空泡膜类型H+-ATPase的研究进展

真核细胞内空泡细胞器,如高尔基体、内质网、溶酶体等,膜上存在的质子泵ATPase 与线粒体类型的质子泵 ATPase 类似.近几年对该类型 H⁺-ATPase 的结构、作用机制进行了深入的研究,证明这是一类新型质子泵,在进化的过程中与线粒体类型的 H⁺-ATPase 有密切的亲缘关系.     

大豆液泡膜H+-ATPase功能与构象关系的初步研究

大豆液泡膜V型H⁺-ATPase是ATPases中的一种,它在植物细胞的生长发育中有重要的作用.利用竹红菌乙素(HB）和KI这两种分别猝灭蛋白质疏水区域内源荧光和亲水区域内源荧光的荧光猝灭剂,在不同pH值、温度条件下对纯化的大豆液泡膜V型ATPase进行荧光猝灭实验,初步探讨了V型H⁺-ATPase的水解活性同其蛋白质折叠状态间的关系.研究表明,通过比较不同pH值、温度条件下蛋白质疏水区域和亲水区域内源荧光的荧光猝灭常数（K_SV）,发现当环境pH值、温度偏离酶的最适pH值和温度时,蛋白质的内源荧光强度降低且疏水区域和亲水区域内源荧光的荧光猝灭常数（K_SV）降低,说明伴随着酶的水解活性降低,蛋白质的折叠状态发生了变化.我们认为蛋白质在膜内的折叠状态变化是酶失活机制的一个重要方面,为植物的抗冻和抗盐研究提供了一定的参考.     

胡杨质膜的纯化及其H＋-ATPase活性的研究

用Dextran T-500, PEG 3350两相分配法分离并纯化了悬浮培养的胡杨细胞质膜.不同聚合物浓度(5.5%、5.7%、5.9%、6.1%、6.3%、6.5%)和KCl浓度(0、5、10、15 mmol/L)对分离效果影响的研究结果表明, 采用聚合物浓度为5.9%和无盐存在的两相分配体系可获得纯度较高的胡杨细胞质膜.纯化的质膜H^＋-ATPase的活力提高8倍,且酶定向程度较高,这为进一步研究胡杨细胞质膜特性及获得高纯度H^＋-ATPase提供了良好基础.     

大豆下胚轴质膜H+-ATPase质子转运的测定

以大豆下胚轴为材料,采用改进的匀浆介质,通过两相法制得具有质子转运活力的高纯度质膜微囊.并且发现冻融处理可以促进质膜微囊的翻转而提高荧光猝灭效率.质子载体和质子转运特性分析表明,由Mg^2＋-ATP引发的荧光猝灭可以被质子载体CCCP恢复,并被质子通道抑制剂DCCD抑制;并且发现质膜H^＋-ATPase专一抑制剂钒酸钠可以完全抑制荧光猝灭,同时发现荧光猝灭依赖于Mg^2＋,并受K^＋刺激,最适pH为6.5.以上证明所测荧光猝灭是由质膜H^＋-ATPase所进行的质子转运引起的.结果同时表明,维持H^＋-ATPase合适构象和提高质膜微囊封闭性是制备具有H^＋转运活力质膜微囊的两个关键因素.     

