烟草野火病菌的分子遗传

烟草野火病菌的分子遗传赵卫东刘进元（清华大学生物科学与技术系北京１０００８４）烟草野火病是烟草生产上的主要病害之一,由Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔａｂａｃｉ引起,在我国云南等主要烟草栽培地区常年发生,危害十分严重。该病菌从伤口或自然孔口侵入烟草,引起的症状为水渍状圆形褪色斑点,愈合后中心褐色,周围有一圈很宽的黄绿色晕环。在多雨潮湿季节,病害迅速蔓延;干燥后病斑褐色部分枯焦破...     

烟草野火病菌毒素的分子生物学研究进展

本文概述了近１０ 年来围绕烟草野火病菌毒素的合成、调节等分子生物学研究所取得的进展。烟野火毒素的生物活性部为一种二氨基二羧基的氨基酸野火氨酸,野火氨酸单独存在或与苏氨酸或丝氨酸以肽键结合成二肽,野火氨酸的游离羧基与β位氨基以酰胺键结合成β－ 内酰胺环。野火氨酸的合成有ｔａｂＡ,ｔａｂＢ,ｔａｌＡ,ｄａｐＢ等基因参与,受ｌｅｍＡ 基因调控。野火氨酸β－ 内酰胺可在酰基转移酶和β－ 内酰胺酶的作用下失毒。建议尝试转β－ 内酰胺酶基因于烟草以获得转基因抗野火病烟草。     

烟草野火病的发生及综合防治研究进展

烟草野火病是由Pseudomonas syringae pv.tabaci引起的能够危害植株叶片、花、蒴果、种子等部位的细菌性病害,是世界上各主要产烟国普遍发生的细菌性病害,在我国,由于在近些年的烤烟生产中大面积种植不具有抗野火病特性的品种以及种植品种较为单一等原因,使得烟草野火病害的发生与发展日趋严重,逐步成为了影响我国烟草生产发展的一大障碍。本研究较系统地阐述了烟草野火病的发病特点、分类、致病性分化、生理特性、寄主范围、发生规律及综合防治等方面的研究,重点介绍了烟草野火病的病原学研究以及综合治理措施,为烟草野火病综合防治提供重要参考。     

光照或黑暗条件下野火病菌侵染对烟草光合机构的影响

烟草野火病菌(Pst)是一种兼性营养型的细菌致病菌,它可以引起烟草发生褐色病斑,名为野火病.近年来Pst受到很多关注,然而大多数对Pst的研究主要集中在寄主和非寄主植物对Pst侵染的防御机制和产自于野火病菌的野火毒素上,Pst侵染对烟草叶片光合性能的影响及其机理尚未见报道.研究Pst侵染后对光系统Ⅱ(PSⅡ)的影响不仅可以帮助阐明烟草-Pst 相互作用的机制,还可以从生理角度加深对细菌致病菌病害的了解.本研究采用叶绿素荧光快速诱导动力学曲线分析、类囊体膜蛋白Western分析、活性氧(ROS)和叶绿素含量测定等方法,探讨光照(200 μmol·m^-2·s^-1)或黑暗条件下Pst侵染对烟草光系统Ⅱ的影响.结果表明: 与未处理相比,Pst侵染3 d后在光照和黑暗条件下叶片侵染区域叶绿素含量均显著下降,出现萎黄病变,注射区域呈现出明显的野火病特征.光照和黑暗条件下,侵染3 d后烟草叶片过氧化氢含量明显升高,光照条件下要比黑暗条件下升高比例更大.Pst侵染3 d后,光照和黑暗条件下烟草叶片注射区域叶绿素荧光动力学曲线中K点和J点的相对可变荧光W_K和V_J逐渐增大,叶片最大光化学效率(F_v/F_m)和单位面积有活性反应中心的数目(RC/CSm)均显著下降.此外,相对于光照条件,Pst侵染后在黑暗条件下W_K和V_J的升高程度更大,说明对K点和J点的抑制程度更严重.Pst侵染3 d后,在光照和黑暗条件下放氧复合体(OEC)的核心组分PsaO、光系统Ⅱ反应中心核心蛋白D1蛋白均发生明显的降解,且在黑暗条件下降解更为严重.表明Pst侵染后,在光照和黑暗条件下均会使光合电子传递链Q_A到Q_B的电子传递受到限制,放氧复合体受到伤害,烟草叶片光系统Ⅱ供体侧、受体侧、反应中心的数目和活性均受到伤害,光系统Ⅱ发生光抑制或类似光抑制的伤害,且在黑暗条件下对光系统Ⅱ的伤害程度比光照条件下更为严重.     

