嗅神经鞘细胞的培养纯化及体外生长特性

采用原代培养的方法,从2,5月成年大鼠的嗅球分离培养嗅神经鞘细胞（OECs),培养6天后,用阿糖胞苷（Ara-C)抑制,差速贴壁,Forskolin和BPE营养物质处理,根据P75蛋白免疫细胞化学染色和形态学特征分析了所得细胞的纯度,同时对不同培养时期的OECs 的形态进行观察和纯化后的活力测定。实验结果显示：（1）这种纯化方法简单,经济,快捷,所得的OECS纯度可达95％以上,并且随培养时间延长,细胞仍保持较高的纯度。（2）在培养早期2天到5天主要以巨噬细胞状,多极状,不规则状为主,培养中期7天到20天主要以扁平的双极,三极为主。晚期20天以后呈现双极,三极形态,其起上有许多细小的棘突。93）其中以培养早中期细胞的活力较好,培养20天以后,细胞活力较差,本研究为以OECs 作为移植材料对促进神经再生的研究获得丰富的细胞来源奠定了基础。     

小鼠睾丸支持细胞体外培养特性

支持细胞是睾丸的重要组成部分,其主要功能是为生精细胞提供适宜的生长环境。从幼鼠睾丸中分离得到支持细胞,并通过苏木精-伊红和Fas-L免疫组化染色对分离得到的细胞进行了鉴定。通过对原代小鼠睾丸支持细胞的贴壁、生长和培养液中葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等营养底物及其副产物乳酸、铵根离子等的代谢以及培养液渗透压和pH的研究,发现支持细胞的贴壁时间主要集中在接种后2～4h;当培养液中氨根离子浓度高于2.3mmol/L,渗透压高于326mosm/kg,pH≤6.8时支持细胞生长进入衰亡期;在氨基酸代谢方面,发现培养过程中丙氨酸和谷氨酸浓度迅速增加,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度略有降低,丝氨酸、精氨酸和甘氨酸浓度基本保持不变。因此培养液中铵根离子浓度的过量积累、渗透压和pH的异常和贴壁面积不足是限制支持细胞静态生长的主要因素。研究结果为支持细胞大规模培养及工艺优化奠定了基础。     

星形胶质细胞的体外生长特性

目的研究纯化培养的星形胶质细胞的体外生长特性,作为进一步研究星形胶质细胞功能的依据。方法将纯化的星形胶质细胞分为6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、72h、84h、96h、120h14个时间组,培养不同的时间后,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线观察细胞的生长状况,用流式细胞学检测细胞周期各时相的变化并绘制增殖指数曲线,所得数据用SPSS软件进行统计学分析。结果①星形胶质细胞的生长曲线可明显的分为三个阶段:第一阶段为0至24h,在此时间内生长曲线平缓上升,其斜率为0.64。第二阶段为24h至84h,在此时间内生长曲线急剧上升,其斜率为2.69;此阶段中24h至48h时曲线最陡,斜率为3.94,细胞呈指数生长。第三阶段为84h至120h,在此时间内生长曲线走势平直,其斜率为-0.005。②星形胶质细胞的增殖指数在第一个细胞增殖周期内可以反映细胞的增殖状态,第一个细胞周期结束后,细胞的数量继续上升增殖指数却降低了。结论培养的星形胶质细胞的生长过程分为潜伏期、指数生长期和停滞期三个阶段,其潜伏期为0至24h,指数生长期为24h至48h,停滞期为84h以后。单纯用增殖指数等类似的指标作为细胞增殖状态的判断标准是有一定局限性的,一定要将这些指标与细胞数量结合起来分析。     

壳寡糖对乳酸杆菌体外生长的影响

目的:研究壳寡糖对乳酸杆菌体外生长的影响。方法:将乳酸杆菌MRS培养基中的葡萄糖替换为壳寡糖及向原培养基中加入适量的壳寡糖,通过测定OD值比较乳酸杆菌的生长状况。结果:以壳寡糖完全代替葡萄糖的培养基中乳酸杆菌的生长状况不如MRS培养基,而少量壳寡糖与葡萄糖协同的培养条件使乳酸杆菌的生长适应期明显减短,促进其生长。结论:乳酸杆菌对壳寡糖的利用不如对葡萄糖的利用,1g/l壳寡糖与葡萄糖协同作用时可明显缩短乳酸杆菌的生长适应期,促进细菌生长。     

