MALDI-TOF MS对临床侵袭性丝状真菌的快速鉴定技术的研究

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在临床常见丝状真菌鉴定中的应用价值。方法收集2017年4月—2019年7月本院各种类型临床标本中分离培养的65株丝状真菌,以及某三甲医院惠赠的26株丝状真菌。这91株丝状真菌通过传统形态学鉴定、DNA测序及MALDI-TOF MS鉴定方法后,以DNA测序结果为标准,与另外2种方法的鉴定结果进行统计学比较,评价MALDI-TOF MS在临床丝状真菌鉴定上的应用。结果在28℃和35℃条件下培养的菌株经质谱仪鉴定后,χ~2检验显示P0.05,提示培养温度差异对结果的影响无统计学意义;以DNA测序结果为金标准,传统形态学方法的正确鉴定率为81.3%(74/91),而基于MALDI-TOF MS技术的正确鉴定率可达97.8%(89/91);研究中,使用"甲酸乙腈提取法"提取蛋白后,丝状真菌质谱鉴定的正确率为90.1%(82/91),而"磁珠研磨法"提取蛋白后的质谱鉴定率则为97.8%(89/91)。结论临床常规工作中使用质谱仪鉴定常见丝状真菌时,培养温度不会影响质谱鉴定结果;改良"磁珠研磨法"提取蛋白后质谱仪鉴定的正确率优于质谱仪推荐"甲酸乙腈提取法";MALDI-TOF MS技术在常见丝状真菌的鉴定上,相比于传统形态学鉴定,该技术更快速、客观、高效及准确。     

格特隐球菌在河北地区引起1例脑膜炎的临床与实验研究

目的报道1例我国河北地区由格特隐球菌引起的脑膜炎,并对该菌进行试验研究。方法将分离自患者脑脊液中的隐球菌分别接种于Chromagar显色培养基和刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝(CGB)培养基35℃培养,使用API 20C AUX、全自动微生物鉴定仪Vitek 2 Compact、生物梅里埃基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)、r DNA ITS和IGS序列分析等方法对该菌进行菌种鉴定,并使用ATB FUNGUS 3进行抗真菌药敏试验。结果该菌在显色培养基上35℃培养48 h后为白色略带粉色菌落,在CGB培养基35℃培养5 d后使CGB培养基由黄色变为蓝色。API 20C AUX、Vitek 2 Compact和MALDI-TOF MS的鉴定结果均为新生隐球菌,r DNA ITS和IGS序列分析均提示该菌为格特隐球菌。5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑对该菌的最小抑菌浓度分别是≤4μg/m L、≤0.5μg/m L、≤1μg/m L、≤0.125μg/m L、≤0.06μg/m L。结论 CGB培养基、r DNA ITS和IGS序列分析能够区分新生隐球菌和格特隐球菌,应重视格特隐球菌的分离鉴定。     

BD Phoenix^TM酵母菌鉴定板对临床分离酵母菌鉴定能力的评估

目的 评估BD Phoenix^TM酵母菌鉴定板对酵母菌的鉴定能力.方法 选取白念珠菌18株,热带念珠菌22株,光滑念珠菌19株,克柔念珠菌8株,近平滑念珠菌20株,新生隐球菌14株,季也蒙念珠菌4株,平常念珠菌1株,葡萄牙念珠菌1株,头状地霉2株,挪威念珠菌1株,链状念珠菌1株,乳酒念珠菌1株,希木龙念珠菌1株,解脂念珠菌3株,皱褶念珠菌1株,菌膜念珠菌3株,共计120株.借助Phoenix^TM 100全自动微生物鉴定仪,使用BD Phoenix^TM酵母菌鉴定板鉴定上述菌株.用真菌通用引物ITS1与ITS4对所有受试菌株的rDNA进行PCR扩增,对PCR产物进行序列测定、分析并作为金标准与BD Phoenix^TM酵母菌鉴定板的结果比较,同时使用MALDI-TOF MS质谱分析对试验菌株进行菌种鉴定.结果 BDPhoenix^TM酵母菌鉴定板除了对1株挪威念珠菌、1株平常念珠菌、1株解脂念珠菌、1株皱褶念珠菌未能鉴定以及1株链状念珠菌、1株克柔念珠菌、2株菌膜念珠菌、1株解脂念珠菌鉴定错误外其余试验菌株鉴定均正确,鉴定准确率为92.5％.所有鉴定结果均在17 h内获得,而白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌的鉴定时间均小于6h,并且不受推荐培养基的限制.所有菌株MALDI-TOF MS的鉴定结果与其rDNA ITS序列分析的结果完全一致.结论 BD Phoenix^TM酵母菌鉴定板对多数酵母菌能够快速准确地鉴定到种,但对某些少见酵母菌的鉴定能力有待进一步考证.     

