家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)的基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备

丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员.本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyx mori serpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础.首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经...     

苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

【目的】丝氨酸蛋白酶(Serine protease,SP)是以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。在昆虫中,丝氨酸蛋白酶参与消化、发育、先天免疫反应和组织重建等重要的生理过程。本试验以苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca为材料,克隆其丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,再对该基因进行原核表达并对表达产物进行活性测定研究。【方法】从苜蓿夜蛾中肠中提取总RNA,通过RT-PCR和RACE技术,扩增获得丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列,用大肠杆菌E.coli表达系统进行表达;再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性,并以BTEE为底物进行活性测定。【结果】克隆得到的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为Hv SP,该基因已登录Gen Bank,登录号为KT907053。该基因全长1 017 bp,开放阅读框为886 bp,编码295个氨基酸,分子量约为30.8 ku,等电点为8.27,推导的氨基酸序列与其他昆虫丝氨酸蛋白酶氨基酸序列相似性在46%~92%之间。在Tris-HCl缓冲液中,p H为8.5时,复性的重组蛋白活性最高,为28.7 U/m L。荧光定量PCR结果表明,Hv SP基因的m RNA在苜蓿夜蛾的多个组织中特异性表达,且在中肠中表达量最高,但在唾腺中未检测到Hv SP的m RNA表达。【结论】该研究克隆了一个新的苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性,为进一步探索丝氨酸蛋白酶在昆虫体内的生理生化功能奠定了基础。     

家蚕细胞周期蛋白基因BmCcnl1的克隆及表达分析

家蚕Bombyx mori由受精卵到完成胚胎发育孵化的过程中, 细胞进行大量的分裂和分化, 然而滞育性卵的胚胎细胞分化至G2期便停滞在此阶段。为了探索这一发育阶段细胞内的分子调控, 本研究以人Homo sapiens的细胞周期蛋白基因cyclin L1为模板, 成功克隆了家蚕同源基因BmCcnl1（GenBank登录号: FJ889988）。BmCcnl1基因开放阅读框（open reading frame, ORF）全长1 254 bp, 编码417个氨基酸。利用Protean软件分析得出BmCcnl1蛋白预测分子量为49 kDa, 等电点为9.84。利用DNA重组技术构建了BmCcnl1基因的重组表达载体pET-21d-BmCcnl1, 对其进行原核表达, 其表达的蛋白以包涵体形式存在。利用RT-PCR技术分析了BmCcnl1基因在胚胎发育过程中的转录水平, BmCcnl1基因在非滞育性卵的胚胎发育阶段基本保持相对稳定的转录表达, 而滞育性卵从蛾体产下经过72 h后已经检测不到BmCcnl1基因的转录。结果提示, BmCcnl1基因与胚胎期滞育及非滞育性卵的发育调控相关。对该基因的克隆和表达分析为今后研究家蚕胚胎发育及细胞周期调控奠定了基础。     

家蚕整合素Bmintegrin β1基因的克隆及表达

整合素作为一种跨膜糖蛋白,与生物体的生理和病理等多个过程密切相关。为了探究其在家蚕中扮演的角色,通过PCR及RACE技术克隆得到了家蚕整合素β家族成员Bmintegrinβ1,通过结构域预测网站对其结构域进行了预测,并构建进化树对其进化关系进行分析,此外通过原核表达系统及蛋白纯化方法获得其重组蛋白,使用重组蛋白免疫小鼠获得其多克隆抗体,并采用半定量PCR及Western blotting方法检测Bmintegrin β1的时空表达。文中得到家蚕整合素Bmintegrin β1的3种剪切形式,且这3种剪切体具有长为2 502 bp的开放阅读框架,编码833个氨基酸。根据预测该蛋白含有Integrin-B-tail、跨膜区等一系列整合素家族保守的结构域。进化树结果表明该蛋白与同为鳞翅目成员的烟夜蛾和黑脉金斑蝶的整合素蛋白最为接近。此外我们通过原核表达系统及亲和层析技术获得了高纯度的Bmintegrin β1蛋白,进一步制得多克隆抗体。并通过免疫印迹反应证明该抗血清能特异识别Bmintegrin β1重组蛋白。之后通过半定量PCR及免疫印迹检测,结果显示该蛋白在家蚕的各组织以及血细胞各时期均有较高表达且在血液中表达量最高。总之,这项研究为家蚕整合素家族的研究提供了基础。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂20的表达特征分析

