花叶病毒外壳蛋白的基因导入和转化烟株的再生

用T-DNA区携有嵌合的烟草花叶病毒外壳蛋白基因和卡那霉素抗性基因(NPTⅡ)的土壤农杆菌株pACK403和pACK404与烟草品种SRl和斯佩特G-28单倍体无菌菌叶碟片进行共培养转化。转化后的叶碟片在含有头孢噻肟钠500毫克/升和卡那霉索300毫克/升的培养基上诱导芽,在含有头孢噻肟钠500毫克/升和卡那霉素100毫克/升的培养基上诱导生根。Nopaline测定,烟草花叶病毒外壳蛋白基因的表达检测、转化烟株对烟草花叶病毒侵染抗性的检测结果证明:用这种方法能可靠地将外源基因导入烟草,并能在转化烟株中表达。再生得到的转化烟株在烟草花叶病毒强感染情况下能延迟病症表现4—25天。