细菌产纤维素酶和脂肪酶固体培养基及接种和培养时间的研究

为准确鉴定和筛选产纤维素和脂肪酶细菌，通过平板扩散法测定不同氮源培养基对细菌产纤维素酶和不同碳源培养基对细菌产脂肪酶活性的影响，确定细菌产纤维素酶和脂肪酶的最佳培养基，利用最佳培养基研究不同琼脂含量、海水和淡水溶剂、菌种的培养时间及接种后的培养时间对细菌纤维素酶和脂肪酶活性的影响。结果表明，以蛋白胨为氮源的A培养基为细菌产纤维素酶最佳培养基，以Tween-20为碳源的培养基为细菌产脂肪酶最佳培养基；培养基中琼脂的最佳用量均为13‰；所有菌株在海水培养基上产生的纤维素酶活性比淡水培养基上高，但脂肪酶活性并非如此；鉴定和筛选产纤维素酶和脂肪酶细菌接种菌种的最佳培养时间分别为18 h和24~32 h，测定细菌产纤维素酶和脂肪酶的最佳培养时间分别为48~72 h和120 h。     

用印片法制青霉和曲霉的永久封片

(一)材料和方法 1.菌种:青霉(Penicillium chrysogenum),黑曲霉(Aspergillus niger) 2.培养:将青霉和黑曲霉斜面制成悬液,吸0.1ml于马铃薯培养基(马铃薯200克,蔗糖20克,琼脂粉11克,水1000毫升,15磅/吋~2灭菌30分钟)平板上涂布,于28℃培养2天。 3.制片:取两块干净载玻片,在其中一块上涂一层薄胶层(胶为光学树脂),然后用解剖针在青霉或曲霉平板上挖一小块带菌琼脂(约0.5厘米~2),将琼脂块放在薄胶层上(培养面朝下),用另一块载玻片在琼脂块上轻轻按压,然后将琼脂块小心弃去。将印有菌迹的载玻片     

微量肉汤稀释法比较分析不同培养时间念珠菌属对唑类药物的敏感性

目的探讨微量肉汤稀释法检测念珠菌属对唑类药物的体外敏感性时,培养24h和48h读取MIC值的差异。方法微量肉汤稀释法检测653株念珠菌对氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的体外药物敏感性,分别于24h和48h读取MIC值,比较不同孵育时间所得MIC总一致率(EA)、敏感性判定一致率(CA)及敏感性判定错误率(Error)。结果绝大多数念珠菌培养24h能够生长充分并进行MIC值读取;孵育24h和48h读取MIC值总EA较好,分别为:氟康唑(91.9%),伏立康唑(92.0%),伊曲康唑(95.6%);CA分别为氟康唑(96.9%),伏立康唑(90.4%),伊曲康唑(88.2%),不同菌种类型CA有差异;未发现极严重错误(VME)的结果,错误多为一般错误(MiE),653株菌敏感性判定错误率ME/MiE分别为氟康唑(1.7%/2.9%)、伏立康唑(2.0%/10.6%)和伊曲康唑(1.5%/13.0%)。结论微量肉汤稀释法检测念珠菌属对唑类药物体外敏感性时,孵育24h与48h MIC值一致率较好,24h读取MIC值可缩短药敏报告时间,减少拖尾现象导致的判读错误。     