灵武长枣果实质膜和液泡膜H~+-ATPase和H~+-PPase活性与果实糖分积累

以不同发育时期灵武长枣(Ziziphus jujuba cv.Lingwuchangzao)的果实为材料,通过测定与分析果肉组织中细胞质膜、液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性、果实糖分含量变化,研究了灵武长枣果实质膜、液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性与糖积累特性的关系。结果表明:(1)果实第二次快速生长期之前主要积累葡萄糖和果糖,之后果实迅速积累蔗糖,葡萄糖和果糖含量则逐渐下降,成熟期果实主要积累蔗糖。(2)在果实发育的缓慢生长期S1,质膜H+-ATPase活性最低;第一次快速生长期,质膜H+-ATPase活性最高;缓慢生长期S2,其活性降低;第二次快速生长期,质膜H+-ATPase活性升至次高;完熟期,质膜H+-ATPase活性下降幅度较大。(3)在果实发育过程中,液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性的变化趋势相似。缓慢生长期S1,液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性较低;从缓慢生长期S1至第一次快速生长期缓慢下降至最低;从第一次快速生长期开始,液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性呈现为逐渐增高的变化趋势;除第二次快速生长期以外,液泡膜H+-PPase活性始终高于H+-ATPase。由此推测,质膜H+-ATPase和液泡膜H+-ATPase、H+-PPase对灵武长枣果实糖分的跨膜次级转运起到重要的调控作用。     

关于吖啶橙测定溶酶体H＋－ATPase转运H＋的研究

揭示了吖啶橙的吸收光谱和荧光光谱对其浓度依赖性上的区域性特征,分析了测定溶酶体H^＋转运时合理选用吖啶橙浓度及溶酶体用量的重要性、机理和原则,探讨了其与溶酶体的温育时间和K^＋／H^＋交换对测定H^＋转运的明显影响.     

Na+/H+逆向转运蛋白和植物耐盐性

Na⁺H⁺逆向转运蛋白对植物耐盐起着重要作用 ,它利用质膜H⁺ATPase或液泡膜H⁺ATPase及Ppiase泵H+产生的驱动力把Na⁺排出细胞或在液泡中区隔化以消除Na⁺的毒害。主要讨论植物中Na⁺H⁺逆向转运蛋白研究在分子水平的最新进展.     

大鼠前脂细胞质膜Na+/H+交换同时参与细胞的增殖和分化

以原代培养的大鼠前脂细胞为模型 ,以 2′ ,7′ bis ( 2 carboxyethyl) 5 ( 6 ) carboxyfluorescein (BCECF)作为检测胞内pH(pHi)的荧光探针 ,测定不同生长因子刺激下胞内pH的变化 ,证明大鼠肾周前脂细胞质膜存在Na⁺/H⁺交换活性 ,胎牛血清(FCS)能快速激活Na⁺/H⁺交换 ,导致pHi升高 (约 0 .2pH单位 ) ,并引起DNA合成 .Ethyl isopropyl amiloride (EIPA)抑制Na⁺/H⁺交换与DNA合成 .在无血清条件下 ,胰岛素不刺激DNA合成但引起细胞分化 ,表现为胞内脂滴积累和 3 磷酸 甘油脱氢酶(G₃ PDH酶 )活性增强 ,同时激活Na⁺/H⁺交换活性导致pHi升高 ;EIPA既抑制胰岛素对Na⁺/H⁺交换的激活 ,也抑制G₃ PDH酶活性增强 .结果证明 :Na⁺/H⁺交换的激活不仅与大鼠前脂细胞增殖相关 ,同时也是细胞分化的早期事件 .     

刚毛柽柳液泡膜H~+-PPase基因的克隆与胁迫下的表达分析

通过对刚毛柽柳转录组分析,鉴定获得1个液泡膜H~+-PPase基因的cDNA序列,命名为ThVP1。该cDNA序列全长3 022bp,开放阅读框为2 298bp,编码765个氨基酸,编码蛋白相对分子质量80.37kD,理论等电点5.25。ThVP1编码蛋白的疏水性较强,含有13个跨膜区。氨基酸多序列比对结果显示,ThVP1具有典型的液泡膜H~+-PPase家族3个高度保守片段(CS1、CS2和CS3),与大豆VP1氨基酸序列一致性最高,为93%。系统进化分析表明,ThVP1属于I型液泡膜H~+-PPase基因。实时荧光定量RT-PCR分析显示,NaCl和PEG胁迫下,ThVP1在柽柳根和叶中均呈现明显上调表达,表达量最高达到对照的20.9倍,暗示ThVP1可能在刚毛柽柳抗旱耐盐过程中发挥重要作用。     

