评价ITS、BenA和CaM序列分析在曲霉菌种鉴定方面的应用

目的评价内转录间隔区(ITS)、β-微管蛋白基因(BenA)和钙调蛋白基因(CaM)序列分析技术对曲霉的鉴定能力。方法对169株曲霉临床分离株分别进行ITS、BenA和CaM序列测定,并在Genbank数据库中进行比对分析以获得其菌种鉴定信息。结果 169株曲霉经ITS、BenA和CaM序列分析分别有52.7%、66.3%、97.6%菌株鉴定至种水平,47.3%、33.7%、2.4%菌株鉴定至属水平,3个序列对曲霉均不存在无法鉴定情况。结论 ITS、BenA和CaM均可用于曲霉菌种鉴定,其中以CaM的鉴定能力最强。     

应用反向线点杂交技术鉴定临床常见曲霉属和毛霉目真菌

目的应用反向线点杂交技术(reverse line blot hybridization,RLB)快速鉴定临床常见的曲霉属和毛霉目真菌。方法收集我院真菌和真菌病研究中心保存的5种曲霉菌(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉)和7种毛霉目真菌(冻土毛霉菌、总状毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、伞状犁头霉),共计98株菌株。利用真菌通用引物ITS1和ITS4对菌株进行PCR扩增,用12个真菌种特异性探针与扩增后产物进行反向线点杂交。将RLB结果与真菌传统形态学鉴定结果、ITS区DNA测序结果进行比较。结果 RLB可以正确鉴定98株实验菌株,与形态学方法和ITS区测序方法鉴定结果100%一致,种特异性探针之间未见交叉杂交,显示出该方法的高度敏感性和特异性。8株阴性对照菌株(白念珠菌、茄病镰刀菌、尖端赛多孢、马尔尼菲青霉、疣状瓶霉、棒曲霉、日本曲霉以及雅致小克银汉霉),使用RLB方法无法鉴定。通过烟曲霉基因组DNA浓度10倍倍比稀释法验证RLB的敏感性为1.8×10-3 ng/μL。结论 RLB技术为实验室早期快速诊断、鉴定临床常见的曲霉属和毛霉目真菌提供参考。     

MALDI-TOF MS对临床侵袭性丝状真菌的快速鉴定技术的研究

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在临床常见丝状真菌鉴定中的应用价值。方法收集2017年4月—2019年7月本院各种类型临床标本中分离培养的65株丝状真菌,以及某三甲医院惠赠的26株丝状真菌。这91株丝状真菌通过传统形态学鉴定、DNA测序及MALDI-TOF MS鉴定方法后,以DNA测序结果为标准,与另外2种方法的鉴定结果进行统计学比较,评价MALDI-TOF MS在临床丝状真菌鉴定上的应用。结果在28℃和35℃条件下培养的菌株经质谱仪鉴定后,χ~2检验显示P0.05,提示培养温度差异对结果的影响无统计学意义;以DNA测序结果为金标准,传统形态学方法的正确鉴定率为81.3%(74/91),而基于MALDI-TOF MS技术的正确鉴定率可达97.8%(89/91);研究中,使用"甲酸乙腈提取法"提取蛋白后,丝状真菌质谱鉴定的正确率为90.1%(82/91),而"磁珠研磨法"提取蛋白后的质谱鉴定率则为97.8%(89/91)。结论临床常规工作中使用质谱仪鉴定常见丝状真菌时,培养温度不会影响质谱鉴定结果;改良"磁珠研磨法"提取蛋白后质谱仪鉴定的正确率优于质谱仪推荐"甲酸乙腈提取法";MALDI-TOF MS技术在常见丝状真菌的鉴定上,相比于传统形态学鉴定,该技术更快速、客观、高效及准确。     

ITS序列分析与MALDI-TOF MS质谱技术在丝状真菌鉴定中的应用

丝状真菌常用的鉴定方法为形态方法和基因鉴定方法,前者限于检验人员的知识和技能,后者操作繁琐,费用略昂贵,不适合常规开展。因此,寻找丝状真菌快速鉴定方法势在必行。本文采用VITEK MALDI-TOF MS（基质辅助激光解析电离时间飞行质谱）IVD数据库（3.0版本）对临床分离的254株丝状真菌进行鉴定,并以ITS（internal transcribed spacer 内转录间隔区）序列分析为标准,验证MALDI-TOF MS质谱技术鉴定丝状真菌的准确性。结果表明MALDI-TOF MS质谱技术可以对大部分丝状真菌实现快速、准确的鉴定,其中对毛癣菌属（100%）、毛孢子菌属（100%）、毛霉菌属（100%）、曲霉菌属（96.5%）准确率很高,对犬小孢子菌（75%）、镰刀菌属（50%）、新月弯孢霉（46.2%）准确率较低,对丝状真菌鉴定的总体准确率为86.36%,与ITS测序分析符合率为83.97%。     