小鼠2,4,8—细胞胚胎卵裂球体外培养的研究

以ＣＺＢ为基础培养液,培养小鼠２、４、８－细胞胚胎的卵裂球,研究葡萄糖、牛磺酸和胰岛素对１／２卵裂球体外发育的影响及１／４、１／８和２／８卵裂球的体外发育规律。２－细胞胚胎卵裂球在ＣＺＢ中和在添加牛磺酸的ＣＺＢ中培养,其囊胚发育率（分别为９２％、８９％）无显差异（Ｐ＞０．０５）。胰岛素在少量葡萄糖存在的情况下,不影响卵裂球的囊胚发育率;在无葡萄糖时,卵裂球的囊胚发育率（３８％）显降低。牛磺酸在     

体外培养细胞的加力实验装置

机械力对细胞生物学行为的影响是目前细胞生物学和细胞力学研究的一个重要课题。体外分离细胞和加载培养技术是细胞力学的基础之一和目前细胞力学研究的重要方法。大致可分为离心力加载、流体加载、单细胞加载、压力传导加载和基底形变加载技术。     

小鼠原生殖细胞体外培养及其应用研究

原生殖细胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｌ,ＰＧＣ）是胚胎生殖谱系最原始形式的细胞,在体胚胎迁移期ＰＧＣ增殖极为旺盛。体外培养的小鼠迁移期ＰＧＣ在饲养层细胞和三种生长因子（干细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及白血病抑制因子）的共同作用下,可发展为长期增殖并维持不分化状态的胚胎性干细胞,即胚胎生殖细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ,ＥＧ）,具全能性发育潜能。ＥＧ建系成功对于研究生殖细胞发育以及寻找新的转基因动物操作的有效载体具有重要价值。     

乳鼠外周神经雪旺氏细胞的体外培养和纯化的研究

本文取５～７天ＳＤ新生大鼠坐骨神经剪碎,用０．２５％胰蛋白酶及０．０３％胶原酶在３７℃消化４５分钟,吹打分散后接种于培养瓶。培养基为含１０％胎牛血清的Ｆ１０。接种后４８小时,加入阿糖胞苷（Ａｒａ－ｃ,Ｓｉｇｍａ）１０－５ｍｏｌ／Ｌ处理,４８小时后换每毫升含神经生长因子（ＮＧＦ）１００μｇ的培养液,刺激雪旺氏细胞（ＳＣ）生长５～７天。此时根据成纤维细胞去除的情况,可再次加入Ａｒａ－Ｃ１～２天或转为无血清培养基一周。这种抗有丝分裂法结合无血清培养法,既能有效去除成纤维细胞,又能减少对ＳＣ的损伤,获得的ＳＣ纯净度可达９８％。     

体外培养的小鼠骨髓肥大细胞的初步研究

肥大细胞是一种广泛存在于哺乳类动物体内的细胞。它分布于机体各个系统而非局限于某个组织,同时胞浆中又含有可合成、贮存和释放多种活性介质的颗粒,因而在功能上具有相当的重要性。肥大细胞在变态反应、寄生虫感染等过程中的作用已得到了较充分的认识。近10年来肥大细胞的研究更取得了显著的     

四种显微技术观测大鼠颌下腺细胞与丝素-壳聚糖体外共培养的形态学特点

目的采用倒置显微镜、扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜（（laser scanning confocal microscopy,LSCM））技术对大鼠颌下腺细胞（rat submandibular gland cells,RSMGs）与丝素-壳聚糖（silk fibroin-chitosan,SFCs）的体外复合培养进行形态学观察。为观测、评估种子细胞在三维支架的内部生长情况提供技术支持。方法取0～8 d龄SD大鼠的颌下腺,对大鼠颌下腺细胞进行原代培养、分离纯化并传代;用抗细胞角蛋白单克隆抗体（CK8）及淀粉酶抗体的免疫细胞化学染色鉴定细胞来源。选取传至第二代的对数生长期的RSMGs作为种子细胞,选取SFCs共混膜（5×5×2）mm作为支架材料构建组织工程化涎腺样结构。将种子细胞与支架材料复合培养并分别于倒置显微镜、SEM、荧光显微镜和LSCM下观察二者复合生长情况。结果倒置显微镜可以直接观察活细胞与支架复合生长情况,方法简单易行。SEM可以较精确的展示细胞支架复合生长的表面超微结构。经过荧光染料的着色,荧光显微镜和LSCM都可以观察到支架上锚定的种子细胞。荧光显微镜可见细胞核的荧光信号均匀的分布在支架孔隙内。LSCM通过层扫描及三维重建技术对较厚的标本获取图像;并可以通过旋转图像,从不同角度观察细胞支架复合物的三维剖面或整体结构,得到更为准确的定位信息。结论四种显微技术均可应用于RSMGs与SFCs体外共培养的形态学观测。LSCM的三维重建技术结合荧光染料标记可以较好地获得RSMGs与SFCs复合生长的情况,有着较广泛的应用价值。     