长叶红砂液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆及表达特性

为研究长叶红砂(Reaumuria trigyna)离子转运分子机制,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX1)的全长cDNA片段,命名为RtNHX1(NCBI序列号为KR919802)。结果表明:RtNHX1的cDNA片段全长2 622bp,开放阅读框1 662bp,5′非编码区509bp,3′非编码区451bp,编码553个氨基酸,推测分子量为60.91kD。该蛋白含有12个跨膜结构域,为疏水蛋白,与其他植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX1的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR对其在NaCl胁迫下的表达检测显示,不同时间和不同浓度NaCl胁迫下,RtNHX1表达量变化均呈先升高后降低趋势,在100mmol/L NaCl胁迫6h和200mmol/L NaCl胁迫后达到最高,表达量分别超过或约是对照的3倍,一定程度反应出RtNHX1参与长叶红砂的盐胁迫应答,是该植物离子转运体系的重要元件。     

Studies on the Proton Pumping Activity of H+-ATPase in Tonoplast Vesicles of Populus euphratica

Tonoplast-enriched vesicles were prepared from suspension-cultured Populus euphratica Oliv. cells by differential centrifugation and discontinuous sucrose density gradient centrifugation. The properties of the proton pumping activity of H+-ATPases in tonoplast vesicles were studied by acridine orange fluorescent quenching measured at 22 ℃. The proton pumping activity of ATPase was ATP-dependent with apparent Michaelis-Menten Constant (Km) for ATP about 0.65 mmol/L. The optimal pH for H+-ATPases activity was 7.5. The proton pumping activity of H+-ATPase could be initiated by some divalent cations, Mg2+ being highly efficient, much more than Fe2+; and Ca2+, Cu2+ and Zn2+ were inefficient under the experimental condition. The proton translocation could be stimulated by halide anions, with potencies decreasing in the order Cl-> Br->I->F-. The proton pumping activity was greatly inhibited by N-ethylmaleimide (NEM), N,N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCCD), NO-3 and Bafilomycin A1, but not by orthovanadate and azide. These results demonstrated that the H+-ATPase in the tonoplast of Populus euphratica belonged to vacuolar type ATPase. This work was the first time that tonoplast-enriched vesicles were isolated from Populus euphratica cells.     

Effects of Salt Stress on the Activity and the Amount of Tonoplast H+-ATPase from Pea Roots

To study the function and adaptive mechanism of tonoplast H+ATPase under salt stress, pea ( Pisum sativum L.) seedlings were treated with different concentrations of salt （100-250 mmol/L NaCl） and with 100 mmol/L NaCl for different days (1-3 d). The ATP hydrolytic activity and the proton transport activity and the changes of the amount of tonoplast H+ ATPase (subunit A) were measured. ATP hydrolytic activity of H+ATPase prepared from plants treated with 250 mmol/L NaCl was reduced by about 25% compared to that of control plants, but that of stressed plants treated with 100 mmol/L and 200 mmol/L NaCl was unchanged. The activity from plants treated with 100 mmol/L NaCl for up to 3 d was lower than that of control plants by 20%. But the proton transport activity was increased under the same salt stresses as above. These results showed that the changes of the hydrolytic activity and the proton transport activity were not in proportion and salt stress may cause the change of the coupling ratio of H+ transport activity to ATP hydrolysis. The protein amount kept unchanged and reduced a little only when pea was treated with 100 mmol/L NaCl for 3 d. These results indicated that salinity stimulated the increase of the pump efficiency of the V-ATPase from pea roots, which was due to the change of the coupling ratio, but not due to the increase of ATP hydrolysis and the amount of V-ATPase.     

