圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因-sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约１０ｋｂ的ＤＮＡ片段。对其中１．８ｋｂ的ＰｖｕⅡ－ＳａｃⅡ片段进行了序列分析,结果表明：此片段中含有一个具有１１７０个核苷酸的完整开放阅读框,起始密码子为４４７位的ＡＴＧ,终止密码子为１６１４位的ＴＧＡ,推测其编码一个３８９个氨基酸的蛋白质产物。利用ＢＬＡＳＴＸ程序进行了分析揭示,此基因编码一个肌氨酸单体     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因——sanH和sanI的研究

通过反向遗传学方法克隆到圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因簇中约7.0kb的DNA片段。该片段除含有尼可霉素生物合成基因sanF外,对sanF上游约22kb的BglⅡDNA片段进行序列测定及分析表明,还含有两个完整的开放阅读框(ORF)。ORF1由1233个核苷酸组成,ORF2由195个核苷酸组成,它们分别编码由410个氨基酸残基和64个氨基酸残基组成的蛋白质,依次命名为sanH和sanI。蛋白序列数据库比较结果表明,SanH和SanI与浅灰链霉菌(\%Streptomyces griseolus)\%中共转录的细胞色素P450(cytochrome P450)和铁氧还蛋白(ferredoxin)有较高的同源性,一致性分别为46%和56%,相似性分别为62%和70%。基因功能研究表明,sanH基因的破坏虽不影响圈卷产色链霉菌产生的尼可霉素的生物活性,但该基因可能参与了尼可霉素羟基化反应的生物合成。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因：—sanJ的克隆及功能研究

以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌cosmid基因文库中筛选到１个大约７．５kb的ＤＮＡ片段,交ＤＮＡ片段克隆到载体pBluescripM13-的KpnⅠ位点,得到了重组质粒pNL2200.对pNL2200中外源ＤＮＡ片段进行了一系列的亚克隆及部分核苷酸序列分析。结果表明,２．３kb的SalⅠ－ＢaｍＨⅠＤＮＡ片段中含有１个完整的开放阅读框,起始密码子为２７１位的ＧＴＧ,终止密码子为１９５４位的ＴＧＡ,该基因的大小为１６８６bp,编码１个大小为５６１个氨基酸的蛋白质产物。利用blastx程序的蛋白质数据库中进行同源比较,结果揭示此基因产物与腺苷酸形成酶超家族的连接酶有４４％的一致性,此外,该基因的破坏导致圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成能力的丧失,证明它是尼可霉素生物合成所必需的,命名为其为sanＪ。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因一sanL的结构与功能

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段.序列分析表明此片段中除含有sanK外,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框——sanL.sanL与sanK的转录方向相同,具有1281个核苷酸,起始密码子为345位的ATG,终止密码子为1623位的TGA.利用Blastx程序进行的分析揭示,此基因可能编码一个赖氨酸-2-氨基转移酶.基因功能研究表明,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的.     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因—sanL的结构与功能

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段。序列分析表明此片段中除含有sanK外,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框——sanL。sanL与sanK的转录方向相同,具有1281个核苷酸,起始密码子为345位的ATG,终止密码子为1623位的TGA。利用Blastx程序进行的分析揭示,此基因可能编码一个赖氨酸2氨基转移酶。基因功能研究表明,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanA的克隆、结构和功能

圈卷产色链霉菌是尼可霉素产生菌,经紫外线诱变后,以赤星灰霉为指示菌筛选到遗传稳定的尼可霉素生物合成阻断突变株,选择其中的NBB19为受体,以质粒pIJ702为克隆载体,从野生型圈卷产色链霉菌的DNA文库中克隆到了6kb的DNA片段,能互补NBB19使之恢复尼可霉素的产生能力.对6kbDNA片段中的部分片段进行了序列分析,结果表明2710bpDNA片段包含一个1365bp的完整开放阅读框架,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白质,该基因命名为sanA.蛋白序列数据库比较结果表明,sanA编码的蛋白质氨基酸序列与Pyrococcus horikoshii的甲基转移酶有较高的同源性,353个氨基酸残基中有25%的一致性.用基因破坏策略研究了sanA的功能,野生型菌株sanA基因被破坏后导致失去合成尼可霉素的能力,表明sanA是尼可霉素生物合成中的一个新的重要基因.     

