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PCR产物直接测序还是克隆测序?——密叶杉属rDNA ITS序列的测定方法 总被引:7,自引:0,他引:7
通过PCR产物直接测序和克隆测序对三种密叶杉属 (Athrotaxis)植物rDNA内转录间隔区 (ITS)及5 .8SrDNA序列进行了测定与分析。实验表明A .selaginoidesrDNA重复序列间的纯合程度很高 ,对PCR产物直接测序就可以测定其ITS区序列。而A .laxifolia、A .cupressoides的ITS1重复序列间的纯合程度较低 ,各重复单位间序列存在插入 /缺失 ,只有对PCR产物进行克隆测序才能确定其序列。A .laxi folia、A .cupressoides的ITS2区尽管也存在多态性 ,但不同重复序列的浓度比较平均 ,对PCR产物直接测序就可确定重复序列间的变异情况。本实验表明尽管是同一属的三种植物 ,但其rDNA重复序列间的纯合程度不同 ,同一植物ITS的不同区域 ,其重复序列间的纯合程度也不同 ,针对不同的ITS片段可采用不同的方法以测定其序列。 相似文献
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基于核rDNA的ITS序列在种子植物系统发育研究中的应用 总被引:18,自引:0,他引:18
种子植物核rDNA是高度重复的串联序列,由于同步进化的力量.大多数物种中这些重复单位间已发生纯合或接近纯合。5.8S rDNA把核rDNA的内转录间隔区分为ITS1和ITS2两部分.在被子植物中ITS1的长度为165~298bp,ITS2的长度为177~266bp,而在裸子植物中ITS片段较长。且其长度变化主要由ITS1的长度变异所致。可对这两个片段PCR产物进行直接测序或克隆测序。由于ITS序列变异较快.能够提供较丰富的变异位点和信息位点,已成为被子植物较低分类阶元的系统发育和分类研究中的重要分子标记,为探讨多倍体复合体网状进化关系,异源多倍体的起源提供了重要的系统学信息.但它一般不适合科以上水平的系统学研究。裸子植物中ITS片段较长,重复序列间的纯合程度不同,测序比较困难.因此对探讨裸子植物系统发育和分类受到了一定的限制,但近年来有所发展。 相似文献
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核rDNA的ITS序列在被子植物系统与进化研究中的应用 总被引:100,自引:0,他引:100
被子植物与其它高等真核生物相似,核rDNA是高度重复的串联序列。由于同步进化的力量,绝
大多数物种中这些重复单位间已发生纯合或接近纯合。核rDNA的内转录间隔区(ITS)包含被5.8S
rDNA所分隔的ITS1和ITS2两个片段,ITSl的长度为187~298bp,ITS2为187~252bp,经PCR扩
增后可以方便地对这两个片段进行直接测序或克隆测序。ITS序列变异较快,可以提供较丰富的变异
位点和信息位点,已证实它是研究许多被子植物类群系统与进化的重要分子标记,不仅可用于解决科、
亚科、族、属、组内的系统发育和分类问题,而且可用于重建多倍体复合体的网状进化关系,探讨异源多倍体的起源过程,然而,正是由于ITS序列变异较快,它一般不适于科以上水平的系统发育研究。 相似文献
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甜菜银叶病菌的PCR检测 总被引:5,自引:0,他引:5
本研究用16S23S rDNA间的ITS 序列通用引物L1(5′AGTCGTAACAAGGTAGCCGT3′)和L2 (5′ GTGCCAAGGCATCCACC3)扩增甜菜银叶病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv. betae,Cfb)和其它相近细菌的基因组DNA;并对其PCR产物进行回收、克隆和测序,将所获序列和其它已报道的细菌内源转录间隔区(Internally Transcribed Spacer,ITS)序列进行多重比较后设计出Cfb的特异性引物B1(5′GGCCTCGTGTTGTCCCTTATC3′)和B2 (5′GTCACCAATCAACAACCCGAG3′)。此引物可以从Cfb中扩增出387bp 的特异性片段,而其余参试的21个细菌PCR反应结果均为阴性。该方法可以应用于病害防治工作中的Cfb快速、可靠的检测。 相似文献
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对来源于兰州和上海两市的两株腮腺炎病毒野毒的小疏水蛋白(SH)基因及其旁侧区cDNA的PCR扩增产物,分别进行直接测序和克隆测序。用直接测序法测定2株腮腺炎野毒378个核苷酸序列,在此范围内存在16个核苷酸(4.2%)差异,其中11个(2.9%)位于编码区序列中,所推导的SH蛋白序列有6个氨基酸(10.5%)差异。克隆测序法测定的这两株腮腺炎野毒的核苷酸序列相当于直接法的78-378位核苷酸。两处 相似文献
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PCR产物直接测序技术中影响因素的研究 总被引:7,自引:0,他引:7
探讨了PCR产物直接测序技术中的影响因素,结果表明:PCR产物特异性是影响其测序成败的关键因素,PCR反应只有产生惟一扩增产物时,其产物才能被用来直接测序;PCR反应体系残留混合物(dNTP、引物和盐离子等)对其测序质量有明显不利影响,PCR产物纯化后其测序质量能明显提高;同时,PCR产物大小不同,其测序反应的模板用量也不同,在一定长度范围内,最适模板用量随PCR产物长度增加而增加。
Factors that Influence Direct Sequencing of PCR Products
XU Zu-yuan1,2,BAO Qi-yu1,NIU Yu-xin1
1.Beijing Genomics Institute / Human Genome Center,Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China;
2.Jingzhou Teachers College,Jingzhou,Hubei 434104,China
Abstract:Factors influenced direct sequencing of PCR (polymerase chain reaction) products were investigated in this paper.It showed that the specialization of PCR products played a key role in their sequencing reactions and only which could be sequenced directly.It also showed that the PCR reaction residues (including dNTP,primers,and metal ion) affected badly on the sequencing quality,so the purification of PCR products was necessary before sequencing.In addition,the optimum templates amount in sequencing reaction rose with the increasing of their DNA size in a certain range.
Key words:polymerase chain reaction(PCR); direct sequencing of PCR product; ABI 377-DNA sequencer; Q20 相似文献
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罗布麻及其易混品的DNA分子鉴定 总被引:2,自引:1,他引:1
为从分子水平更准确地鉴别罗布麻及其易混品,本研究利用PCR产物直接测序法对罗布麻、大叶白麻和Apoacynum cannabinum的核基因组(rDNA)ITS区与叶绿体基因组(cpDNA)trnL内含子及trnL-F间隔区序列进行测序与比较。结果显示,罗布麻和大叶白麻ITS序列完全一致,与A. cannabinum在ITS1区有13个位点、在ITS2区有10个位点不同;在trnL内含子区及trnL-F间隔区,罗布麻和大叶白麻共有3个位点不同,罗布麻和A. cannabinum间共有23个位点、大叶白麻和A. cannabinum间共有20个位点不同。研究表明,依据rDNA ITS区序列可鉴别A. cannabinum和国产“罗布麻”(罗布麻与大叶白麻);利用cpDNA trnL内含子及trnL-F间隔区序列可鉴别罗布麻及其相似种。 相似文献
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新型的NDA序列测定策略:PCR产物直接测序 总被引:1,自引:0,他引:1
DNA序列的测定在现代分子生物学中的应用越来越广泛 ,传统的模板制备方法是将待测序列的DNA片段插入质粒或病毒载体中 ,然后让其在宿主细菌细胞中增殖。尽管这套方法已被简化和标准化 ,但由于其涉及到活细胞的保存和使用 ,不可避免地会带来诸如载体和宿主细胞基因发生突变等不利影响。而用PCR技术直接从基因组或克隆片段制备测序模板 ,可以完全避免细菌培养、模板提取等重复性操作 ,也克服了以上弊端 ;由于PCR技术快速、简便 ,在检测人类遗传病的基因突变时 ,需要比较患者和正常人中的突变分布情况 ,应用PCR直接测序技术就能… 相似文献
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菌落PCR在大规模基因组测序中的应用 总被引:22,自引:0,他引:22
一种利用菌落直接PCR扩增DNA并用于测序的实验方法.通过对引物的设计和菌液浓度控制,使PCR反应后的内容物对测序干扰减到最小.与传统的测序过程比较,它省去了抽提模板DNA一步,节省了大量时间和实验成本.另外此方法可对BAC亚克隆库构建时由连接转化过程中导致的假阳性起筛选和鉴定作用.采用该法成功测定了籼稻(Oryza sativa indica)广陆矮4号的L3173号BAC DNA全长序列(约100 kb),GenBank登录号:AL512542. 相似文献
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rDNA序列中的ITS作为DNA barcoding广泛应用于真菌的系统发育与物种辅助鉴定,IGS被认为可以用于种内水平不同菌株的鉴别。食用菌中还没有完整的rDNA序列的报道。本研究采用二代和三代测序技术分别对金针菇单核菌株“6-3”进行测序,用二代测序的数据对三代测序组装得到的基因组序列进行修正,得到一个在基因完整性、连续性和准确性均较好的基因组序列,对比Fibroporia vaillantii rDNA序列,获得金针菇完整的rDNA序列。金针菇rDNA序列结构分析表明,它有8个rDNA转录单元,长度均为5 903bp,有9个基因间隔区,其长度有较大差异,3 909-4 566bp。rDNA转录单元中,各元件的序列长度分别为:18S rDNA 1 796bp、ITS1 234bp、5.8S rDNA 173bp、ITS2 291bp、28S rDNA 3 410bp。基因间间隔区中,IGS1 1 351-1 399bp、5S rDNA 124bp、IGS2 2 435-3 092bp。金针菇的5S、5.8S、18S、28S rDNA序列准确性得到转录组数据的验证,也得到系统发育分析结果的支持。多序列比对发现,不同拷贝的基因间间隔区序列(IGS1和IGS2)存在丰富的多态性,多态性来源于SNP、InDel和TRS(串联重复序列),而TRS来源于重复单元的类型和数量。9个基因间间隔区之间,IGS1只有少量的SNP和InDel,IGS2不仅有SNP和InDel,还有TRS。本研究结果提示,在应用IGS进行种内水平不同菌株之间的鉴别时,需要选取不同拷贝之间的保守IGS序列。 相似文献