胡杨液泡膜微囊H^＋—ATPase质子泵活性研究

将悬浮培养的胡杨 (PopuluseuphraticaOliv .)细胞捣碎后 ,通过差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心获得富集液泡膜的膜微囊。通过连续监测吖啶橙的荧光淬灭研究膜微囊上H _ATPase的质子转运特性。结果表明 ,质子转运依赖于ATP ,其表观米氏常数Km 值为 0 .6 5mmol/L。质子泵活性受pH和温度的影响较大。测定液pH值为7.5时 ,质子泵的活性最高 (测定温度选定为 2 2℃ )。一些二价阳离子可启动H _ATPase的质子转运 ,其中Mg2 的作用远高于Fe2 。在实验条件下 ,Ca2 、Cu2 和Zn2 均不能启动H _ATPase的质子转运。质子跨膜转运还可被一价阴离子激活 ,激活作用的顺序为 :Cl->Br->I->F-。质子泵活性受NEM(乙基马来酰亚胺 )、DCCD (二环己基碳二亚胺 )、NO-3 和BafilomycinA1的强烈抑制 ,但对Na3VO4 和NaN3 不敏感。这些性质说明胡杨液泡膜微囊上的H _ATPase属于囊泡型的ATPase。     

盐胁迫对豌豆根液泡膜H^＋—ATPase活性及含量的影响

为了阐明液泡膜H^ -ATPase在盐胁迫下的作用和适应性调节机制,对豌豆（Pisum sativum L.）植株进行不同盐浓度和不同盐胁迫时间（1－3d）的处理后,分别测定液泡膜H^ -ATPase的H^ 转运活性、水解性和蛋白含量（A亚基）的变化。结果表明,100mmol/L和200mmol/L NaCl 处理1dH^ -ATPase的水解活性没有变化,而250mmol/L NaCl处理1d引起水解活性降低约25％。100mmol/L NaCl处理2d内水解活性没有变化,而第3天活性下降约20％。但是上述盐胁迫均能提高液泡膜H^ -ATPase的质子转运活性,说明盐胁迫后H^ -ATPase的水解活性和质子转运活性的变化不成比例,盐胁迫可能导致偶联比率的改变。Western blot研究发现,上述盐胁迫对液泡膜H^ -ATPase（A亚基）的含量基本无影响,仅100mmol/L NaCl处理3d后A亚基的量略有下降,这些结果证明,盐胁迫能刺激提高豌豆根液泡膜H^ -ATPase的H^ 泵效率,且泵效率的提高是源于偶联比率的改变,而不是由于ATP水解活性的提高和蛋白含量的增加。     

Selective Reconstitution of the Tonoplast H+-ATPase of the Crassulacean-Acid Metabolism Plant Kalanchoë daigremontiana

IA detergent removal technique was used to reconstitute solubilized tonoplast proteins of mesophyll cells of the CAM plant Kalanchoë daigremontiana into phosphatidylcholine liposomes. The proteoliposomes were able to hydrolyse ATP and to pump protons across the vesicle membrane. Both activities were inhibited by nitrate, an inhibitor of V-type ATPases. Freeze-fracture micrographs confirmed the incorporation of membrane proteins into liposomes. Increase of specific ATP-hydrolysis activity compared to solubilized tonoplast proteins and SDS-PAGE analysis of reconstituted proteins in comparison with the polypeptide pattern of the purified tonoplast H⁺-ATPase from the same plant source indicated a highly selective reconstitution of the tonoplast H⁺-ATPase.     

NaCl胁迫下大麦根液泡膜H+-ATPase活性、离子吸收与钙的关系

NaCl胁迫2 d,耐盐大麦(Hordeum vulgare L.cv) ("滩引2号")根系液泡膜H+-ATPase活性增强,H+-PPase活性下降.以质膜Ca2+通道抑制剂La3+ (1 mmol/L)或Ca2+螯合剂EGTA (5 mmol/L)处理大麦幼苗,抑制了NaCl诱导的液泡膜H+-ATPase活性的增强,但提高了H+-PPase活性;用CaM拮抗剂三氟拉嗪(TFP,20 μmol/L)处理,也抑制了液泡膜H+-ATPase活性的增强.NaCl胁迫下,外加La3+,TFP或La3++TFP处理,使Na+吸收增加,K+和Ca2+吸收降低.结果表明,NaCl胁迫下,液泡膜H+-ATPase活性提高和离子吸收的变化可能与Ca-CaM系统有关.     