【目的】原核表达家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂20(Serine proteinase inhibitor 20,Bm Serpin-20),分析Bm Serpin-20基因和蛋白组织表达分布特点,以及不同外源病原物刺激家蚕后Bm Serpin-20基因的表达模式。【方法】利用p ET-28a表达载体在大肠杆菌Transetta(DE3)中融合表达Bm Serpin-20蛋白,利用纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用实时定量PCR技术及Western blot方法分别分析Bm Serpin-20基因和蛋白的组织表达水平,以及病原物免疫刺激后的表达模式。【结果】在大肠杆菌中正确表达和纯化了融合Bm Serpin-20蛋白,并制备了多克隆抗体;Bm Serpin-20基因和蛋白在脂肪体、中肠、血细胞、马氏管、表皮、睾丸、卵巢中均有表达,且在表皮中表达量最高;家蚕5龄幼虫经核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis viruses)、藤黄微球菌Micrococcus luteus、大肠杆菌Escherichia coli、白僵菌Beauveria bassiana处理后,Bm Serpin-20基因表达量先下调而后上调,但不同病原物在不同时间的影响不尽相同。【结论】研究了Bm Serpin-20基因和蛋白的表达模式,为下一步研究其在家蚕免疫系统中的作用奠定了基础。     

家蚕组织蛋白酶D基因的克隆、序列分析及其表达谱研究

组织蛋白酶D (cathepsin D,CtD)是溶酶体内天冬氨酸内切蛋白酶,参与机体多种生理病理过程,尤其在昆虫的发育变态过程中起着重要作用。利用NCBI上登录的组织蛋白酶D基因核酸序列和家蚕Bombyx mori表达序列标签（expressed sequence tags, EST）数据库,进行电子克隆获得家蚕组织蛋白酶D (BmCtD) 基因的全长cDNA (DQ010007)。该cDNA大小为1 543 bp,其中ORF长1 152 bp,同源性分析表明BmCtD与其他物种的CtD具有较高的相似性。BmCtD的mRNA存在选择性拼接,另外一种mRNA形式命名为BmCtDⅠ。RT-PCR实验表明该基因在本实验所调查的家蚕不同发育时期和组织中都有表达。     

家蚕Bmyan基因的克隆表达和作为microRNA 7靶基因的验证

microRNAs(miRNAs)是一类长约22 nt的非编码RNA,通过与其靶基因3′端非翻译区(3′-UTR)的结合来调节各项生命活动。克隆表达家蚕Bmyan基因,验证其是否是bmo-miR-7的靶基因对于深入研究家蚕变态发育机制有重要意义。基于同源性检索和PCR扩增,克隆了家蚕Bmyan基因CDS全长,编码476个氨基酸。序列分析表明,家蚕YAN蛋白的氨基酸序列保守,含SAM-PNT和ETs结构域。芯片数据、RT-PCR和定量PCR的检测结果表明,Bmyan在五龄3 d的家蚕头部、体壁、卵巢中高量表达,在其余组织中低量表达或不表达。在幼虫期,Bmyan表达水平相对较低,但在上蔟期和蛹期前4 d高量表达。通过3′RACE克隆了Bmyan基因的3′-UTR。RNAhybrid在线软件预测了其3'-UTR上bmo-miR-7的两个靶位点。构建了含有Bmyan基因3′-UTR和荧光素酶报告基因的转染载体,将该载体与bmo-miR-7的mimics序列共转染到家蚕胚胎细胞系BmE中,通过测定荧光素酶的活性,证明了Bmyan基因是bmo-miR-7的靶基因。本研究为进一步揭示bmo-miR-7和Bmyan在家蚕体内的生物学功能奠定了基础。     

通粳1号水稻乙醛脱氢酶基因的克隆及原核表达

目的：克隆通粳1号水稻乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase,ALDH）基因,并在大肠杆菌中进行体外表达。方法：提取通粳1号水稻幼根总RNA,RT-PCR法扩增ALDH基因开放阅读框架片段,双酶切后连接至pET5a表达质粒中,转化BL21（DE3）宿主菌,平板培养筛选,挑取阳性菌落并提取质粒,酶切、电泳鉴定插入片段并测定其序列。含重组质粒的BL21（DE3）进行常规LB扩大培养,用不同浓度的IPTG作用不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。结果：质粒中插入的ALDH片段为1668bp,含有完整的开放阅读框架,序列与GenBank比较无差异,插入方向正确无误,表达蛋白分子量为61.8kDa左右,符合预期值,IPTG最佳诱导时间为3h,0.1mmol/L～0.8mmol/L浓度的IPTG作用效果无显著差异。结论：该基因的成功克隆和表达为进一步研究水稻中ALDH的作用和应用生物工程法大量获得ALDH奠定基础。     