培养条件对克柔念珠菌MALDI-TOF MS鉴定结果的影响分析

目的探究不同的培养时间、培养温度、培养基种类及培养气体环境对克柔念珠菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)鉴定结果的影响。方法收集中国侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)2012-2013年中17所医院克柔念珠菌25株,每株菌平行接种在沙堡弱氯霉素琼脂平板(SDA-C)、血琼脂平板等6种培养基,28℃和35℃2种孵育温度,空气和5%CO_2 2种气体环境中孵育,以真菌rDNA ITS测序为金标准,孵育24 h和48 h后,使用Vitek MALDI-TOF质谱仪(简称Vitek MS)和Bruker Autoflex Speed型MALDI-TOF质谱仪(简称Bruker MS)分别进行菌种鉴定,并对其鉴定正确率进行分析。结果克柔念珠菌孵育24 h和48 h时Vitek MS鉴定正确率均为100%,Bruker MS鉴定正确率分别是98.86%和87.43%。28℃SDA-C上生长的克柔念珠菌种水平鉴定准确率较35℃生长的菌株高。比较各种培养基,孵育48 h时SDA-C上生长的克柔念珠菌Bruker MS鉴定正确率(100%)最高。结论克柔念珠菌接种在SDA-C上,28℃空气培养24 h质谱鉴定效果最佳。常规细菌培养基上生长的克柔念珠菌,Bruker MS鉴定分值≥1.700即可认为菌种鉴定可靠。     

真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值评价

目的 对真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值进行评价.方法 收集中山大学附属第一医院2012年1月至2012年8月间分离的丝状真菌11株,使用真菌通用引物Its1和Its4采用PCR法扩增核糖体基因,对PCR产物进行序列测定,将测序结果与GenBank中已知标准或临床菌株DNA序列比对,确定丝状真菌的菌种;同时与传统形态学鉴定方法进行比较,从而对真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值进行评价.结果 从DNA提取到序列测定结束,在2个工作日内即可完成.所有菌株均测序成功,测序结果与GenBank中的序列比对,烟曲霉、杂色曲霉、橘青霉、溜曲霉可以鉴定到种;黄曲霉和米曲霉、阿姆斯特丹散囊菌和冠突散囊菌由于高度同源性无法区分鉴定到种.结论 利用真菌通用引物Its1和Its4结合PCR技术和测序技术,可快速、准确将大部分丝状真菌鉴定到种.     

临床罕见曲霉菌属的研究进展

全世界每年有超过20万例危及生命的曲霉病感染,其中以烟曲霉感染最为多见。近年来,分子技术的进步发现曲霉病也可以由表型与烟曲霉相似,遗传上截然不同的新菌种引起。临床上,超过20%的曲霉分离株是未被识别的或不常见的菌种,我们称其为罕见曲霉菌种。越来越多侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)的病例报道与它们相关。这些菌种表现出与烟曲霉不同的毒力和药物敏感性,其临床菌株基因组序列和表型图谱的缺乏,导致其研究受到阻碍。本文就临床罕见曲霉菌属的流行病学、鉴定方法、药敏情况等方面进行文献综述。     

烟曲霉rRNA基因ITS区的克隆测序分析

对烟曲霉rRNA基因内转录间区(ITS区)进行了克隆测序,并将之与其他几种常见曲霉的相应序列进行了比较.发现3株烟曲霉的ITSⅠ区完全相同,而其中1株烟曲霉的ITSⅡ区与一条已知相应序列仅有2个碱基的变异.提示烟曲霉rRNA基因的两个ITS区序列均十分保守,而且与黄曲霉、黑曲霉、土曲霉及构巢曲霉的相应序列相比较,均有一定程度的变异.     

