一种快速检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留的方法

总RNA样本中残留基因组DNA会严重影响qRT-PCR的准确性。为了检测RNA样本中的DNA残留,依据持家基因TIP41-like的部分内含子序列设计了1对基因组DNA残留检测引物:LDRG-F:5'-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3'及LDRG-R:5'-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3'。利用这对引物对3种不同RNA提取试剂盒提取的总RNA样本以及2种不同第1链c DNA合成试剂盒合成的cDNA样本进行PCR扩增检测,能高效快速地检测岷江百合总RNA以及cDNA样本中有无基因组DNA残留。     

迟钝爱德华氏菌RNA提取及痕量基因组DNA去除方法探究

迟钝爱德华氏菌EIB202是一类细胞壁结构特殊的革兰氏阴性菌,高质量RNA提取相对较难。为了从转录组水平研究这类致病菌的致病机理,需要摸索有效的RNA提取及RNA样品中痕量基因组DNA去除方法。对常规RNA提取步骤进行改进,增加PBS清洗、反复冻融及较高浓度溶菌酶处理等步骤;另外,利用小体系基因组DNA去除系统,Mg2+与Mn2+协同激活DNase I去除RNA样品中基因组DNA污染。利用优化方法提取的RNA在质量及浓度(1 740 ng/μL)方面均有了显著改善,并建立了一套完全去除RNA样品中痕量基因组DNA污染的程序。     

外源RNA对小鼠白蛋白基因表达及DNaseⅠ敏感性的影响

兔肝RNA诱导培养的小鼠成纤维细胞 ,大鼠肝RNA注射入小鼠前列腺 ,用免疫组织化学染色检测外源RNA对小鼠白蛋白基因表达的影响 ;不同RNA诱导培养的小鼠成纤维细胞 ,提取细胞核 ,DNaseⅠ消化 ,PCR法扩增小鼠白蛋白基因 ,检测白蛋白基因消化情况。发现外源RNA可促进小鼠白蛋白基因表达并增加该基因DNaseⅠ敏感性     

基于模板转换的微量RNA测序建库方案探索

目的:建立一套简便、对RNA样本起始量要求很低的RNA测序建库方法,在此基础上引入分子条形码技术,从而使RNA-seq的数据所反映的表达丰度更加客观真实。方法:将微量RNA用RNaseⅢ片段化后,利用反转录酶的反转录活性、模板转换活性以及DNA依赖的DNA聚合酶活性,一步实现从RNA到cDNA文库的反应,再通过PCR扩增获得适合测序仪的测序文库,通过测序分析验证建库效果,最后采用荧光定量PCR法测定部分基因的表达量以验证测序结果,同时比较分子条形码的引入对表达量分析的影响。结果:通过电泳观察和测序结果分析,选择Clontech公司的SMARTscribe,反转录和模板转换反应温度设为50℃,反转录完成后经AMPure Beads纯化再经PCR扩增得到测序文库,电泳检测文库DNA长度和浓度符合测序要求。比较发现,用分子条形码建库的测序结果能够更加真实地反应基因的实际表达量。结论:初步建立了针对10 ng RNA样品的RNA-seq建库技术,并在建库方案中加入分子条形码使其测序结果更加真实地反映基因表达量。该技术未来可适用于微量RNA样品的高通量测序。     

红曲霉DNA提取及其RAPD-PCR反应体系的建立

采用改进的氯化苄法对红曲霉DNA进行提取纯化,探讨了提取液中EDTA的浓度以及其他因素对提取结果的影响。同时,以该法提取的DNA为模板,采用正交实验优化RAPD分析最佳反应条件。结果表明,当提取液中EDTA浓度为125mmol/l时,所得的红曲霉DNA的质量和数量均较理想,每克红曲霉菌丝体（湿重）能提取到50μg的DNA,分子量约为25kb,以此DNA为模板进行PCR扩增,其最佳反应体系为：Mg^2 2.0mmol/l,dNTPs 0.15mmol/l,Taq 0.05U/μl,模板DNA 1.2ng/μl,随机引物0.36μmol/l,Tris-HCl 10mmol/l pH9.0,KCl 50mmol/l,Nonidet P40 0.1%。另外,通过对比RAN酶消化前后的模板扩增结果证明了本实验酶的消化的必要性,对比了不同预变性时间处理模板对RAPD－PCR扩增的影响,发现不经过预变性的模板扩增结果最理想。     