家蚕雌激素相关受体基因的克隆与表达分析

【目的】黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 雌激素相关受体（estrogen-related receptor, ERR）通过调节糖酵解过程进而控制果蝇的能量代谢。本研究在克隆家蚕Bombyx mori ERR 基因 (BmERR) 的基础上,对其分子特性和系统演化进行生物信息学分析, 并检测该基因在家蚕生殖腺中的表达,为进一步研究ERR功能奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆 BmERR 基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR检测该基因在停食后家蚕幼虫生殖腺中的表达情况。【结果】BmERR 基因全长cDNA序列为1 296 bp,编码431个氨基酸残基;具有ERR蛋白家族典型的结构特征;系统进化分析显示BmERR与其他昆虫ERR氨基酸序列一致性较高;半定量 RT-PCR 检测表明,BmERR 在家蚕上簇到化蛾期间的精巢和卵巢中均有表达,表达具有时期特异性,化蛹第1天达到表达高峰。【结论】本研究首次从鳞翅目昆虫中克隆获得ERR cDNA序列。ERR基因在家蚕生殖腺中表达量无明显性别差异,但具有发育时期特异性。     

家蚕吡哆醛激酶cDNA的克隆、表达和基因结构分析

吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK, EC2.7.1.35）是维生素B₆关键代谢酶,其cDNA的克隆在昆虫类还未见报道。利用生物信息学原理和使用PCR方法,克隆出编码家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶的cDNA (GenBank登录号DQ452397),体外原核表达成功,并对表达粗提产物进行了酶活检测。克隆到的cDNA含有一894 bp的完整可读框,编码一条分子量为33.1 kD,含298个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类吡哆醛激酶具有52.84%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶均少10多个氨基酸残基,几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。依据家蚕基因组数据库信息和PLK的cDNA,家蚕PLK基因包含5个外显子和4个内含子,跨越10 kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5′端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。     

激光诱发家蚕孤雌生殖的研究

采用 CO2激光扩束辐照诱发家蚕孤雌生殖,获得着色卵率约60%,转青卵率约31%,孵化率只占转青率的1.85%,全是雌蚕,其发育机制属非减数分裂型,没有出现畸形蚕,茧质未下降。从激光诱发的孤雌生殖的后代中,初步选出两个新类型的可作育种材料。 Abstrect:In order to induce silkworm(Bombyx mori)parthenogenesis,we irradiated eggs by Co2 laser.The results showed,60% colored eggs,31% average bluish eggs,only 1.85% hatchavility among the bluish eggs,all female from those eggs and so an ameiosis parthenogenesis;no malformed worm,thus similar constitution and quality to their parents;and finally two new strains which can be used to breed new strains and furhther studies.     

家蚕滞育激素基因的克隆

利用放射性同位素３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记家蚕滞育激素ｃＤＮＡ作为探针,从家蚕基因库大约４×１０~５个噬菌体斑中筛选得到３０个阳性克隆,其中３个克隆具有相同的限制性内切酶图谱,并测知插入ＤＮＡ约１８ｋｂ,用限制性内切酶ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ切割,进行次克隆。用ＴａｑＤｙｅｐｒｉｍｅｒ序列测定法,得到部分核苷酸序列,经比较,鉴定了这３个克隆确属滞育激素基因。基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析,推定家蚕滞育激素基因属单基因编码。     

家蚕3-羟酰辅酶A脱氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达

家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因(Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD)。本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5’端非翻译区序列(5’-UTR)、一个930bp的开放阅读框(ORF)和一个155bp的3’端非翻译区序列(3’-UTR);基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。     

家蚕BmST2基因的克隆与转录活性检测

通过生物信息学分析和生物学试验获得了家蚕糖转运蛋白基因BmST2(GenBank登录号:GQ871755),基因位于家蚕27号染色体,开放阅读框(ORF)长1398 bp,编码465个氨基酸,预测蛋白序列有典型的Sugar_tr结构域和11个疏水的跨膜结构域,与家蚕BmST1蛋白相似性和一致性分别达79%和64%,与登录号为EAT47626、EDS35465、EAA11457和EFA05337的同源蛋白相似性在50%以上。RT-PCR检测基因在5龄第3天家蚕幼虫的9种组织中转录活性,结果显示,BmST2基因除在脂肪体没有表达外,其他组织均有表达。最后成功构建了基因的酵母穿梭表达质粒pG-BKT7-BmST2。     

