焦性没食子酸联合唑类药物对念珠菌的抑菌作用

目的了解光滑念珠菌临床菌株的药敏情况以及中药单体焦性没食子酸联合唑类药物对念珠菌的抑菌作用。方法收集临床分离的光滑念珠菌116株、白念珠菌49株、热带念珠菌42株、克柔念珠菌4株和近平滑念珠菌13株,采用ATB FUNGUS3药敏试条检测光滑念珠菌的药敏情况;同时采用棋盘肉汤稀释法检测焦性没食子酸联合唑类药物对念珠菌的抑菌情况。结果116株光滑念珠菌中,14.66%(17株)的菌株对氟康唑耐药,22.41%(26株)对伊曲康唑表现为非野生型和81.03%(94株)对伏立康唑表现为非野生型。焦性没食子酸对5种念珠菌的抑菌情况,46.55%光滑念珠菌的MIC值为64μg/mL;34.69%白念珠菌的MIC值为64μg/mL;59.52%热带念珠菌的MIC值为64μg/mL;25%克柔念珠菌的MIC值为128μg/mL;46.15%近平滑念珠菌的MIC值为128μg/mL。唑类药物与焦性没食子酸联合用药时,100%、99.14%、99.14%的光滑念珠菌分别对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑表现为协同作用或相加作用,差异无统计学意义(P>0.05);而白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌均表现为无关作用和拮抗作用。与单独用药相比,联合用药时81.03%、68.1%、77.59%的光滑念珠菌分别对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的MIC值降低2~3个浓度梯度,且耐药组与非耐药组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论光滑念珠菌对唑类药物具有耐药性,伏立康唑非野生型菌株所占比例最高。焦性没食子酸单独用药时,5组念珠菌中对光滑念珠菌的抑菌效果最好,且敏感组比耐药组的抑菌效果更加显著。焦性没食子酸联合唑类药物显著降低了光滑念珠菌唑类药物的MIC值,且耐药组比非耐药组的效果更加显著,为中西医结合治疗临床光滑念珠菌感染提供实验依据。     

影响念珠菌混合生物膜形成因素的研究进展

生物膜的形成是病原微生物重要的耐药机制之一,真菌感染一般与两种或两种以上真菌所形成的混合生物膜有关。念珠菌属是临床极为重要且研究较多的一类条件性致病真菌,已有较多证据显示念珠菌混合生物膜在真菌感染中所起的重要作用。本文针对影响念珠菌属混合生物膜形成的因素进行综述。     

粉防己碱对白念珠菌生物膜及芽管形成的影响

目的研究粉防己碱(Tet)对白念珠菌(Candida albicans)生物膜及芽管形成的影响。方法采用XTT还原比色法观察Tet对C.albicans成膜的影响;将0.01、0.1、1μmol/L的Tet分别与C.albicans悬液共同孵育,显微镜下计数芽管形成率。分别设阳性对照组(两性霉素B与白念珠菌悬液共孵育)和阴性对照组(白念珠菌悬液中不加Tet),试验重复5次。结果 Tet各剂量组对C.albicans生物膜及芽管形成具有明显抑制作用(P0.05),其作用与药物浓度呈正相关,其中1μmol/L的Tet对C.albicans生物膜及芽管形成的抑制率最高,C.albicans生物膜及芽管形成率低于阴性对照组(P0.05),1μmol/L的Tet组生物膜及芽管形成率低于0.01及0.1μmol/L组(P0.05)。与阳性对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论 Tet对体外C.albicans生物膜及芽管形成有一定的抑制作用。     

胡桃楸提取物对体外白念珠菌生物膜形成的影响

目的研究胡桃楸提取物对白念珠菌生物膜形成的影响。方法采用甲基四氮盐（XTT）还原法评价胡桃楸提取物对白念珠菌的生物膜形成及黏附性的影响。镜下观察胡桃楸提取物对白念珠菌生物膜的形态学影响。结果胡桃楸提取物抑制白念珠菌生物膜50％及90％的最小抑制药物浓度（SMIC50、SMIC90）分别为15．2μg、23．4μg。胡桃楸提取物作用浓度大于20μg时对该菌细胞黏附有抑制作用。30μg胡桃楸提取物可完全抑制白念珠菌生物膜的形成。结论胡桃楸提取物对体外白念珠菌生物的膜形成有较强的抑制作用。     