大豆灰斑病菌毒素的分离与提取*

用不同极性的有机溶剂均未萃取到具有致病组分的化合物。但用甲醇、乙醇、丙醇和硫酸铵等两种沉淀大分子物质的方法,却提取到了使大豆叶片产生典型病斑和致萎的化合物。该粗提物能引起大豆感病品种产生典型的蛙眼形病斑,由此可以肯定从培养滤液中提取的粗提物含有大豆灰斑病菌所产生的毒素。以二倍体积的甲醇来提取大豆灰斑病菌毒素是最为简单、快速的方法。     

大豆灰斑病菌毒素的分离与提取

用不同极性的有机溶剂均未萃取到具有致病组分的化合物。但用甲醇、乙醇、丙醇和硫酸铵等两种沉淀大分子物质的方法,却提取到了使大豆叶片产生典型病斑和致萎的化合物。该粗提物能引起大豆感病品种产生典型的蛙眼形病斑,由此可以肯定从培养滤液中提取的粗提物含有大豆灰斑病菌所产生的毒素。以二倍体积的甲醇来提取大豆灰斑病菌毒素是最为简单、快速的方法。     

拮抗菌群对烟草野火病的防治效果及叶际微生物群落多样性的影响

【背景】烟草野火病(Tobacco Wild Fire)是烟草上的主要病害之一,利用拮抗菌防治烟草野火病是具有较好前景的防治手段。【目的】分析烟草叶际微生物群落结构组成和多样性,阐释拮抗菌群施用对烟草野火病的防治效果及对叶际微生物群落的影响。【方法】在烟草上施用3种拮抗菌群,采用16Sr RNA基因高通量测序及生物信息学手段,分析拮抗菌群对烟草叶际微生物群落结构组成和多样性的影响,研究拮抗菌群在叶片上的定殖。【结果】拮抗菌群对烟草野火病的防治效果达到50.44%-68.58%。与对照相比,3种拮抗菌群处理叶际微生物群落结构和组成都产生了明显的变化,群落多样性显著增高。拮抗菌群处理后,烟草叶际微生物泛菌(Pantoea)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和假单胞菌(Pseudomonas)等菌属所占比例发生显著变化,其中芽孢杆菌属(Bacillus)和寡养单胞菌属相比对照增加分别达到3.9倍和7.02倍,其丰度与病情指数显著负相关。【结论】拮抗菌群对烟草野火病有较好的防治效果,施用拮抗菌群显著影响叶际微生物群落的组成和多样性,假单孢杆菌和寡养单胞菌等优势菌属能够在烟草叶际定殖,起到防治烟草野火病的作用。     

烟草野火病毒素的抗性基因的克隆及序列分析

在云南省玉溪、嵩明等地感染烟草野火病的病株上,分离到致病力不同的烟草野火病病原菌,分别提取致病力较强菌株和较弱菌株的染色体为模板,设计和合成烟草野火病毒素的抗性基因（ｔｒ）功能片段两端的引物,扩增出强毒株与弱毒株的５５４ｂｐ片段,与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌,提取筛选的阳性克隆子的质粒,酶切分析证实为５５４ｂｐ的片段。进一步测定强毒株与弱毒株两片段的ＤＮＡ序列,分析表明两菌株的克隆片段ＤＮＡ序列无差异,且与文献报道的ｔｒ序列完全一致,说明ｔｒ的序列与菌株的毒力强弱无关     

接种马铃薯软腐病菌引起的烟草叶片O-·2爆发

用马铃薯软腐病菌处理烟草后,以化学法测定了叶片中O-2含量,发现在接种后1～14 h内只出现一次O-2爆发,不同于以往植物悬浮细胞研究中出现的两次爆发结果.接种软腐病菌后2 h和6 h烟草叶片O-2的电子自旋共振波谱图(electron spin resonance,ESR)显示了同样的一次O-2爆发结果.接种后烟草叶片的线粒体和叶绿体O-2爆发与叶片的同步,显示此两种细胞器参与烟草叶片在软腐病菌作用下的O-2发生.无光照叶绿体O-2的ESR谱线不出现,表明叶绿体O-2可能来源于光合电子传递链.马铃薯软腐病菌作用下烟草叶片的O-2爆发是多位点的.     

接种马铃薯软腐病菌引起的烟草叶片爆发

用马铃薯软腐病菌处理烟草后,以化学法测定了叶片中O-2含量,发现在接种后1～14 h内只出现一次O-2爆发,不同于以往植物悬浮细胞研究中出现的两次爆发结果.接种软腐病菌后2 h和6 h烟草叶片O-2的电子自旋共振波谱图(electron spin resonance,ESR)显示了同样的一次O-2爆发结果.接种后烟草叶片的线粒体和叶绿体O-2爆发与叶片的同步,显示此两种细胞器参与烟草叶片在软腐病菌作用下的O-2发生.无光照叶绿体O-2的ESR谱线不出现,表明叶绿体O-2可能来源于光合电子传递链.马铃薯软腐病菌作用下烟草叶片的O-2爆发是多位点的.     

烟草青枯病研究进展

烟草青枯病是由茄青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的影响世界烟草生产的重要病害之一,该病是一种典型的土传性细菌病害。主要对烟草青枯病菌的致病机理、遗传多样性和防治等方面的研究进展进行综述,阐明烟草青枯病菌的研究现状。     

L型氨基酸对烟草赤星病菌毒素毒性的影响

为确定不同氨基酸对烟草赤星病菌产生的毒素毒性的影响,作者采用摩擦接种处理法、浇根处理法、种子根处理法三种生物测定方法,确定了以烟草种子根处理法作为烟草赤星病菌的毒性测定方法。用12种氨基酸分别以5种不同浓度与AT毒素混合接种,根长测定结果表明：L-谷氨酰胺,L-天冬酰胺,L-组氨酸所有供试浓度均增强病原菌毒素的毒性,而其余9种L型氨基酸对烟草赤星病菌GL-6产生的毒素有抑制作用,其中L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸适宜浓度可明显降低供试病原菌毒素对烟草的致病性,与对照差异极显著,其有效浓度分别为0．02mg／ml、0．02mg／ml、0．02～2mg／ml。     

不同化合物对烟草赤星病菌毒素的钝化研究

为确定几种不同化合物对烟草赤星病菌产生的毒素毒性的影响,作者采用摩擦接种处理法、浇根处理法、种子根处理法3种生物测定方法,确定了以烟草种子根处理法作为烟草赤星病菌的毒性测定方法。用6种化合物分别以5种不同浓度与AT毒素混合接种,根长测定结果表明：氯化铁、硫酸亚铁、硫酸锰和柠檬酸在0．02—20mg/mL浓度范围内、钼酸钠在0．02—2mg/mL浓度范围内对对烟草赤星病菌毒素有明显钝化作用;所有处理中钼酸钠0．02mg/mL、柠檬酸0．02mg/mL浓度处理效果最好,其次为钼酸钠0．2mg／mL处理浓度。     

接触识别导误与烟草抗赤星病诱导的关系

用非病原细菌、病毒和赤星菌弱毒株先对烟草作预处理,后在未诱导叶片上接种赤星菌毒性菌株,发现诱导处理可引起病菌7类侵染前行为失误:①孢子萌发延迟;②持续产孢;③孢子、芽管产生粘联物(adhesin)的能力降低或丧失;④芽管背离叶片生长;⑤芽管顶端膨大、侵染能力降低或丧失;③芽管盘附在叶面上,但侵染能力降低或丧失;⑦芽管弯曲生长,顶部液泡化或原生质流空.这些行为导误与赤星菌致病力的诱导减弱有关,使烟草发病程度减轻55—94%.分析认为,病菌侵染前行为导误取决于接触识别导误,是烟草抗赤星病诱导的一种有效反应.     

稻曲病菌毒素的活性测定、抗体制备与细胞定位

稻曲病菌在PD 液体培养基中生长良好,并能产生对植物细胞具有高度生物抑制活性的毒素。生物学活性测定袁明,用100%的甲醇能提取稻曲病菌液体培养物中的粗毒素。粗毒素对小麦胚根胚芽的生长有强烈的抑制作用。把毒素主要成分Ustiloxin A 和BSA 偶联后,制备了抗血清,ELISA 检测表明用两种偶联剂偶联所制备的抗体效价分别为1∶20000和1∶6000。进一步的免疫胶体金标记分析表明,所制备的抗体能与茼丝中分泌的毒素特异性结合,说明所获得的抗体是特异性的。     