口腔黏膜真菌鉴定方法的比较

比较常见用于黏膜真菌菌种鉴别的多种方法,探寻最佳的鉴别方法。采集230例普通人群口腔黏膜样本,分别用玉米吐温-80培养观察厚膜孢子法、糖发酵生化反应法、CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法、ITS基因的PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)法、ITS测序菌种鉴定法,鉴别真菌各菌株。结果显示:有56例菌株至少通过1种方法检出真菌;玉米吐温-80分离培养假丝酵母菌37株;50例菌株ITS基因测序共鉴定出8个菌种,白假丝酵母菌(C.albicans)29株,近平滑假丝酵母菌(C.parapsilosis)10株,热带假丝酵母菌(C.tropicalis)5株,Candida metapsilosis 1株,Lodderomyces elongisporus 1株,克柔假丝酵母菌(Candida krusei)1株,乙醇假丝酵母菌(C.ethanolica)1株,季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)2株;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法鉴定出3种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌;PCR-RFLP法检出5种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、季也蒙毕赤酵母菌、克柔假丝酵母菌,与基因的测序鉴定一致率为91%;糖发酵生化反应法阳性标本占被检出真菌例数的46.4%(26/56)。结果表明:ITS基因的测序法可以准确鉴定真菌各个菌种;PCR-RFLP法能鉴定常见的菌种,但操作繁琐;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法能快速准确鉴别3种常见假丝酵母菌菌种;玉米吐温-80可以准确培养鉴别白假丝酵母菌;糖发酵生化反应法,缺乏足够的敏感度和特异性,难以准确鉴别各个菌种。     

口腔念珠菌基因多态性检测

目的检测正常人群口腔念珠菌基因型,以了解口腔念珠菌基因多态性。方法采集162例正常人群口腔样本,用念珠菌显色培养基(CHROM agar)进行菌种分离培养鉴定,用玉米Tween80培养基进行真菌孢子形态学检查鉴定,随机抽取45个菌株样本进行内含子转录间隔区(internal transcribed spacer region,ITS)序列检测,并比对同源性,建立进化树,观察菌株进化分支情况。结果分离培养出念珠菌菌株57株(57/162,35.2%),其中白色念珠菌(Candida albicans)36株(36/57,63.1%)。进行ITS序列检测的45个菌株申请GenBank序列注册号为FJ697166-GQ280292。结论正常人群口腔念珠菌基因具有多态性。     

实时荧光重组酶聚合酶扩增快速检测临床常见曲霉菌方法的建立

目的:针对曲霉菌属转录间隔区ITS1设计引物、探针,利用实时荧光重组酶聚合酶扩增(Real-time RPA)技术建立一种快速、准确、经济的临床常见曲霉菌检测鉴定方法。方法:利用建立的实时荧光重组酶聚合酶扩增体系对标准菌株及临床标本提取的DNA进行扩增,验证该方法的性能。结果:本研究针对曲霉菌属转录间隔区ITS1设计引物、探针利用RPA试剂盒(荧光型)建立了Real-time RPA扩增体系,在15分钟内即可检测出临床常见的四种曲霉菌;特异性试验结果显示反应体系只对烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉四种曲霉呈现出明显的扩增曲线,而其它细菌和真菌均无扩增曲线。灵敏性试验显示最低检出限为10-3 ng/μL。临床验证试验的12份曲霉菌均有较高的扩增效应。结论:本研究建立的Real-time RPA方法能快速、特异、灵敏地检出烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等临床常见曲霉菌,为曲霉菌的快速、现场检测提供了一种新的思路。     

一株Monacolin K高产菌株生理特性

根据丝状真菌的常用鉴定方法,对实验室保存的一株Monacolin K高产菌株进行形态和生理特性实验。结果表明该菌株属于真菌门(Eumycophyta)、子囊菌纲(Asomycetes)、真子囊菌亚纲(Eurotiaceae)、曲霉目(Eurrotiales)、曲霉科(Eurotiaceae)、红曲霉属(Monascus)。     

MADLI-TOF MS自建库在马尔尼菲篮状菌快速鉴定中的应用

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MADLI-TOF MS)自建库对临床分离马尔尼菲篮状菌快速鉴定的能力。方法收集广州、玉林、防城港3个地区临床分离的马尔尼菲篮状菌,通过ITS区扩增测序进行菌种准确鉴定。菌株通过微型玻璃珠研磨结合甲酸/乙腈提取法预处理。通过采集建库菌株不同时间点、不同平板上菌丝相和酵母相菌落的质谱数据,建立包含马尔尼菲篮状菌超级图谱的自建库;并用非建库的马尔尼菲篮状菌及临床常见的真菌评估建立的自建库。结果建立了包含具有39个特征峰的马尔尼菲篮状菌超级图谱的自建库;用于评估的菌株均被鉴定到种,准确率为100%。结论 MADLI-TOF MS建立的马尔尼菲篮状菌自建库能够对于临床马尔尼菲篮状菌进行快速、准确的鉴定。     

