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1.
营养补偿和代谢控制提高连续灌注培养重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc的蛋白产率 总被引:1,自引:1,他引:0
为解决连续灌注培养产物因营养物质不能有效利用而导致产率偏低的问题,降低生产成本,我们通过在发酵过程中测定表达重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc(TNFRp75:Fc)蛋白的CHO工程细胞株对氨基酸成分的不同消耗速率,定量添加特定氨基酸作为营养补偿,提高了培养基中氨基酸的综合利用效率;同时,在连续灌注过程中通过对葡萄糖补加的限量控制,使培养体系中葡萄糖始终低于0.5 g/L,减少了乳酸蓄积对细胞的毒性作用,从而有效降低了灌注速率。结果显示,在30L工作体积发酵规模上经过氨基酸补偿和葡萄糖控制的连续灌注培养工艺使最终重组蛋白产率(mg/L)和最终产量较工艺改进前提高了2.1倍和3.7倍,分别达到388mg/L和244.4g,生产周期延长了一周。工艺改进前后重组蛋白的唾液酸含量和体外生物比活没有改变。通过营养补偿和代谢控制工艺策略可以有效提高连续灌注培养工艺重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc蛋白的产率和产能,从而降低产业化成本。 相似文献
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p75NTR-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达、鉴定和活性分析 总被引:2,自引:0,他引:2
为在酵母细胞中表达出具有生物活性的p75NTR Fc融合蛋白 ,采用PCR方法分别扩增α因子 (α factor)和p75NTR Fc基因 ,经重叠PCR ,获得α factor p75NTR Fc基因 .DNA序列分析该融合基因后 ,插入pAO815载体并构建串联多拷贝表达载体pAO815 3α factor p75NTR Fc .重组质粒电转化酵母GS115细胞后摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达的融合蛋白经ProteinA亲和层析和SephadexG 10 0纯化 ,Western印迹、N末端测序进行蛋白质鉴定 ,ELISA及细胞培养进行生物活性分析 .SDS PAGE分析显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于培养上清中 ,诱导第 4d的表达量最高 ,占上清总蛋白 6 0 %以上 ,ProteinA纯化后有 2条蛋白带 ,免疫印迹分析这 2条蛋白带均能和抗p75及抗IgG抗体结合 ,N末端序列测定证实 1条为完整p75NTR Fc ,1条为其蛋白酶降解带 .ELISA等分析表明 ,p75NTR Fc能与NGF结合 ,p75NTR Fc能抑制NGF对PC12细胞的分化作用 . 相似文献
3.
一株高产脯氨酸的嗜醋酸棒杆菌的选育及发酵条件优化 总被引:1,自引:0,他引:1
以嗜醋酸棒杆菌为出发菌株,经过片段化全基因组体外诱变、重组和连续的磺胺胍抗性筛选,获得一株L-脯氨酸的高产菌株。摇瓶发酵优化结果表明,葡萄糖、生物素和硫胺素的最适用量分别为16%、300μg/L、400μg/L,最适pH为6.8~7.0,装液量为25ml/500ml摇瓶,发酵培养72h后L-脯氨酸产率高达到75.6g/L,与对照相比提高了5%。考察了50L发酵罐中细胞生长对L-脯氨酸产量的影响,补料分批发酵结果表明(比生长速率分别为0.06/h、0.08/h和0.1/h),比生长速率在0.08/h左右时L-脯氨酸的产率最高,L-脯氨酸的比生产速率QP达到0.091 g/(g.h),产率高达82.1 g/L,比优化前提高了14%。 相似文献
4.
人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白在治疗风湿性、类风湿性关节炎方面拥有广阔的市场前景和巨大的经济价值。本实验以表达TNFR-Fc融合蛋白的GS-CHO细胞为研究对象,结合细胞生长代谢特性和动力学参数分析,以葡萄糖为关键控制参数,通过测定培养上清的葡萄糖浓度对培养过程中的葡萄糖消耗进行及时的预测,调整流加速率,形成了以满足细胞生长代谢需要为基本原则的动态流加培养过程设计模型。在此控制模型指导下,建立了高效的流加培养过程。使最大活细胞密度和最大融合蛋白浓度分别达9.4×106cells/mL和207mg/L,较批次培养分别提高了3.4倍和3倍。本研究所采用的研究方法和控制策略为优化GS-CHO细胞培养过程和TNFR-Fc融合蛋白成功迈向产业化奠定了基础。 相似文献
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重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究 总被引:2,自引:0,他引:2
为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2/hTNFR:Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT—PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFa细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示:所构建的重组病毒rAAV2/hTNFR:Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR:Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。 相似文献
6.