Tn4560在圈卷产色链霉菌中的转座及其在尼可霉素生物合成相关基因克隆中的应用

采用常规转化方法用来自天蓝色链霉菌J1 5 0 1的质粒pUC1 1 6 9(pMT6 6 0∷Tn45 5 6∷vph)多次转化尼可霉素产生菌圈卷产色链霉菌野生型 71 0 0的原生质体 ,均未得到转化子。采用限制性热衰减法于 5 0℃ ,3 0min溶菌制备 71 0 0的原生质体 ,获得了转化子 ,但转化频率极低 ,只有 0 4个转化子 μgDNA。用来自 71 0 0的pUC1 1 6 9再转化不含pUC1 1 6 9的 71 0 0原生质体 ,转化频率提高 1 0 3 ～ 1 0 4 倍。于 3 9℃ ,MM Vio条件下培养携带有pUC1 1 6 9的 71 0 0孢子 ,Tn45 6 0发生转座 ,筛选到 40 6 8个转座菌落 ,并从中得到 8株尼可霉素阻断突变株 ;对这 8株突变株的总DNA进行Southern杂交分析表明 ,Tn45 6 0至少在 4个不同的位点插入到 71 0 0的染色体上。用实验室已获得的与尼可霉素生物合成有关的 3 0kbDNA片段为探针和经不同酶切的 8株突变株的总DNA进行Southern杂交 ,结果表明 ,除阻断突变株Nik5有杂交信号且杂交信号大小均同野生型…     

圈卷产色链霉菌san7324和san7324L基因阻断对形态分化和尼可霉素产生的影响

【目的】圈卷产色链霉菌全局性调控基因wblA阻断突变后,尼可霉素不再产生。RNA-seq和转录分析表明san7324基因在野生型菌株中可以正常转录,而在wblA阻断突变株(ΔwblA)中不能转录,为此本文旨在揭示san7324与尼可霉素产生的关系。【方法】利用同源双交换策略对san7324进行基因阻断,而后通过基因遗传回补及对尼可霉素生物合成相关基因的转录分析等方法研究san7324的功能。【结果】在相同培养条件下,阻断突变株Δsan7324与野生型菌株相比失去了合成尼可霉素的能力。我们通过同源比对发现圈卷产色链霉菌中还存在一个与san7324同源的基因san7324L,该基因的阻断导致尼可霉素产量降低。当san7324和san7324L两个基因同时被阻断后,得到的突变株Δsan7324-san7324L生长稀疏而且不能正常发育分化形成灰色表型的孢子或孢子链,只能形成白色表型的气生菌丝,同时也丧失了合成尼可霉素的能力。当这两个基因(san7324-san7324L)回补双突变株后,则恢复了野生型的表型(能形成孢子链并恢复尼可霉素的产生)。进一步的研究初步表明san7324和san7324L的阻断主要影响了尼可霉素生物合成基因簇中途径特异性调控基因sanG的转录水平,从而影响圈卷产色链霉菌的发育分化和尼可霉素的产生。【结论】该结果为链霉菌形态分化与生理代谢关系的研究提供了更多的证据,同时为多效调控基因wblA作用机制的阐明奠定了基础。     

圈卷产色链霉菌分化相关基因——saw1的结构和功能

用双脱氧链终止法进行了分化基因——saw1的双链测序.结果表明在1500bp的DNA片段中有一个完整的开读框架(ORF),其编码区是在419bp至1252bp处.其产物与已知的天蓝色链霉菌whiG的氨基酸序列有89%的同源性.当把1500bp的saw1DNA片段插入到链霉菌表达质粒载体pIJ702后,构建的重组质粒转化天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71,可使C71形成孢子和灰色色素.用基因破坏的策略进一步研究了该基因的生物学功能,结果表明saw1在圈卷产色链霉菌气生菌丝到孢子形成的发育转变中有重要作用,是分化中控制孢子发育起始的一个重要基因.     