樱桃的离体培养

植物名称:甜樱桃(Prunus avium)。材料类别:纳翁(Napo leon)、大紫(BlackTartarin)、保加利亚品种两个(、xespyc)、红灯等品种的茎尖及侧芽。培养条件:基本培养基为MS。①芽分化培养基每升附加BA0.5—1.0毫克;吲哚乙酸0.2毫克;蔗糖30克。②生根培养基为1/2 MS(大量元素),其它成分同MS培养基,每升附加吲哚乙酸1—3毫克;蔗糖 20克;琼脂 5克。③培养条件:25±2℃,光照强度1500lx;24小时光照。生长与分化情况:接种10天后即可见到茎尖明     

都柏林念珠菌的鉴定及与白念珠菌3种表型鉴别方法的研究

目的 从临床分离的念珠菌中进一步鉴定都柏林念珠菌,并评价3种表型鉴别白念珠菌和都柏林念珠菌的方法.方法 对17株临床分离并初步鉴定的白念珠菌和1株ATCC白念珠菌标准株,采用PHR1同源序列PCR法检测,鉴定出其中的都柏林念珠菌;分别采用45℃生长试验、YEPD(1%酵母浸膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖)液基39℃芽管生成试验、Staib琼脂(鸟食琼脂)厚壁孢子形成试验对两种菌的表型特点进行比较.结果 17株临床分离的白念珠菌中有3株鉴定为都柏林念珠菌;45℃时,两种菌在改良沙堡弱琼脂上均无明显生长,YEPD液基中仅有1株白念珠菌生长良好;YEPD液基39℃培养2种菌均无芽管生成;Staib琼脂培养72h,3株都柏林念珠菌中有2株可形成厚壁孢子,而白念珠菌则无,与PHR1同源序列检测结果基本一致.结论 PHR1同源序列检测是鉴别都柏林念珠菌与白念珠菌的可靠方法,Staib琼脂厚壁孢子形成试验有助于鉴别两菌,45℃生长试验和YEPD液基39℃芽管生成试验则不能有效鉴别两菌.     

10种中药提取物抗念珠菌体外药敏实验

目的观察10种中药提取物对念珠菌体外抗菌效果。方法参照CLSI的M27-A3方案,采用微量液基稀释法,检测10种中药提取物抗念珠菌的作用。结果 10种中药提取物中白念珠菌对三七总皂甙、人参茎叶总皂甙较敏感,24h MIC均为62.5μg/mL,48h MIC均为125μg/mL;24h时克柔念珠菌对三七总皂甙和柠檬酸较敏感,MIC均为1.96μg/mL,48h时克柔念珠菌对三七总皂甙较敏感,MIC为31.25μg/mL;近平滑念珠菌对人参茎叶皂苷和麝香草酚较敏感,24h MIC均为3.91μg/mL,近平滑念珠菌在48h对人参茎叶皂甙较敏感,MIC为15.63μg/mL。结论三七总皂甙、人参茎叶皂甙、柠檬酸和麝香草酚对念珠菌具有一定的抗菌活性,不同中药提取物针对念珠菌不同菌种的抗菌作用存在一定差异。     

HIV感染患者口咽、鼻腔内真菌分离率的调查

目的了解HIV感染者口咽及鼻腔内真菌分离阳性率。方法用无菌拭子采集口咽腔溃疡、白斑、口角炎等和咽颊区黏膜分泌物,鼻腔取下鼻甲黏膜或中鼻道黏膜分泌物,直接接种于1 mL沙堡弱液体培养基中。取该离心沉淀物作真菌直接镜检,并接种于科玛嘉念珠菌显色培养基置37℃培养48 h后鉴定。如为丝状真菌,转种于察氏琼脂。25℃培养1周后根据菌落形态结合镜下结构鉴定菌种。结果 94例HIV感染者在口咽腔中真菌培养阳性62例(66%),分离出65株真菌,在鼻腔中真菌培养阳性48例(51%),分离出57株真菌。结论 HIV感染者免疫功能低下,易继发真菌机会性感染,口咽及鼻腔真菌的高寄居率是HIV侵袭性真菌感染的先兆症状,真菌菌种以白念珠菌比例为最高,口咽及鼻腔分别61%和33%。     