壳寡糖诱导植物抗性相关基因mRNA差别显示分析

壳寡糖是一种天然的信号分子,可以诱导植物产生各种防御反应。该文利用mRNA显示技术。研究壳寡糖引起的植物抗性相关基因的变化。以50mg/l壳寡糖喷洒的烟草叶片为材料,分别提取处理8h、7d和对照的叶片总RNA,利用一个锚定引物和三个随机引物组合,通过mRNA差别显示技术共获得壳寡糖处理后发生变化的8h差别条带22条,7d后的差别条带为74条。将壳寡糖处理8h得到的17条差别条带克隆到载体上后,进行反向Northern鉴定,有6条可能为真实条带。测序结果表明：其中一条差别片段与烟草热激蛋白90基因具有97％的核苷酸同源性。说明50mg/l壳寡糖处理的烟草叶片在mRNA水平上发生了明显的变化,烟草的热激蛋白90基因可能参与到壳寡糖诱导的抗性信号传导通路中。     

辣椒炭疽病菌毒素

辣椒炭疽病菌（辣椒刺盘孢Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ）在２５－２８℃的Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ培养液中振荡培养时分泌出毒素,这种毒素能引起辣椒叶片形成坏死斑,类似于病原菌侵染形成的症状。辣椒叶煎汁培养液和Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ培养液适于Ｃ．ｃａｐｓｉｃｉ的生长和产毒,生长适宜温度和范围分别为２５℃和ｐＨ６－７,在２５－２８℃,ｐＨ６－７的条件下培养滤液毒性最强;光线和通气条件可促进Ｃ．ｃ     

转GhB301基因烟草的防御酶活性及抗病相关基因表达分析

为了明确棉花ERF-B3亚族转录因子基因GhB301在烟草异位表达后(抗枯萎病中)的功能,该研究以过表达GhB301基因烟草和野生型烟草为材料,采用枯萎病菌孢子悬浮液接菌方法,分析病原菌侵染前后防御酶活性变化以及防卫相关基因的表达变化与抗病性的关系。结果显示:(1)棉花枯萎病菌处理15d后,2个转基因株系烟草叶片黄化程度与野生型相比较轻。(2)棉花枯萎病菌处理后,过表达GhB301转基因烟草和野生型烟草叶片过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)的活性较未接菌对照显著提高,并且酶活峰值出现均早于野生型材料;转基因材料叶片的POD、PAL、PPO活性均在处理3d后达到峰值,而野生型材料叶片的POD、PAL活性在处理5d后才达到峰值。(3)接种棉花枯萎病菌后活性氧相关基因、乙烯(ET)/茉莉酸(JA)途径相关基因、病程相关基因的表达量在转基因株系OE1和OE2中均受到明显影响。研究推测,GhB301在烟草中的异位表达激活了防卫相关基因的表达,提高了防御酶的活性,从而增强了烟草对枯萎病菌的抗性。     

稻曲病菌毒素的活性测定、抗体制备与细胞定位

稻曲病菌在PD液体培养基中生长良好,并能产生对植物细胞具有高度生物抑制活性的毒素。生物学活性测定表明,用100％的甲醇能提取稻曲病菌液体培养物中的粗毒素。粗毒素对小麦胚根胚芽的生长有强烈的抑制作用。把毒素主要成分Ustiloxin A和BSA偶联后,制备了抗血清,ELISA检测表明用两种偶联剂偶联所制备的抗体效价分别为1：20000和1：6000。进一步的免疫胶体金标记分析表明,所制备的抗体能与茵丝中分泌的毒素特异性结合,说明所获得的抗体是特异性的。     

大豆灰斑病菌毒素产生条件的研究

大豆灰斑病作为一种世界性的真菌病害,受到国内外植物病理学家与遗传育种界的普遍关注并开展了大量的研究（李海英等,１９９８;杨庆凯等,１９８８）,而有关大豆灰斑病菌毒素的研究国内外报道极少。我所曾利用固体培养基提取毒素（陈绍江等,１９９８）,但由于固体培养基的成分、ＰＨ值、菌丝生长量等难以控制和测定,增加了毒素提纯过程的难度。本试验对大豆灰斑病在液体培养基中毒素产生条件进行了研究,旨在为进一步深人研究该毒素理化特性、致病组分,揭示大豆灰斑病菌的致病机理并利用毒素进行抗原筛选等打下基础。１材料与方法１…