■普斑限性与■虎斑限性品系家蚕的联会复合体分析

作者以去污剂铺展——硝酸银染色技术,对家蚕普斑限性及虎斑限性品系雌蚕的联会复合体进行亚显微观察分析,未发现品系有异形ZW;但在品系中发现ZW呈现明显的末端不对称性。联会复合体分析表明该品系的ZW两侧线的相对长度相差达5.2％,较长的侧线为Z染色体,较短的侧线是断裂后的W染色体和第Ⅳ连锁群带有Ze片染的相互转座。ZW-SC在晚粗线期开始分离,较其他SC分离显著提前。这可能与易位导致ZW的不同源区段增长有关。     

家蚕耐氟基因RAPD分子标记的筛选及其克隆

为获得家蚕耐氟基因的分子标记,以家蚕耐氟品种T6和高敏感品种733新为材料,并构建了其近等基因,采用300个随机引物进行RAPD扩增,获得了与家蚕耐氟性有关的一个分子标记,此标记由引物S250扩增得到,并在F2代分离个体中得到验证,证明了此分子标记的可靠性,进而将此标记克隆进T载体pmd-18中,完成测序,分析发现此序列是未有报道的新序列。     

Cloning and Characterization of the cDNA Encoding the Masquerade-like Serine Proteinase Homologue Gene of the Silkworm, Bombyx mori

ABSTRACT From Bombyx mori larvae, RT-PCR and cDNA library screening isolated masquerade-like serine proteinase homologue cDNA gene, proposed to be related to insect immunity and its characteristics were examined. The isolated gene is composed of 1.3 kb of nucleotide and 420 amino acid residues were encoded. According to the results of database search, the isolated gene showed high sequence homology with Holotrichia and Tenebrio's 45 kDa protein, Drosophila CG5390 gene. Moreover, it is composed of regulatory domain and catalytic domain, which is characteristic of serine proteinase that can be found in the insect immune reaction and embryonic development processes. Enzyme activation site by proteolytic cleavage and the sequence of three amino acids participate in the catalytic triad of enzyme and 14 cystein residues used in disulfide bridges are well conserved with the compared genes. The mRNA expression was increased following E. coli injection and constitutive expression was also observed before injection by Northern blot analysis.     

核糖核酸酶抑制蛋白变体RIv在大肠杆菌和家蚕细胞中的表达

人源的核糖核酸酶抑制蛋白 (ribonucleaseinhibitor,RI)是一种富含亮氨酸和半胱氨酸残基的酸性蛋白质 ,分子量为 5 0kD。从人胚胎肝cDNA文库中克隆到一个核糖核酸酶抑制蛋白RI基因的变体 (ribonucleaseinhibitorvari ant,RIv)。序列分析表明 ,与RI相比较 ,RIv序列中仅有Arg359Ala和Leu36 5Pro两个氨基酸突变 ,而核苷酸同源性较低 ,为 78%。将RIv克隆于pET2 8a( ) ,并转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,利用 6×His亲和层析柱纯化得到了His RIv重组蛋白。将RIv克隆于转移载体pBacPAK8,利用家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)表达系统表达得到重组RIv。体外活性测定实验表明 ,重组RIv具有抑制牛胰RNaseA酶解 2 8S和 18SrRNA的作用。     

Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru

To construct the Bac-to-Bac expression system of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), a transfer vector was constructed which contained an Escherichia coli (E. coli) mini-F replicon and a lacZ: attTN7: lacZ cassette within the upstream and downstream regions of the BmNPV polyhedrin gene. B. mori larvae were cotransfected with wild-type BmNPV genomic DNA and the transfer vector through subcutaneous injection to generate recombinant viruses by homologous recombination in vivo. The genomic DNA of budded viruses extracted from the hemolymph of the transfected larvae was used to transform E. coli DH10B. Recombinant bacmids were screened by kanamycin resistance, PCR and restriction enzyme (REN) digestion. One of the bacmid colonies, BmBacJS13, which had similar REN profiles to that of wild-type BmNPV, was selected for further research. To investigate the infectivity of BmBacJS13, the polyhedrin gene was introduced into the bacmid and the resultant recombinant (BmBacJS13-ph) was transfected to BmN cells. The budded viruses were collected from the supernatant of the transfected cells and used for infecting BmN cells. Growth curve analysis indicated that BmBacJS13-ph had a similar growth curve to that of wild-type BmNPV. Bio-assays indicated that BmBacJS13-ph was also infectious to B. mori larvae.