水稻幼苗根细胞质膜和液泡膜微囊Ca2+-ATP酶的特性

水稻幼苗根质膜和液泡膜Ca2 -ATP酶对ATP的Km值分别为7.1和4.5 μ mol·L-1;反应的最适pH分别为8.0和7.0.两者活性均受Na3VO4和曙红B(EB)抑制;CPZ抑制质膜Ca2 -ATP酶活性,但促进液泡膜Ca2 -ATP酶活性.30mmol·L-1CaCl2浸种和CaCl2浸种结合低温锻炼预处理,均可提高此酶的活性和冷稳定性.     

等渗盐胁迫对番茄抗氧化酶和ATP酶及焦磷酸酶活性的影响

用Ca(NO3)2 80 mmol/L和NaCl 120 mmol/L等渗溶液处理番茄幼苗后,细胞质和叶绿体中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性升高,并且NaCl胁迫的作用明显高于Ca(NO3)2胁迫.Ca(NO3)2处理提高了线粒体中SOD、CAT、APX的活性,而NaCl处理降低了它们的活性.根系质膜H -ATPase、液泡膜H -ATPase、焦磷酸酶(H -PPase)的活性和叶片丙二醛(MDA)及脯氨酸含量在两种盐胁迫后明显增加.NaCl处理对植株生长的抑制程度明显高于Ca(NO3)2处理.     

NaCl胁迫下大麦根系液泡膜H+-ATP酶活性受ATP和焦磷酸含量的调节

选用两个耐盐性强弱不同的大麦(Hordeumvulgare L.)品种,研究了NaCl胁迫下其幼苗根中ATP和焦磷酸(PPi)含量的变化以及PPi对液泡膜H -ATP酶活性的影响.结果表明:在含NaCl 200mmol/L的1/2 Hoagland溶液中处理2 d,耐盐品种(滩引2号)根中液泡膜H -ATP酶活性增加,然后逐渐下降,而H -PPi酶活性在NaCl处理9 d中'直下降.盐敏感品种(科品7号)在NaCl胁迫下根中H -ATP酶和H -PPi酶活性都下降(图1).与对照相比较,NaCl胁迫下耐盐品种根中ATP含量2 d时增加,4 d后下降;盐敏感品种根中ATP积累受NaCl胁迫的抑制(图2).NaCl胁迫下,两品种的PPi含量皆略有增加(图3).PPi对液泡膜H -ATP酶活性有竞争性抑制作用(图4).结果表明:ATP积累是NaCl胁迫下液泡膜H -ATP酶活性增加的原因之一,NaCl胁迫下大麦品种根中ATP含量下降和PPi对液泡膜H -ATP酶的抑制使该酶活性下降.     

NaCl胁迫下大麦根系液泡膜H+-ATPase活性与膜流动性的关系

用50～200 mmol/L NaCl处理2 d后,大麦(Hordeum vulgare L.)品种"滩引2号"(耐盐性强)根的液泡膜H+-ATPase活性增强,600 mmol/L NaCl处理下酶活性下降;"科品7号"(耐盐性弱)在50～100 mmol/L NaCl处理2 d后根的液泡膜H+-ATPase活性增强,200～600 mmol/L NaCl处理下酶活性随盐浓度增加而降低.50～200 mmol/L NaCl处理下"滩引2号"根的液泡膜流动性下降,600 mmol/L NaCl处理下膜流动性明显增大;盐胁迫下液泡膜膜脂脂肪酸不饱和度下降时,膜流动性下降,反之则膜流动性上升.由此推断高盐胁迫下液泡膜膜脂脂肪酸不饱和度上升而引起膜流动性上升可能是引起H+-ATPase活性下降的原因之一.