小金海棠叶片的组织培养与快速繁殖

1植物名称苹果(砧木)小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et.Jiang). 2材料类别组培苗. 3培养条件以MS为基本培养基.(1)起始和增殖培养基:MS 6-BA 0.2 mg·L-1(单位下同) IAA0.5 3%蔗糖 6.5 g·L-1琼脂;(2)生长培养基:MS 6-BA 0.6 NAA 0.2 GA3 0.3 3%蔗糖 7 g·L-1琼脂;(3)再生培养基:MS 6-BA 1.0 NAA 1.0 TDZ4.0 3%蔗糖 7 g·L-1琼脂;(4)生根培养基:1/2MS IAA 1.0 3%蔗糖 6 g·L-1琼脂.培养基pH调整至5.8,121℃、0.11 MPa灭菌20 min.培养温度为(25±2)℃,光照时间14 h·d-1,光强为40μmol·m-2·s-1.     

新疆白鲜的组织培养及快速繁殖

1植物名称新疆白鲜(Dictamnus angustifolius),又名狭叶白鲜.凭证标本藏于石河子大学标本室(SHI). 2材料类别无菌苗的顶芽和茎段. 3培养条件 (1)诱导种子萌发的培养基:1/2MS;(2)诱导丛生芽的培养基:MS 6-BA 1.0 mg·L-1(单位下同 NAA 0.1;(3)增殖培养基:MS 6-BA 1.5 NAA 0.1:(4)生根培养基:MS IBA 0.5.上述培养基均附加0.7%琼脂粉、3%蔗糖,pH 5.8.培养温度为24～28℃,光照度1000 lx,光照时间14 h·d-1.     

培养基成分对口腔福赛类杆菌生长影响的研究

目的比较不同培养基成分对福赛类杆菌ATCC43037生长的影响,寻找一种有效促进福赛类杆菌生长的培养基.方法将福赛类杆菌ATCC430 37 接种到5种不同培养基(包括琼脂板和液体培养基)中,在厌氧培养箱内37℃厌氧培养7 d,观察平板上菌落生长情况,在λ=550 nm处每24 h测定液体培养菌液A值.细菌通过革兰染色和PCR法鉴定.结果1.生长在血平板上的福赛类杆菌ATCC43037菌落形态呈粉红色或白色小斑点状,在以BHI 为基础培养基中添加氯化血红素、维生素K3、N-乙酰胞壁酸的No2血琼脂培养基生长最好,而在无氯化血红素、维生素K3及血的No4琼脂板上不生长.2.福赛类杆菌ATCC43037在以TSB 为基础培养基中添加酵母提取物、植物蛋白胨、氯化血红素、维生素K3、N-乙酰胞壁酸和D TT的No1液体培养基生长最好,培养7 d后A值＞0.8,在缺乏N-乙酰胞壁酸的No5液体培养基中几乎不生长.3.菌落细菌革兰染色为G 梭状杆菌,PCR法鉴定为福赛类杆菌.结论福赛类杆菌在血平板和液体培养基中存在不同的生长特性,N-乙酰胞壁酸是福赛类杆菌在液体培养基中生长最重要的成分,DTT有益于细菌生长.     