圈卷产色链霉菌7100分化相关基因——sawE的结构与功能

以天蓝色链霉菌的whiB基因为探针,从圈卷产色链霉菌7100的总DNA部分文库中克隆了含有whiB同源序列的28kb DNA片段,并对其中的14kb片段进行了序列测定。序列分析表明,该片段含有一个完整的开放阅读框—sawE。预测的蛋白质结构及同源性分析显示,sawE与天蓝色链霉菌孢子形成早期的关键基因whiB高度同源,编码产物为一个调控蛋白。sawE的破坏使圈卷产色链霉菌7100的分化终止在气生菌丝阶段,在延长培养时间的情况下仍保持白色的表型,菌丝不能分隔,不能形成成熟的灰色孢子,结果表明sawE基因是一个与圈卷产色链霉菌分化有关的重要基因。     

尼可霉素生物合成基因簇的改造及其异源表达

摘要:【目的】异源表达尼可霉素生物合成基因簇,为尼可霉素核苷和肽基缩合机制研究以及尼可霉素与其它核苷类抗生素的组合生物合成奠定基础。【方法】以含有尼可霉素生物合成基因簇的pNIK 为出发质粒,通过PCR-targeting 的方法,将基因簇中sanG和sanF的启动子替换为组成型hrdB启动子,构建重组质粒pNIKm。通过接合转移的方法分别将pNIK和pNIKm导入天蓝色链霉菌M1146中,获得异源表达菌株M1146-NIK和M1146-NIKm,并通过RT-PCR检测基因簇的表达情况。最后通过抗菌活性实验和产物的分离 鉴定,比较M1146-NIK和M1146-NIKm的抗菌活性和尼可霉素的产生情况。【结果】pNIK和pNIKm在异源宿主天蓝色链霉菌M1146成功表达; M1146-NIK和M1146-NIKm均有明显的抗菌活性; M1146-NIK和M1146-NIKm均能产生少量的尼可霉素X、Z和假尼可霉素Z;M1146-NIK大量积累尿苷,而M1146-NIKm大量积累尿苷、核糖基-4-甲酰-4-咪唑-2-酮和吡啶同型苏氨酸。【结论】尼可霉素生物合成基因簇成功异源表达,并分离鉴定了尼可霉素产物及其生物合成中间体。本研究将为尼可霉素核苷和肽基缩合的酶学机制研 究以及尼可霉素与其它核苷类抗生素组合合成新型杂合抗生素提供理论依据和指导。     

圈卷产色链霉菌分化及其特性的研究

链霉菌分化的分子生物学研究是一个饶有兴趣并富有挑战性的世界前沿研究课题.在原核生物的分化研究中,主要以枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为模式系统,但枯草杆菌的生命周期尤其是分化过程远比链霉菌简单,不象链霉菌有基质菌丝、气生菌丝、菌丝螺旋和孢子分隔那样的发育分化过程[1].在真核生物中也有分化研究的报道,如构巢曲霉、酵母等.由于真核生物的基因结构比原核生物复杂得多,弄清分化中基因调控的关系就更加困难.因此,选用链霉菌作分化研究的材料有其独一无二的优越性.国际上有关链霉菌的分子生物学研究,近年来主要以链霉菌的抗生素生物合成基因和链霉菌的分化基因两个大的方面作为研究的热点和主攻方向,并展开了一些开拓性的研究.     