牛睾丸支持细胞分离、纯化及体外生长行为的研究

了解牛睾丸支持细胞体外培养的生物学特性,试验采用组合酶消化和选择贴壁法,将5月龄、6月龄牛胎儿及新生牛睾丸支持细胞分离纯化后进行体外培养。试验结果显示,这一阶段牛睾丸适宜支持细胞分离纯化用;采用0.25 %胰蛋白酶+0.02 %EDTA二次消化法是一种经济有效的牛胎儿睾丸支持细胞分离方案;试验发现,牛胎儿睾丸支持细胞体外研究时间应控制在3天～20天内,处于对数生长期的牛胎儿睾丸支持细胞,对牛体外受精卵体外发育有明显的促进作用。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层,培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长,细胞排列紧密,呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

黄牛表皮细胞分离与体外培养最适条件的探索

为了建立黄牛表皮细胞分离与体外培养的最适条件,比较了组织块法与单细胞悬液法、不同蛋白酶(胰蛋白酶和分离酶)的消化以及有无血清培养基对细胞生长的影响,以克隆形成率来检测细胞生长和存活情况。结果证明：采用分离酶分离表皮细胞进行无血清培养是黄牛表皮细胞体外培养的最适条件。     

培养人皮下脂肪干细胞纵向分化的实验研究

目的:建立人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)分离、培养的方法,观察其生物学特性,探讨其纵向分化的能力.方法:自皮下脂肪组织获得梭形细胞,观察细胞生物学特征,免疫组化鉴定波形蛋白和CD44.以含有胰岛素、地塞米松、1.甲基-3-异丁基-黄嘌呤的无血清混合培养基诱导其向脂肪细胞纵向分化,以细胞形态学变化.油红O染色和测定甘油磷酸脱氢酶活性判定分化是否成功.结果:人皮下脂肪中能够分离培养出生长旺盛的脂肪干细胞,诱导培养7d后细胞由梭形逐渐变圆,胞质内出现脂滴后逐渐增多融合为脂泡,并与甘油磷酸脱氢酶活性变化相吻合.油红O染色显示约(78.6±2.2)%细胞转变为脂肪细胞.结论:人皮下脂肪中分离的脂肪干细胞在体外诱导条件下能纵向分化为脂肪细胞,可能成为修复软组织缺损及整形美容的又一干细胞来源.     

兔角膜缘干细胞的研究进展

目前,角膜移植是临床上治疗角膜疾患的最有效途径,但供体角膜非常有限。新近兴起的干细胞技术,为组织工程角膜的研制和应用提供了契机。对于以角膜缘干细胞缺乏或功能障碍为特征的疾病也有治疗效果。采取角膜缘干细胞移植应是一种合理有效的治疗手段。本文主要介绍了兔角膜缘干细胞的体外分离、培养、鉴定及一些生长因子对其增殖的影响。     

Transient Swelling of Salivary Acinus Induced by Acetylcholine Stimulation: Water Secretion Pathway in Rat Submandibular Gland