超声联合两性霉素B纳米粒对白念珠菌生物膜杀菌效果评价

目的评价低频超声联合两性霉素B纳米粒对白念珠菌生物膜的体外协同杀菌效果评价。方法采用双乳化法制备两性霉素B纳米粒(amphotericin B-loaded nanoparticles,AmB-NPs)。XTT减低法评价经超声与AmB-NPs联合作用后对成熟生物膜活性的影响,激光共聚焦显微镜观察生物膜形态学改变,并检测生物膜分泌蛋白酶和磷脂酶活力。结果与对照组及游离AmB药物相比,超声联合AmB-NPs能明显降低生物膜活性(P0.01);生物膜厚度变薄,结构疏松,蛋白酶和磷脂酶活力明显下降。结论低频超声联合AmB-NPs对白念珠菌生物膜有显著的协同抗菌作用。     

培养条件对克柔念珠菌MALDI-TOF MS鉴定结果的影响分析

目的探究不同的培养时间、培养温度、培养基种类及培养气体环境对克柔念珠菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)鉴定结果的影响。方法收集中国侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)2012-2013年中17所医院克柔念珠菌25株,每株菌平行接种在沙堡弱氯霉素琼脂平板(SDA-C)、血琼脂平板等6种培养基,28℃和35℃2种孵育温度,空气和5%CO_2 2种气体环境中孵育,以真菌rDNA ITS测序为金标准,孵育24 h和48 h后,使用Vitek MALDI-TOF质谱仪(简称Vitek MS)和Bruker Autoflex Speed型MALDI-TOF质谱仪(简称Bruker MS)分别进行菌种鉴定,并对其鉴定正确率进行分析。结果克柔念珠菌孵育24 h和48 h时Vitek MS鉴定正确率均为100%,Bruker MS鉴定正确率分别是98.86%和87.43%。28℃SDA-C上生长的克柔念珠菌种水平鉴定准确率较35℃生长的菌株高。比较各种培养基,孵育48 h时SDA-C上生长的克柔念珠菌Bruker MS鉴定正确率(100%)最高。结论克柔念珠菌接种在SDA-C上,28℃空气培养24 h质谱鉴定效果最佳。常规细菌培养基上生长的克柔念珠菌,Bruker MS鉴定分值≥1.700即可认为菌种鉴定可靠。     

铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜形成的影响

目的研究铜绿假单胞菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对白念珠菌生物膜形成不同时期的影响。方法甲基四氮盐(XTT)减低法用于检测铜绿假单胞菌LPS对白念珠菌生物膜形成不同阶段生成量的影响,利用倒置显微镜观察生物膜形态学改变。结果铜绿假单胞菌对白念珠菌生物膜形成的影响具有阶段差异性和浓度差异性。结论铜绿假单胞菌LPS抑制白念珠菌生物膜菌丝的形成。     

新生隐球菌生物膜动物模型构建及PMT4对生物膜形成的影响

目的构建新生隐球菌的PMT4基因缺陷株及新生隐球菌生物膜的体内、外模型;研究PMT4基因对生物膜形成的影响。方法采用PCR介导的长侧翼同源重组的方法敲除新生隐球菌H99的PMT4基因;采用基础培养基96孔板培养的方法建立生物膜体外模型;兔中心静脉插管、管内放置聚苯乙烯薄膜的方法建立生物膜动物模型;用倒置显微镜、共聚集激光扫描显微镜、MTT、CFU计数等方法研究PMT4缺陷株与野生株生物膜的异同。结果新生隐球菌在体内、外模型中均能形成生物膜;PMT4缺陷株与野生株生物膜在生物量和结构方面存在明显差异。结论本实验的生物膜动物模型可行;PMT4基因缺陷可造成隐球菌生物膜代谢活性下降,并形成假菌丝样结构。     