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目的:探讨焦磷酸测序技术对单核苷酸多态性分型因测序图谱中存在的一些典型问题而导致分型结果不准确的解决方法。方法:以VKORC1基因1639 G〉A位点、CYP2C19基因636 G〉A位点及UGT1A1基因TA重复序列(TA)6〉(TA)7的多态性检测为例,分别采用优化PCR条件、改变测序时dNTP的加入顺序以及设立外标校正的方法来解决上述问题,从而提高焦测序对SNP分型的准确性。结果:通过升高PCR退火温度,可以显著提高VKORC1基因的扩增特异性,降低了测序图谱中非特异性信号峰强度;通过优化测序时dNTP的加入顺序,CYP2C19基因636 G〉A位点的准确分型结果可通过观察测序图谱中相关信号峰的有无而简单获得,避免了比较信号峰的相对强度;通过比较待测样本与已知基因型的外标样本的测序图谱来确定待测样本的基因型,提高了对UGT1A1基因TA重复序列(TA)6〉(TA)7多态性的分型准确性。结论:本文针对焦测序在测定SNP时的常见问题所提出的相应解决方法不仅简单、经济有效,而且在临床应用方面具有可靠性。 相似文献
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目的:构建出地衣植物核糖体rDNA(nrDNA)的ITS序列的系统发育树并探讨地衣植物的DNA条形码.方法:以黑龙江五大连池风景区的地衣植物为材料,采用特异性引物对地衣植物的ITS序列进行Pcr扩增,直接对其Pcr产物进行测序,利用MEGA4.0软件建立地衣植物的ITS序列的系统发育树.结果:根据系统发育分析得出一致性指数CI和维持性指数RI分别为0 5356和0.6602,相同属地衣的样本间即种内的遗传距离 和不同属的样本间即种间的遗传距离(K-2-P)平均值分别为0.030和0.600,种间距离大于种内距离.结论:根据地衣植物样本间的遗传距离(K-2-P)的分析,得出核糖体rDNA的ITS基因对地衣近缘属的分类鉴定上具有一定的参考价值,建议作为地衣分类鉴定的条形码的测试片段. 相似文献
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硬软蒺藜rDNA-ITS基因序列的测定和比较 总被引:1,自引:0,他引:1
用CTAB法提取总DNA,合成位于18 S rDNA和26S rDNA上的两条各20bp的引物,通过PCR扩增ITS的全序列,对PCR产物直接测序,分别获得了硬蒺藜(Tribulus terrestris L.)和软蒺藜(Atriples centralasiatica Iljin)的核糖体RNA基因-rDNA内转录间隔区(ribosomal DNA internal transcribed spacer,rDNA-ITS)的序列643 bp和607bp,其碱基总差异率为36.16%,其中,ITS1的碱基差异率为55.81%;5.8 S的碱基差异率为6.59%;ITS2的碱基差异率为56.77%.这种差异,以及基因序列本身,为硬软蒺藜的区别和种质资源鉴定提供了分子依据. 相似文献
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利用PCR、UT-PCR、克隆及测序等技术,对强直性肌营养不良基因(MT-PK)3′-非翻译区分别用Taq,Taq+Pwo DNA聚合酶进行了扩增、克隆和测序,研究了PCR产物末端组成情况,并比较了上述两种DNA聚合酶对PCR产物末端的影响.结果在用Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物主要得到3′端突出1个A(占67.3%,35/52);在Taq+Pwo DNA聚合酶扩增的PCR产物末端中得到3′端+A的仅占17.4%,而-1的占34.8%,与前者显著不同.表明PCR扩增产物的末端是复杂多样的. 相似文献