采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定曲霉属Flavi组和Fumigati组的一些种（英文）

一些曲霉是主要的食物腐败菌及人的病原体,特别是免疫系统受损的病人可能导致严重的感染。本研究评价了利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对一些临床和环境中重要的Flavi组和Fumigati组曲霉,进行鉴定的可能性,并将结果与形态学及测序结果(ITS区和部分-tubulin和钙调蛋白基因)进行比较分析。通过曲霉中34个Flavi组菌株和30个Fumigati组菌株的质谱分析,来建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的数据库。对光谱数据进行聚类分析表明Fumigati组的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的结果与系统发育结果完全一致;Flavi组的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法将A.flavus,A.oryzae,A.sojae和A.parasiticus分开的效果比测序方法好。随后,再选取用于验证数据库的50个菌株中49个(98%)菌株用质谱数据得到正确鉴定。对于分离本研究中曲霉的隐形种,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法优于测序方法。这种方法可以用于曲霉临床实验室鉴定的标准方法,因为临床需要快速和稳定的鉴定方法,这对于适当的治疗方案的选择很重要,此方法同样适于环境研究工作。     

荧光物质(MFA、MFB)的分离、结构鉴定及金华地区高产菌株的筛选

采用硅胶柱层析及制备型液相色谱仪对红曲米中两种荧光物质进行分离纯化,使用高效液相色谱法(HPLC)检测荧光物质纯度,然后使用高分辨质谱(ESI-HRMS)对两种荧光物质进行分析,得到两种荧光物质的分子量分别为356和384,ESI-MS/MS二级质谱把两者鉴定为monasfluore A (MFA)和monasfluore B (MFB);从金华地区红曲米中分离得到10株红曲菌株,经固态发酵采用HPLC法分析,筛选获得1株高产MFA、MFB的菌株WZWZ,该菌株发酵制得红曲米中MFA含量为3.63 g/kg,MFB含量为7.29 g/kg,对WZWZ菌株进行外观形态学及显微观察、ITS基因序列测定与分析,最终将菌株WZWZ鉴定为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。     

39株指/趾甲分离黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌种鉴定和抗真菌药物敏感性

目的对来自伊朗马什哈德地区(Mashhad, Iran)甲真菌病患者指/趾甲分离的39株黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌株进行菌种鉴定及抗真菌药物敏感性研究。方法菌种鉴定采用β-tubulin/calmodulin基因测序的分子鉴定联合MALDI-TOF质谱鉴定;体外药物敏感性试验参照CLSI M38-A3方案检测包括特比萘芬、新三唑类药物、棘白菌素类等10种抗真菌药物。结果基于形态学鉴定的39株黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌株中,分子鉴定结果表明38株为Aspergillus flavus(A.flavus)/Aspergillus oryzae(A.oryzae),1株为Aspergillus minisclerotigenes(A.minisclerotigenes)。对38株分子鉴定为A.flavus/A.oryzae菌株采用MALDI-TOF质谱鉴定结果为A.flavus,而MALDI-TOF质谱错误鉴定同形菌种A.minisclerotigenes为A.flavus。抗真菌药物敏感性结果表明,特比萘芬、泊沙康唑和棘白菌素类药物对黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌种均具有抗真菌活性。结论分子鉴定联合MALDI-TOF质谱鉴定可准确鉴定黄曲霉复合体菌株到菌种水平,特别是分子鉴定不能区分A.flavus/A.oryzae,而MALDI-TOF鉴定可将二者区分。完善参考菌种数据库是MALDI-TOF质谱准确鉴定的关键。特比萘芬、泊沙康唑和棘白菌素类药物可作为治疗黄曲霉复合体(Aspergillus section Flavi)菌种所致甲真菌病的潜在有效药物。     