环境因子对水霉菌生物膜形成的影响

【目的】体外构建水霉菌(Saprolegnia)生物膜(Biofilm,BF),研究环境因子对其生物膜形成的影响。【方法】采用改良的微孔板法研究静置培养条件下寄生水霉(Saprolegnia parasitica)ATCC200013在96孔酶标板上的成膜情况,CCK-8法(Cell Counting Kit-8)定量检测生物膜中水霉菌的活力。【结果】水霉菌的生物膜的OD450值在培养24 h达到峰值,48 h后趋于稳定。随着初始孢子浓度升高,水霉菌生物膜OD450值升高,差异显著(P0.05)。20-25°C生物膜形成量最多,OD450值显著高于其他温度组(P0.05)。在起始pH值为4-11的沙氏葡萄糖液体培养基中,水霉菌均能形成生物膜。在培养基中加入0.12 mmol/L以上CaCl2,能促进生物膜形成;添加0.03-2.00 mmol/L MgCl2,水霉菌生物膜形成量与未添加MgCl2对照组无显著性差异;Cu2+对水霉菌生物膜的形成有显著影响,0.5 mmol/L以上添加处理几乎不形成生物膜;NaCl能明显抑制水霉菌生物膜的形成,当NaCl质量分数低于0.12%时,对生物膜形成的影响较小(P0.05)。水霉菌在鲫皮和肌肉提取液包被后生物膜形成量与对照组相比无显著性差异,而鲫表皮黏液、鳃黏液包被后生物膜的形成量明显减少。【结论】研究首次采用微孔板法体外构建水霉菌生物膜,发现其生物膜的形成与多种环境因素有着密切的关系。这为了解水霉菌生物膜的形成规律提供了一定参考,为水霉菌生物膜的进一步研究奠定了基础。     

环境因子对鳗弧菌生物膜形成的影响

【背景】鳗弧菌是海产动物弧菌病的主要病原,在海水水域中广泛存在。鳗弧菌为了适应环境变化会生成生物膜,形成自我保护,对其防治是水产养殖行业的一大难题。【目的】探讨致病性鳗弧菌(Vibrio anguillarum)BYK0638生物膜的形成特性,为进一步研究鳗弧菌生物膜形成机制和致病机理提供参考。【方法】采用改良的微孔板法研究静置培养条件下鳗弧菌(V.anguillarum)BYK0638在96孔酶标板上的成膜情况,CCK-8法(Cell counting kit-8)定量检测生物膜中鳗弧菌的活力。【结果】鳗弧菌BYK0638能够在聚苯乙烯酶标板上形成稳定而明显的生物膜,其生物膜的OD450值在24 h达到峰值,60 h后趋于稳定;在107-108 CFU/m L范围内,鳗弧菌生物膜的OD450值显著高于其他试验组(P0.05);25°C时的生物膜OD450值显著高于其他温度生物膜的形成量;在p H 4.0-11.0范围内,当p H值为7.0时鳗弧菌形成的生物膜量最高,在p H值为3.0和12.0时鳗弧菌几乎不形成生物膜;在TSB培养基中加入0.03-2.00 mmol/L Ca Cl2,鳗弧菌生物膜形成量与未添加Ca Cl2对照组无显著性差异;在TSB培养基中加入0.03 mmol/L Mg Cl2,可促进鳗弧菌生物膜形成;Na Cl浓度为5%时,形成的生物膜OD450值最高;鳗弧菌在大黄鱼表皮黏液、肝脏、前肠、后肠组织提取液包被的96孔酶标板上形成的生物膜显著高于其他黏液和组织提取液包被组(P0.05)。【结论】致病性鳗弧菌BYK0638能形成稳定而明显的生物膜,其生物膜形成与外界环境因子变化有密切的关系,培养时间、初始菌浓度、温度、p H、Mg2+、盐度及不同组织和黏液等各种环境因子均能显著影响鳗弧菌生物膜的形成。     

pH及氧气对白念珠菌菌丝形成的影响

目的探讨pH值和氧气对白念珠菌菌丝形成的影响。方法通过调节Muller—Hinton液体培养基的pH值和去除培养基中的氧气来观察白念珠菌的生长曲线、倍增时间和菌丝形成率的变化。结果在无氧气的液体培养基中,白念珠菌生长缓慢,不能产生菌丝结构,只有酵母细胞形成。生长曲线的延缓期内各组没有明显差异,而在生长的对数期pH3和pH4的条件下念珠菌生长速度明显慢于pH5、pH6、pH7、pH8和pH9。菌丝形成率在pH3、pH4和pH5条件下〈20％,而在pH6、pH7、pH8和pH9条件下可高达70％。结论厌氧条件抑制白念珠菌的菌丝形成,只形成酵母细胞。白念珠菌在pH3—9的范围内均能生长,偏酸性环境有利于白念珠菌酵母形成,偏碱性的环境有助于菌丝的形成。     