用填充床生物反应器连续灌流培养CHO细胞生产HBsAg 总被引:1,自引:1,他引:0
为了获得重组CHO细胞持续高效表达HBsAg的最佳条件 ,应用填充床生物反应器和聚酯片 ,连续灌流培养分泌HBsAg的重组CHO细胞 ,考察灌流培养基中葡萄糖浓度对细胞代谢和HBsAg生产的影响。连续培养 60天 ,细胞密度可达 5 0× 1 0 6 ml。灌流培养液中葡萄糖浓度从5 0g L增加到 7 6g L时 ,葡萄糖消耗速率和乳酸浓度均随之上升。当葡萄糖浓度继续增加至9 3g L时 ,葡萄糖消耗速率和乳酸浓度呈下降趋势 ;当将葡萄糖浓度降回至 7 6g L后又开始回升。培养过程中最高抗原滴度达 1∶5 1 2 ,出现在以含 5 0g L葡萄糖的培养液灌流阶段的末期 ,即第 2 6天 ,维持 1 0天左右即迅速下降至 1∶1 2 8水平。共收液 335L ,纯化后获得抗原蛋白2 1 3 0 4mg ,平均产率为 635 94μg L ,较传统转瓶工艺 ( 4 1 4μg L)提高 5 3 6%。表明CHO细胞较长时间处于高乳酸水平下 ( >30mmol L)会严重影响产物的表达 ,应控制灌流培养液中的葡萄糖浓度在较低水平 ,或通过适当提高灌流速率使培养基中乳酸水平维持在较低水平 ,从而有利于HBsAg的高效稳定表达 相似文献
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表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的大肠杆菌工程菌的高密度培养 总被引:3,自引:1,他引:3
采用溶氧反馈的分批培养流加补料的方法高密度培养重组大肠杆菌BL21(DE3)生产重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。通过摇瓶培养对菌种和培养条件的初步筛选,采用溶氧反馈的流加补料策略,进行了5L发酵罐的合成培养基和复合培养基的发酵工艺的研究。通过对培养条件的不断优化,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)里得到了高效表达,菌体密度最终达到115g/L(WCW)以上,可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的30%以上,含量约为1.1~1.2g/L。5L发酵罐的发酵工艺参数在40L发酵罐中进行了放大培养,结果表明该工艺能有效的放大,可适用于工业生产。 相似文献
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重组大肠杆菌高密度培养 总被引:5,自引:1,他引:5
重组大肠杆菌的高密度培养是增加单位时间,体积重组蛋白产率的最有效途径之一。如何在获得高密度的同时取得较高的单位时间/体积目的蛋白产率,是高密度培养(过程中亟待解决的问题,这与所选用的菌体、构建的表达系统、发酵时pH、溶氧、培养基成分及培养温度、质粒稳定性、代谢副产物的限制及时比生长速率的控制等因素有关。试从这些方面加以综述,分析这些条件对重组蛋白生产的影响,介绍大肠杆菌高密度培养领域的一些研究进展。 相似文献
10.
随着重组抗体药物展示出良好的治疗效果和市场效益,抗体药物的研发逐渐成为生物医药产业发展的主要方向。但是目前国内动物细胞表达水平普遍较低和发酵工艺落后的现状制约了我国抗体药物产业化的发展。主要综述了国际抗体药物产业的发展态势,重点比较二氢叶酸还原酶和谷氨酰胺合成酶表达体系、连续灌注和流加培养发酵模式的各自优势,结合我们抗体药物表达、发酵方面的经验,对当前我国抗体药物产业化发展策略进行了探讨,提出抗体药物产业化模式应根据企业对抗体产率、产能和市场经济学的多重考虑选择发酵工艺和发酵规模,应用谷氨酰胺合成酶/CHO-K1表达系统和连续灌注培养工艺可能更适应目前中国抗体产业化的需要。 相似文献