圈卷产色链霉菌硝基烷类氧化酶的分离纯化及酶学性质

圈卷产色链霉菌硝基烷类氧化酶基因naoA在大肠杆菌中获得了成功表达,从含有重组质粒pNA101(pET23b∷naoA)的工程菌株BL21(DE3)中分离纯化了硝基烷类氧化酶,SDSPAGE检测为均一。对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。底物为1硝基丙烷、2硝基丙烷和硝基乙烷时,在04mol/L的磷酸缓冲液中,酶的最适反应pH值为7～8,最适反应温度为48℃～56℃。室温保存6d后,酶的活性保持了43.3%,但对60℃以上的高温敏感。硫醇化合物如巯基乙醇、还原型谷胱甘肽不同程度地抑制酶活性,特别是NADH,其浓度为1mmol/L时,酶活性几乎全部丧失。以1硝基丙烷为底物时,NaoA的Km为357mmol/L,Vmax为0199μmol/(μg.min)。     

圈卷产色链霉菌分化基因sawB的结构与功能

以Sau3AI部分酶切野生型圈卷产色链霉菌7100(Streptomyces ansochromogenes 7100)染色体DNA,回收3～6 kb的DNA片段,插入到链霉菌表达载体pIJ702的BglⅡ位点,转化圈卷产色链霉菌白色突变株W19,得到了近3 000个转化子,从中筛选到了两个具有硫链丝菌素抗性和野生型灰色表型的转化子.进行了质粒提取和酶切分析,两个重组质粒分别命名为pNL-1和pNL-2(分别含有约5.2和5.8 kb的外源片段).通过亚克隆及突变株互补实验,将互补W19的基因定位在了1.25 kb的Pst Ⅰ-Apa Ⅰ片段上.DNA序列分析结果表明,该DNA片段中含有一个完整的可读框(ORF1),编码一个由295个氨基酸组成的蛋白质,该基因命名为sawB.利用Blast程序在蛋白数据库中比较发现,SawB与天蓝色链霉菌的一个转录调控蛋白WhiH具有81%的一致性.利用基因破坏策略研究了sawB的功能,结果发现,野生型菌株的sawB基因破坏后,丧失了孢子形成能力,由灰色表型转变为白色表型.显微镜下观察sawB突变株的气生菌丝长而直,顶部略有波浪形卷曲,螺旋程度有所下降.由此可知,sawB是与圈卷产色链霉菌形态分化有关的一个重要基因,它与菌丝螺旋及孢子形成直接相关.sawB的异源表达分析表明,sawB可互补天蓝色链霉菌whiH突变株C119,使之恢复到野生型表型,产生紧密螺旋及丰富的灰色孢子.     

圈卷产色链霉菌分化早期基因——samfR的研究

以链霉菌发育调控启动子PTH4 直接控制的下游部分基因片段为探针 ,在圈卷产色链霉菌中克隆到 1个 4.6kb的DNA片段 ,该片段除含有sawD基因外 ,其中1 .4kb的PvuⅡDNA片段对圈卷产色链霉菌的分化有促进作用 .序列分析及同源性比较表明 ,开放阅读框架 (ORF)由 6 39个核苷酸组成 ,编码 2 1 3个氨基酸的蛋白 ,该蛋白与红球菌 (Rhodococcusgloberulus) 3-羟苯丙基丙酸 ( 3HPP)代谢合成的调控基因hppR所编码的蛋白有 36 %的氨基酸完全相同和 5 2 %的氨基酸类似 ,该基因称之为samfR基因 .基因功能研究表明 ,samfR基因的破坏使圈卷产色链霉菌不能形成气生菌丝和孢子 ,而发育分化停止在基质菌丝阶段 ,出现光秃型的表型 .     