微量肉汤稀释法比较分析不同培养时间念珠菌属对唑类药物的敏感性

目的探讨微量肉汤稀释法检测念珠菌属对唑类药物的体外敏感性时,培养24h和48h读取MIC值的差异。方法微量肉汤稀释法检测653株念珠菌对氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的体外药物敏感性,分别于24h和48h读取MIC值,比较不同孵育时间所得MIC总一致率(EA)、敏感性判定一致率(CA)及敏感性判定错误率(Error)。结果绝大多数念珠菌培养24h能够生长充分并进行MIC值读取;孵育24h和48h读取MIC值总EA较好,分别为:氟康唑(91.9%),伏立康唑(92.0%),伊曲康唑(95.6%);CA分别为氟康唑(96.9%),伏立康唑(90.4%),伊曲康唑(88.2%),不同菌种类型CA有差异;未发现极严重错误(VME)的结果,错误多为一般错误(MiE),653株菌敏感性判定错误率ME/MiE分别为氟康唑(1.7%/2.9%)、伏立康唑(2.0%/10.6%)和伊曲康唑(1.5%/13.0%)。结论微量肉汤稀释法检测念珠菌属对唑类药物体外敏感性时,孵育24h与48h MIC值一致率较好,24h读取MIC值可缩短药敏报告时间,减少拖尾现象导致的判读错误。     

纳米银离子对表皮葡萄球菌生物膜形成过程的影响

目的探讨纳米银离子对表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)生物膜(biofilm)形成过程的影响。方法采用摇床法,以纳米银离子含量不同的乙烯-醋酸乙烯酯(Ethylene-Vinyl acetate,EVA)塑料为细菌粘附载体,建立体外生物膜模型;将各个时间点培养好的标本放在扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)及倒置显微镜下观察空白组与纳米银离子干预组中生物膜的形成情况,并结合NIS-Element BR软件计算生物膜覆盖率(biofilm coverage rate,BCR);荧光探针SYTO9/PI标记生物膜内细菌、激光共聚焦显微镜(Confocal LaserScanning Microscopy,CLSM)结合生物膜图形结构分析软件(Image Structure Analyze,ISA)观察纳米银离子作用后各时间点生物膜的结构变化。结果 2 d组生物膜经SEM检测,纳米银离子干预组较空白对照组相比,细菌变稀疏,结构明显受到破坏。BCR检测,0.5 d时纳米银离子干预组较空白对照组相比差异没有统计学意义,但在1 d、2 d时BCR差异有统计学意义(P<0.05)。CLSM结合ISA软件分析结果显示,2 d时空白对照组与0.1%纳米银离子干预组生物膜厚度、平均扩散距离(average diffusion distance,ADD)和结构熵(textual entropy,TE),分别为17.55±2.08和11.33±0.98、3.12±0.30和1.93±0.13、5.79±和3.17±0.16(P<0.05);区域孔率(Areal porosity,AP)为0.90±0.01和0.98±0.01(P<0.05)。但5 d时2组参数之间差异没有统计学意义。0.05%纳米银离子组也有相同的趋势。结论纳米银离子对表皮葡萄球菌的形成有抑制作用,但随着时间的推移,其抗菌作用逐渐减弱。高浓度组较低浓度组抗菌效果更加明显,持续时间更长。     

ComD基因缺陷对变异链球菌生物膜形成的影响

目的观察变异链球菌密度感应信号系统相关基因ComD基因缺失前后变形链球菌生物膜成熟初期的变化情况,探讨ComD基因对变异链球菌形成菌斑生物膜的影响,从而为防治龋病提供实验依据和新方法。方法分别构建标准菌和缺陷菌在离体模型上的培养模型,通过扫描电镜观察两个实验组在6 h、12 h、24 h三个不同时间点的生物膜形成情况。结果在三个不同时间点观察生物膜形成,扫描电镜结果显示培养6 h和12 h两种菌株形成生物膜无明显差异,培养24 h后发现ComD缺陷菌形成的生物膜中细菌定植较少且生物膜孔隙大而疏松。结论与标准菌株相比,ComD基因缺陷的变异链球菌在成熟初期生物膜表型有明显缺陷,因此ComD基因可以作为防治龋病的靶点之一。     

LuxS基因缺陷对变形链球菌生物膜形成的影响

目的观察LuxS基因缺失后变形链球菌生物膜成熟初期的变化情况。方法通过扫描电镜观察标准菌和缺陷菌在不同营养环境中生物膜成熟初期的形成情况。结果对不同营养环境中形成的生物膜观察,发现在富含蔗糖的环境中,缺陷菌成熟初期的生物膜形成能力较标准菌弱。结论 LuxS基因缺失后变形链球菌在蔗糖环境中生物膜形成的能力减弱。     