一株与血红铆钉菇相关的青霉属菌株的分离与鉴定

目的:鉴定一株从采自北京市房山区的野生血红铆钉菇中分离得到的丝状真菌,分析其遗传地位,为进一步研究该菌株与血红铆钉菇的关系奠定基础。方法:以血红铆钉菇为材料,进行了组织分离,获得1株丝状真菌菌株,编号为JZB2120006,对其进行了形态学鉴定,并提取了基因组DNA,进行了ITS片段的扩增、测序及系统发育分析。结果:分子生物学鉴定结果表明,该菌株与Penicillium sclerotiorum ZZ07-5菌株有99.3%的同源性。结论:结合形态学特征将该菌株鉴定为P.sclerotiorum,ITS基因序列GenBank登录号为KC594044。     

Sensititre YeastOne显色药敏板与微量肉汤稀释法检测曲霉体外抗真菌药物敏感性的一致性研究

目的评估显色药敏板Sensititre YeastOne与微量肉汤稀释法检测曲霉体外抗真菌药物敏感性的一致性。方法使用同样的孢子悬液按照CLSI M38-A2微量肉汤稀释法和Sensititre YeastOne YO10对307株曲霉进行体外抗真菌药物敏感性试验,计算两种药敏方法结果间的基本一致性、分类一致性以及错误率。结果 CLSI M38-A2药敏试验显示98.4%(302/307)曲霉菌株对测试的6种抗真菌药物持野生型状态,Sensititre YeastOne则检出97.1%(298/307)菌株为野生型。除伊曲康唑外,其余5种抗真菌药物在Sensititre YeastOne与CLSI M38-A2间的基本一致性均90%。两种方法在曲霉药物敏感性检测的分类一致性为98.1%(301/307),极显著错误率为0.3%(1/307),显著错误率为1.6%(5/307)。结论Sensititre YeastOne在检测曲霉体外药物敏感性方面与CLSI方法一致性良好,可用于临床实验室曲霉体外药敏检测。     

MALDI-TOF MS技术在侵袭性丝状真菌快速鉴定中的应用

目的 探索不同培养基、不同培养时间和不同蛋白质提取方法对侵袭性丝状真菌质谱鉴定准确率的影响,旨在提高基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术鉴定侵袭性丝状真菌的准确率。方法 采用分子生物学方法为金标准,同时运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对所收集临床丝状真菌进行鉴定。根据分子生物学的鉴定结果,去除VITEK-MS v3.0数据库中没有的菌株,其余菌株接种在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和察氏培养基(CA)3种不同的培养基中,采用2种不同的蛋白质提取方法(甲酸乙腈法和磁珠法),获得了不同培养时间点(2、3、5、7和9 d)的特异性质谱指纹图谱。结果 不同丝状真菌蛋白质提取方法进行比较,甲酸乙腈法总鉴定准确率为79.8%,磁珠法总鉴定准确率为77.5%,2种丝状真菌蛋白质提取方法的质谱鉴定准确率差异无统计学意义(χ²=1.040,P=0.308)。不同培养基进行比较,SDA培养基总鉴定准确率为90.7%,PDA培养基总鉴定准确率为81.4%,CA培养基总鉴定准确率为67.4%,3种不同培养基的丝状真菌质谱鉴定准确率差异有统计学意义(χ     

烟曲霉再鉴定、标准化CSP分型及体外药物敏感性

目的 了解烟曲霉复合体临床株菌种分布,经典烟曲霉临床株CSP基因型及对常见抗真菌药物敏感性状况.方法 菌株来源:北京大学真菌和真菌病研究中心保存分离自125名患者的162株烟曲霉复合体菌株.通过形态学,最高生长温度及分子生物学测序分步鉴定;对CSP基因进行扩增、测序,采用国际化命名体系进行CSP分型;采用微量液基稀释法测定经典烟曲霉对伊曲康唑(ITC)、两性霉素B(AMB)、伏立康唑(VRC)及卡泊芬净(CAS)的敏感性.结果 所有烟曲霉复合体菌株均为经典烟曲霉;共分为16个CSP基因型,最常见为t04A、t03和t01;分离自4名患者的13株菌对ITC的MICs≥4 μg/mL,其中2株菌AMB和VRC的MICa分别为4μg/mL和16 μg/mL.CAS的MECs最高为4μg/mL,仅1株.结论 未检出烟曲霉相关新种;经典烟曲霉临床株共16个CSP基因型,分布与国际研究结果基本一致,其中5个为新型.我国经典烟曲霉临床株ITC耐药率为3.2％,个别菌株AMB,VRC和CAS耐药.