多抗霉素链霉菌噬菌体的研究

从多抗毒素异常发酵液中分离出一种噬菌体P_sA。该噬菌体在电镜下观察呈蝌蚪形;在琼脂平板上呈圆形,边齐,透明噬菌斑。噬菌体原液在60℃、30分钟完全失活;pH4.0—9.0范围内较稳定,pH 10.0—14.0范围内仍不完全失活,pH3.0以下均失活。该噬菌体噬菌斑的形成需要Ca²⁺,仅感染多抗霉素链霉菌。对该噬菌体杀灭效果较好的消毒剂有新洁尔灭、漂白粉、甲醛、高锰酸钾、生石灰、来苏尔等。噬菌体原液在4℃冰箱保存两个月效价基本不变。     

吸水链霉菌17997格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析

吸水链霉菌17997(Streptomyceshy groscopicus17997)是我所从中国云南土壤中分离到的格尔德霉素(geldanamycin,GDM)产生菌,GDM具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性,但其肝毒性和水溶性差的缺点限制了其在临床上的应用。为了实现对GDM结构的生物学改造,首先要获得GDM的生物合成基因。根据GDM后修饰基因——氨甲酰基转移酶基因(gdmN)的保守序列筛选S.hygroscopicus17997的柯斯质粒基因组文库,共获得6个阳性克隆,选择CT-4阳性柯斯质粒进行亚克隆和测序,又通过PCR延伸的方法获得了与CT4连锁的将近5kb的外源序列,共获得28.356kb的外源DNA序列,其中包含了13个可能阅读框架,通过同源比较证实该序列与S.hygroscopicusNRRL3602中的GDM生物合成基因有很高的同源性。为进一步研究GDM生物合成基因的功能,并通过组合生物学的方法改造GDM的结构奠定了基础。     

圈卷产色链霉菌分化相关基因samR调控的初步研究

在野生型的圈卷产色链霉菌中,增加单个或多个拷贝数的samR,观察该基因对野生株表型和形态的影响。结果表明,samR的拷贝数的增加会使孢子形成提前,但是增加单拷贝的菌株与增加多拷贝的菌株所表现的增效作用相同。在大肠杆菌中对samR进行了GST融合表达和纯化,通过凝胶阻滞实验证明,SamR蛋白可与其上游的调控区特异性结合。由此推测samR是一个自调控基因。     

黑暗链霉菌中tbmA基因的功能研究

PCR获得tbmA基因内部863 bp片段,构建基因阻断穿梭载体pSPU112-1,经接合转移导入Strepto-myces tenebrariusH6,筛选单交换阻断变株,并用Southern blot验证阻断变株的tbmA已经被破坏。经发酵产物分析,阻断变株不再合成氨甲酰妥布霉素,只合成安普霉素。首次从分子水平证明了tbmA只参与氨甲酰妥布霉素生物合成,而不参与安普霉素的生物合成。     

透明颤菌血红蛋白基因在淀粉酶产色链霉菌中的表达及对合成丰加霉素的影响

[目的]丰加霉素(Toyocamycin)是核苷类抗生素家族的重要成员,其在农业植物病害防治领域具有巨大的应用价值.为改善丰加霉素生产菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)发酵过程溶氧限制,旨在实现vgb在S.diastatochromogenes 1628中的表达以促进丰加霉素的生物合成.[方法]首先以gfp为报告基因检测红霉素抗性基因启动子Perm*在S.diastatochromogenes 1628中的转录活性,再利用PermE*实现vgb的异源表达.[结果]在荧光显微镜下,重组菌1628-GFP菌丝可发出稳定明亮的绿色荧光,表明启动子PermE*在菌株1628中可有效启动外源基因的表达;通过一氧化碳结合差光谱分析显示VHb具有生物学活性;摇瓶实验表明:与原始菌株相比,重组菌可促进丰加霉素产量的提高,在中度和高度限氧条件下促进效果尤为明显,提高幅度分别为48.9％和104.5％. PCR和发酵效价检测显示重组菌具有良好的遗传稳定性.[结论]成功实现了vgb在S.diastatochromogenes 1628中的表达,有效提高了其丰加霉素的合成水平,为丰加霉素的工业化生产提供了基础条件.