材料表面特征对生物膜形成的影响及其应用

生物膜是微生物细胞粘附于材料表面的群体性生长方式。在实践应用中,有目的地调控微生物在材料表面的成膜进程具有重要意义。本文概述了生物膜在材料表面的形成机制及其影响因素,综述了材料表面的电荷特征、亲疏水性、形貌模式和功能性化学修饰等物化特性对细胞粘附和生物膜形成的影响,并介绍了目前在不同实际应用场景中抑制成膜和促进成膜材料的研发现状。     

氯己定联合联苯苄唑对念珠菌的协同抗菌活性

本文用两种方法评价了联苯苄唑与氯己定联用对临床分离念珠菌的抑菌活性。微量液基稀释法显示,氯己定单独作用于念珠菌时,对念珠菌没有明显的抑制作用,最低抑菌浓度均大于16μg/mL;与联苯苄唑联合应用时,对17株念珠菌均表现为协同抑菌作用。纸片扩散法也观察到,含氯己定和联苯苄唑的纸片对4种念珠菌均能产生直径大于单药纸片的抑菌圈。结果显示,联苯苄唑联合低浓度氯己定对多种念珠菌具有协同抑菌作用。     

青蒿琥酯对铜绿假单胞菌生物膜形成及结构的影响

建立体外铜绿假单胞菌生物膜(biofilm BF)模型,探讨青蒿琥酯(artesunate)对生物膜的影响。分光光度法测定青蒿琥酯对铜绿假单胞菌浮游菌生长的影响。选取铜绿假单胞菌野生株(PAO1)建立生物膜模型,设立对照组、青蒿琥酯组、环丙沙星(ciprofloxacin)组。结晶紫染色后测定570 nm波长光密度值,以观察6 h时细菌粘附情况;建模3 d后经不同浓度的青蒿琥酯或环丙沙星处理后利用平板稀释计数法计算活菌数;利用激光扫描共聚焦显微镜成像技术(confocal laser scanning microscopy,CLSM)结合生物膜定量分析软件COMSTAT对生物膜的单位面积生物量、平均厚度、粗糙系数、平均扩散距离进行定量分析。研究显示青蒿琥酯对铜绿假单胞菌浮游菌无明显抑制作用。建模3 d后,生物膜经不同浓度的青蒿琥酯干预12 h后,512μg/m L、1 024μg/m L组生物膜内的活菌数分别为(6.99±0.21)、(6.45±0.19)log10 CFU/m L,与对照组相比,差异有统计学意义(p0.05)。青蒿琥酯组(512μg/m L)和环丙沙星组在6 h时细菌粘附性显著下降,与对照组相比有统计学差异(p0.05)。与对照组相比,经青蒿琥酯和环丙沙星处理后生物膜生物量、平均厚度以及平均扩散距离等结构指标数值都有明显减少(p0.05);青蒿琥酯组粗糙系数增加(p0.05),环丙沙星组粗糙系数无明显变化(p0.05),但这两组的粗糙系数对比有统计学差异(p0.05)。该研究表明青蒿琥酯能够降低铜绿假单胞菌粘附性及破坏成熟生物膜结构。     

大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及结构定量化分析

目的利用激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）观察大蒜素对铜绿假单胞菌PA01菌株生物膜（biofilms,BF）形成过程的影响,并用ISA（Image Structure Analyzer）软件对BF结构进行定量化分析。方法体外建立1d．3d和7d组PA01菌株BF模型,每组分3小组,分别用生理盐水、大蒜素128μg／mL、大蒜素10μg／mL作用6h。通过荧光探针SYT09／PI标记,利用CLSM进行动态观察,并用ISA软件对其BF结构进行定量分析。结果（1）生理盐水对照组铜绿假单胞菌生物膜厚度随时间的增加而增加,但在后3d增加的速度减慢;同时区域孔率（Areal Porosity,AP）呈下降趋势,平均扩散距离（Average Diffusion Distance,ADD）有逐渐增加趋势,结构熵（Textural Entropy,TE）有增加的趋势。（2）7d组模型中,大蒜素128μg／mL作用后,BF厚度由（28．83±0．67）μm减低到（16．50±0．69）μm;AP由0．76±0．10增加到0．92±0．02;TE由6．78±0．93减低到5．61±0．55。10μg／mL大蒜素干预后,有同样趋势,但效应不如高浓度明显。（3）1d、3d模型组,大蒜素作用后同对照组相比,厚度、AP、TE的差异均有统计学意义,趋势同7d组。结论通过ISA软件对干预前后的BF进行结构定量分析,大蒜素对各个时间段BF的形成均有影响,高浓度效果更显著。