肠球菌感染性心内膜炎中粪肠球菌毒力因子的作用

肠球菌是革兰阳性球菌。1984年,肠球菌作为一个新的菌属从链球菌属中独立出来,即肠球菌属(enterococcus)。肠球菌营养要求较高,在含有血清的培养基上生长较好。接种血平板35℃孵育18 h后,可形成灰白色、不透明、表面光滑、直径为0.5-1 mm大小的圆形菌落,在血琼脂平板培养基上主     

褐斑伽蓝的组织培养与快速繁殖

1植物名称褐斑伽蓝(Kalanchoe tomentosa). 2材料类别叶片. 3培养条件以MS为基本培养基.诱导无菌培养物培养基:(1)MS 6-BA 1.0 mg·L-1(单位下同) NAA 0.5,(2)MS 6-BA 1.5 IBA 0.5,(3)MS 6-BA1.0 IBA 0.5;继代培养基:(4)MS 6-BA 0.1 NAA0.05.生根培养基:(5)1/2MS IBA 1.0.上述培养基均附加30 g·L-1蔗糖、6 g·L-1琼脂,pH 5.8.培养温度28～30℃,光照时间12 h·d-1,光照度3 000 lx.     

竹蔗组织培养分化出植株简报

1.植物名称:竹蔗(Saccharum sinen-se Roxb Cmend Jesw) 2.材料类别:心叶。 3.培养条件:愈伤组织诱导用MS培养基,每升附加2,4-D3毫克、BA1毫克、蔗糖30克、肌醇100毫克、琼脂2.5克、pH5.8。分化培养基去掉2,4-D,加NAA3毫克。愈伤组织培养温度28℃(±1℃),黑暗。诱导分化时温度25～28℃,每日照光12小时。     

宣威乌头的组织培养与快速繁殖

1植物名称宣威乌头(Aconitum nagarum var.lasiandrum). 2材料类别茎尖及带腋芽的茎段. 3培养条件(1)丛芽诱导培养基:MS 6-BA 4.0mg.L-1(单位下同) NAA 0.2 0.1%活性碳 3.0%蔗糖 0.8%琼脂,固体培养;(2)增殖培养基:MS 2,4-D 0.2 ZT 1.0 GA 3.0 PVP 0.1% 3.0%蔗糖 0.8%琼脂,固体培养;(3)生根培养基:1/2MS大量元素 MS微量元素 铁盐 有机成分 NAA1.0 IBA 0.1 1.5%蔗糖 0.8%琼脂,固体培养7d后,转入不含任何激素的同类培养基中,即二步生根法使其生根.以上培养基pH均为5.8.培养温度为(24±2)℃,光照12 h.d-1,光照度1 500lx.     

阳春砂的组织培养与植株再生

1植物名称阳春砂(Amomum villosum),别名:砂仁. 2材料类别根茎上长出的顶芽. 3培养条件基本培养基为MS.(1)芽生长培养基:MS;(2)诱导丛生芽培养基:MS 6-BA 0.5mg·L-1(单位下同);(3)生根培养基:MS NAA 0.1.上述培养基均加入6 g·L-1琼脂、3.0%蔗糖,pH 5.8.培养温度为25℃左右;日光灯照明,光照时间10 h·d-1,光照度1 000～1 500 lx.     

泽泻的组织培养和快速繁殖

1植物名称泽泻(Alisma orientalis). 2材料类别种子萌发的无菌苗茎尖. 3培养条件(1)种子萌发培养基:MS;(2)不定芽诱导和增殖培养基:MS 6-BA 2.0 mg·L-1(单位下同) KT 0.5 IAA 0.2;(3)壮苗与生根培养基:MS 6-BA 0.1 NAA 0.8.培养基(1)～(3)附加3%蔗糖、0.7%琼脂,pH 5.8～6.0,在121℃下高压灭菌15 min.培养温度为25～28℃,光照时间10h·d-1,光照度为1500 lx.     

百里香的组织培养

1植物名称百里香(Thymus serpyllum var.mongolicus Ronn.)。2材料类别顶芽和腋芽。3培养条件(1)芽诱导培养基:MS基本培养基;(2)增殖培养基:MS 6-BA 1.5 mg·L~(-1)(单位下同) IBA 0.1 0.6%琼脂 3%蔗糖;(3)生根培养基:1/2MS IBA 0.5 0.7%琼脂 2%蔗糖。以上所有培养基均为pH 5.8～6.0,培养温度(24±2)℃,光