The volume changes of isolated acini and acinar cells from rat submandibular glands were measured from digitized images recorded upon stimulation of acetylcholine (ACh) or reduction of the perfusate osmolarity and water secretion pathway in salivary gland was studied. When acinus is exposed to a hyposmotic solution, water flows into the acinar cells and into the lumen via acinar epithelia. If the water enters the lumen chiefly via the cells, the swelling of the lumen would follow the same time course as the cell swelling or slower. The results show that reduction of the perfusate osmolarity evoked a transient increase followed by a gradual increase in the volume of unstimulated acinus, while it evoked only a gradual increase in the volumes of unstimulated acinar cells. Thus, the time course of the acinar swelling is faster than that of the acinar cell swelling. Reduction of the perfusate osmolarity also evoked a transient swelling in ACh stimulated acini. When acinus is stimulated by ACh, water also flows into the lumen via acinar epithelia according to the osmotic gradient which was generated by the active electrolyte transport of acinar cells. If the water enters the lumen chiefly from the cells, there would be no overall change in acinar volume. The results show that stimulation of ACh (5 μm) evoked a transient increase followed by a gradual decrease in the volume of the acinus, while it evoked only a decrease in the volume of acinar cells. Video-enhanced optical microscopy exhibited that ACh stimulation caused transient swelling of the luminal space, prior to causing the volume of acinar cells to decrease and the transient swelling of the lumen followed the same time course as that of acinus. Thus, the transient acinar swelling is explained by the transient swelling of luminar volume. These results suggest that water is probably drawn into the lumen from interstitial space directly in the salivary acinus. Received: 3 February 1997/Revised: 29 October 1997     

饲养层细胞对绵羊胚胎干细胞体外培养的影响

家畜胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)的研究进展缓慢,绵羊ES细胞的研究虽早有报道,但仍未建立可稳定传代的细胞系。在已建立的绵羊体外受精发育体系的基础上,摸索了饲养层(Feeder)细胞对绵羊ES细胞生长的影响,包括在一定的丝裂霉素浓度下处理Feeder的时间、细胞种类、代数、接种密度及新鲜制备和冷冻复苏后的Feeder细胞,通过试验比较研究,目的在于筛选合适的饲养层细胞,为建立绵羊ES细胞体外培养体系奠定基础。结果表明,10μg/ml丝裂霉素C处理2~2.5h获得的1~5代的SEF和1~3代的MEF及两者的1∶1混合细胞都能较好地支持绵羊ES细胞的生长。     

Processes Maintaining Calcium Homeostasis in Acinar Cells of the Rat Submandibular Salivary Gland

Using a Ca²⁺-sensitive fluorescent indicator, fura-2/AM, we recorded calcium transients in secretory cells of isolated acini of the rat submandibular salivary gland; these transients were induced by hyperpotassium-induced depolarization (after an increase in [K⁺] _e up to 50 mM) of the plasma membrane of the above cells. Calcium transients were significantly suppressed by 50 M nifedipine. Addition of 10 M carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone to the normal extracellular solution was accompanied by a rise in [Ca²⁺] _i , whereas when hyperpotassium solution is used the effect was less expressed. Blockers of CA²⁺-ATPase in the cellular membrane and in the endoplasmic reticulum, eosin Y (5 M) and cyclopiazonic acid (CPA, 5 M), respectively, evoked a significant increase in [Ca²⁺] _i and a decrease in the K⁺-depolarization-induced calcium transient. Extracellular application of caffeine (2, 10, or 30 mM) was accompanied by a concentration-dependent rise in [Ca²⁺] _i . Therefore, potassium depolarization of the plasma membrane of acinar cells of the rat submandibular salivary gland activates both the voltage-dependent Ca²⁺ influx and Ca²⁺-induced Ca²⁺ release from the endoplasmic reticulum; the initial level of [Ca²⁺] _i was restored at the joint involvement of Ca²⁺-ATPases in the plasma membrane and the membranes of the endoplasmic reticulum and mitochondria.     

甲状腺素T4对体外高温培养奶牛乳腺上皮细胞生长和凋亡的影响

以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,采用台盼蓝染色绘制生长曲线,细胞流式检测细胞凋亡,以正常培养温度(38℃)为对照,研究体外高温培养条件下(42℃),添加不同浓度(0.01、01和1mol/L)甲状腺素(thyroxine,T4)对细胞生长和凋亡的影响.结果表明,不同浓度的T4在38℃有促进奶牛乳腺上皮细胞生长的趋势,但是变化不显著(P>0.05),而T4对缓解高温所造成的乳腺上皮细胞的生长抑制作用也不显著(P>0.05);不同的T4都能够极显著缓解42℃培养1 h和3 h的奶牛乳腺上皮细胞的凋亡(P<0.01),并且对缓解42℃培养3 h的细胞凋亡效果更加明显,但是对42℃培养5 h和8 h的细胞,仅1 μmol/L的T4能够极显著缓解其凋亡(P<0.01).结果提示,T4对高温造成的奶牛乳腺上皮细胞的生长抑制没有明显的缓解作用,但能缓解高温诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡.