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相似文献
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1.
棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.  相似文献   

2.
目的:构建人CXCR4原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法:从健康人外周血单个核细胞提取总RNA,以RT-PCR获得CXCR4基因全长1059bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD-18T中,经限制性内切酶和菌落PCR分析并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)。结果:12%SDS-PAGE分析表明,在30℃以IPTG诱导获得分子量为43ku的His-CXCR4融合蛋白表达带,诱导4h后此蛋白表达量约为全菌总蛋白的25%。结论:成功获得人CXCR4基因融合蛋白。  相似文献   

3.
SUMO蛋白酶(Ulp1)是切割小分子泛素修饰(SUMO)融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶,具有酶切效率高、特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵、操作复杂,限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术,合成基因ulp1(Leu403-Lys621),并在N端和C端加入多聚组氨酸标签(His_6),构建重组表达载体psv T7-ulp1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trx B(DE3)中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主,转接后7h加入IPTG,IPTG的终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为16h,最终蛋白质表达量占菌体总蛋白质量的34.5%,重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L,通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应,测定酶活为5.19U/μl,比酶活为5.23×10~4U/mg,是先前报道比酶活的1.87倍,通过酶活动力学分析,Ulp1的表观米氏常数K_m=0.359g/L,V_m=5.10μg/(ml·min)。将SUMO融合表达体系用于单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)的表达,得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白,使用表达的Ulp1进行酶切并纯化,获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单,显著改善了scFv在大肠杆菌中难以高效可溶性表达纯化的现状。  相似文献   

4.
本研究在大肠杆菌BL21中融合表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白,并初步评价其应用价值。采用PCR技术扩增出HPV16E7基因,将其克隆进原核表达载体pGEX6p-1,转化至大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达。以纯化的融合蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测重组李斯特菌(Lm1-2-E7)免疫小鼠后的E7血清抗体水平。在25℃,0.5mM IPTG诱导下,HPV16E7蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,融合蛋白以可溶性形式存在,Western blot结果显示其与HPV16E7单克隆抗体发生特异性反应。二次免疫后小鼠血清经间接ELISA结果表明E7特异性抗体滴度为1∶200。结果表明GST-E7融合蛋白具有较强的免疫活性。  相似文献   

5.
为研究SUMO标签增溶体系和小麦低分子量麦谷蛋白亚基功能,利用SUMO标签构建XYGluD3-LM-WGS基因原核表达可溶性增强的系统,采用PCR方法从已有质粒XYGluD3-LMWGS1/pGEM-Teasy中克隆到该基因不含上游启动子片段XYGluD3-LMWGS1-no Promoter 798 bp(简称LnoP),构建原核表达载体LnoP/pGEX-4T-1,并借助已有质粒SUMO1/pET-41a( )构建原核表达载体LnoP-SUMO1/pET-41a( )与LnoP-SUMO1-N2/pET-41a( )以及LnoP-SUMO1/pET-32a( ),分别诱导表达融合蛋白分析其可溶性,结果显示;(1)融合蛋白GST-LnoP、GST-SUMO1-LnoP、SUMO1-LnoP和Trx-SUMO1-LnoP表达成功;(2)电泳和Western blot分析显示,GST-LnoP和GST-SUMO1-LnoP的可溶蛋白表达均为电泳不可见,SUMO1-LnoP与Trx-SUMO1-LnoP有微量可溶表达.结果表明,试验首次实现人的SUMO1标签在麦谷蛋白低分子量亚基中的融合表达;尽管人的SUMO1做为融合标签对于增加低分子量麦谷蛋白D位点亚基可溶性的作用并未达到预期效果,但研究结果为SUMO标签增溶体系的建立和小麦低分子量麦谷蛋白亚基功能研究奠定了基础.  相似文献   

6.
目的为了构建人分泌型磷脂酶A2(secretaryphospholipaseA2,sPLA2-IIA)的有效表达系统,从胎脾中提取总RNA。方法采用RT-PCR方法扩增出编码sPLA2-IIA的基因定向地克隆于硫氧环蛋白基因融合表达载体pET32a的TrxA基因3′末端,构建符合读码框的融合表达载体pET32a-sPLA2-IIA。37℃下经IPTG诱导,hsPLA2-IIA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,表达产物以包涵体的形式存在。包涵体经8mol/L尿素溶解、复性后检测结果显示具有较高的催化活性并呈现剂量依赖关系。结论以大肠杆菌为宿主,成功表达了hsPLA2-IIA蛋白,为进一步进行hsPLA2-IIA的大量生产和功能研究奠定了基础。  相似文献   

7.
目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。  相似文献   

8.
原核表达猪盖他病毒(Getah virus)衣壳蛋白(Cap)并制备多克隆抗体。设计一对特异性引物,从含有Cap基因的pT-Cap质粒中扩增全长Cap基因,克隆至携带有His标签的原核表达载体pColdⅠ中,通过PCR、酶切鉴定和序列测定后,重组质粒pCold-Cap转化大肠杆菌Rosetta 2,IPTG诱导后SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白;蛋白经镍柱纯化后切胶免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体。实验表明:经终浓度0.1mmol/L IPTG 15℃诱导24h后,Cap基因在Rosetta 2中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的40.2%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为32.3kD。Western blot显示制备的鼠源抗血清可以与融合蛋白发生反应,有明显的特异性条带。猪盖他病毒衣壳蛋白原核表达成功,制备的多抗可以识别Cap蛋白。  相似文献   

9.
高酯酶活性工程菌的构建及其对有机磷农药的降解   总被引:2,自引:0,他引:2  
将抗性库蚊解毒酶酯酶B1基因片段引入融合表达载体pThioHisA中,转化入大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下,经过8 h,酯酶B1在大肠杆菌中获得融合高效表达,目的蛋白占菌体总蛋白的48.7%.重组质粒pThioHiA-B1表达的酯酶融合蛋白具有较高的酯酶B1活性,能高效降解酯酶的特异性底物β-乙酸萘酯(β-NA),并在37℃、pH7.5的条件下,2h内对1000mg/L的甲基对硫磷降解率达81%.  相似文献   

10.
为提高人乳头瘤病毒(HPV)16型治疗性融合蛋白疫苗HPV16 L2E7在大肠杆菌中的表达量,根据大肠杆菌偏爱密码子,对HPV16 l2e7基因进行密码子优化,优化后的基因分别插入到p GEX-5X-1、p QE30和p ET41a表达载体中,转化JM109、JM109(DE3)和BL21(DE3)表达菌,筛选出高表达菌株p ET41a-HPV16sl2e7/BL21(DE3),目的蛋白从占全菌蛋白的10%以下提高到约28%,优化接种量、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,获得最佳表达条件;通过15 L发酵罐发酵,SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200 pg纯化及复性HPV16 L2E7融合蛋白,制备的融合蛋白纯度可达95%以上,经SDS-PAGE、Western blotting鉴定证实,制备的HPV16 L2E7蛋白加Cp G佐剂对小鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用,有75%(6/8)的小鼠不成瘤,为后续的疫苗产业化奠定基础。  相似文献   

11.
目的通过pET32a(+)原核表达载体,表达重组人叉头框蛋白L2(human forkhead box12,FOXL21)。并且进行纯化和鉴定。方法从正常人血液中提取基因组DNA,利用PCR扩增FOXL21目的基因片段,构建FOXL21原核表达重组质粒[pET32a(+)-FOXL21]并转化E.coli的BL21(DE3)菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,经HisTrap FF亲和层析柱纯化,再通过SDS—PAGE和Western印迹鉴定。结果成功克隆到大小为1131bp的人源FOXL21基因片段并准确插入表达载体pET32a(+),0.1mmol/LIPTG诱导转化菌8h可表达大量的FOXL21蛋白,并可经HisTrap FF柱亲和层析得到高度纯化。结论成功获得纯化的66kD重组人FOXL21蛋白,为后续进行FOXL21蛋白的功能研究奠定了基础。  相似文献   

12.
旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。  相似文献   

13.
提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b(+),将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b(+)。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用(酪蛋白为底物),重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。  相似文献   

14.
应用RT-PCR技术从人乳腺癌细胞系SK-BR-3中克隆出人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor 2,HER2)基因的胞外段,并插入到表达载体pET-30a中,得到重组表达载体pET30-HER2(Ex)。将该载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,加入IPTG进行诱导表达,成功获得HER2胞外段蛋白。分别提取培养液上清、大肠杆菌周质腔、细胞质可溶性及不可溶性组分蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,确定目的蛋白定位于大肠杆菌细胞质包涵体中。通过改变诱导温度、诱导物浓度、诱导起始菌体密度和诱导时间,寻找最佳表达条件,使目的蛋白的表达量达到最高。结果表明,在37℃下,OD600达到1.0时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h,目的蛋白的表达量最高。将重组表达菌进行超声破碎,分离出包涵体组分,经Ni2+亲和层析纯化后获得了纯度>90%的HER2胞外段蛋白,从而为抗HER2抗体的制备及肿瘤疫苗的研究奠定了基础。  相似文献   

15.
在原核系统中高效表达抗狂犬病毒单链抗体scFv41,以便进一步研究其生物学功能,预测临床应用前景。以重组质粒pCANTABscFv41为模板,PCR扩增带NcoI和NotI位点的scFv41基因,克隆入原核表达载体pET-22b( ),酶切鉴定重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。竞争ELISA检测表达蛋白的特异结合活性。酶切鉴定证实scFv41基因已插入原核表达载体pETl-22b( ),重组表达质粒pET-scFv41在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%。竞争ELISA检测结果表明scFv41表达蛋白可特异抑制抗狂犬病毒IGY与狂犬病毒的特异性结合。该实验为进一步研究scFv41的生物学特性和免疫保护作用,及基因工程抗体的制备奠定了基础。  相似文献   

16.
用PCR方法扩增到抵抗素基因(Resistin, RSTN)并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,获得重组质粒pET-RSTN。将重组质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测结果表明,重组resistin蛋白分子量大小约30kDa。对表达条件如温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化并用SDS-PAGE检测。结果表明,30℃、4h、IPTG浓度为1mmol/L时,可溶性重组resistin的含量最高。表达产物经Western blot检测证实是Resistin蛋白,并用镍离子亲和层析的方法获得纯化的Resistin蛋白。  相似文献   

17.
前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。  相似文献   

18.
目的:原核表达棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)iap3基因,制备该蛋白的多克隆抗体,并利用该抗体分析iap3基因在病毒感染过程的表达时相,为深入研究提供基础.方法:PCR扩增iap3基因后,克隆至pET28b,转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,利用亲合层析进行蛋白纯化,将纯化融合蛋白免疫大鼠制备抗血清,利用抗血清Western blot检测IAP3在病毒感染过程的表达时相.结果:成功在原核细胞中表达iap3基因,并获得纯化的融合His - tag的IAP3蛋白,制备了该蛋白的多克隆抗体.发现iap3基因最早在感染后24h表达,到72h到达表达高峰.结论:获得了IAP3多克隆抗体,iaP3基因是一个晚期表达基因.  相似文献   

19.
目的 为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因。方法 根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体。将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达。将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白。融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割。结果 研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0.843 U。结论 人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达。  相似文献   

20.
目的:研究重组人组织型纤溶酶原激剂突变体(reteplase,r-PA)基因的克隆和表达,并对表达产物进行活性鉴定。方法:通过PCR的方法从t-PA基因上扩增得到r-PA基因的编码序列,并克隆到pUC19载体中,经DNA测序正确后,将该基因克隆到含有,T7启动子的高效表达质粒pJZ-100中,转化E.coli BL21(DE3),得到含有r-PA基因的工程菌。工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况。提取包涵体,经过体外稀释法复性,亲和色谱层析纯化,测定产物的活性。结果:表达的重组蛋白约占可溶性总蛋白的20%,复性并纯化后测定活性为58000IU/mg。结论:成功构建了重组r-PA的表达质粒,表达产物具有良好的生物活性。  相似文献   

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