一种高质量麦冬总RNA的提取方法

本方法采用CTAB作为去污剂,分别用氯仿/异戊醇反复抽提、LiCl沉淀,以去除蛋白质、碳水化合物和次生代谢物等杂质,用DNase处理去除DNA污染,最后用无水乙醇沉淀获得总RNA。该方法不仅能获得完整性好、纯度高的总RNA,而且操作简单、成本低廉、RNA产率高,对富含次生物质的中草药材植物组织总RNA的提取具有借鉴意义。     

RNA促进小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性

同样的基因在不同的分化细胞中表达不同,基因的选择性表达问题涉及分化和衰老的本质。转录基因对DNaseⅠ(DNA酶Ⅰ)消化敏感,本文研究了RNA对小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性的影响。分离BALB/c小鼠脑细胞核,加入终浓度为2mol/L的NaCl破坏核小体结构,加入不同量、不同来源的RNA,装透析袋,逐渐降低离子强度进行染色质重组。重组染色质中加入DNaseⅠ消化DNA,PCR扩增白蛋白基因的外显子1到外显子2约1200bp区段,PAGE电泳后,用银染色观察不同来源RNA促进DNaseⅠ对白蛋白基因的消化作用。不同组织来源（肝、肺、肾、脑）RNA对小鼠重组染色质中白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性均有促进作用,其中肝和肺RNA促进消化作用较强;酵母tRNA无显著促进消化作用;消化促进作用与RNA剂量有关。RNA能增加DNaseⅠ对白蛋白基因的消化敏感性且有组织（细胞）来源特异性。又委托丹麦Chemical R D 实验室合成2条与白蛋白基因互补的各23核苷酸的RNA,用其进行重组试验。结果表明,重组混合物中含有低至0.2μg/mL的RNA,即可以发挥显著的DNase I消化促进作用。     

煮沸裂解法和试剂盒法提取浸矿菌基因组DNA的比较

目的：在生物浸出中,微生物群落结构分析有着重要意义,而群落分析的基础是提取纯度高、损失少的基因组DNA。为了解决这一问题,本实验通过比较两种较常用的DNA提取方法,煮沸裂解法和试剂盒法,寻找一种灵敏、快速、经济实用的制备浸矿细菌基因组DNA的方法。方法：分别用煮沸裂解法和试剂盒法提取6种浸矿菌的基因组DNA,从所提取的基因组DNA浓度、纯度、回收率和对PCR扩增反应的影响方面比较了两种方法的提取效果;用两种方法来处理不同浓度梯度的一种菌,通过实时定量PCR来比较两种方法的灵敏性。结果：相同处理量（108个）的革兰氏阳性菌（1株）、革兰氏阴性菌（4株）、古菌（1株）经两种方法提取的基因组DNA差异较大,煮沸裂解法所得的6组基因组DNA更纯,其OD260／OD280的值更接近1．8-2．0（纯DNA的OD260／OD280在1．8—2．0之间）,前者所提DNA回收率最大可达后者的16．7倍;煮沸裂解法只需较少菌（102个）便能让实时定量PCR检测到所提DNA模板浓度,比试剂盒法灵敏。结论：两种方法提取的基因组DNA均可用于后续的PCR扩增,此外,前者提取的DNA浓度随细菌浓度增加而呈线性增大,而后者随茵浓度增大,所提DNA量增加有限,因此,在生物浸出中微生物基因组DNA的提取可直接采用简单快速的煮沸提取法,为实验节约成本和时间。     

体重差异双胎新生儿 粪便样本DNA提取的优化及分析

摘要：目的 优化新生儿粪便样本DNA提取方法,提取及分析体重差异双胎新生儿粪便样本DNA。方法 从7种DNA提取试剂盒方法中选择对成人粪便样本DNA提取效果最佳的QIAamp DNA Stool Mini Kit法为基准方法,通过钢珠打断前处理、DNA吸附柱收集全部裂解液上清和洗脱液重复洗脱的优化,建立了用于新生儿粪便样本DNA的提取方法。结果 该优化方法用于婴儿（出生1个月）粪便样本,结果显示DNA提取浓度平均提高了2.4倍。用于48对双胞胎新生儿出生第1天和第3天粪便样本DNA的提取,经酶标仪及PCR扩增检测,结果显示出生第1天粪便样本DNA提取率为32%,出生3天提取率达83%。RT-PCR显示新生儿第1天到第3天肠道微生物量呈现增长趋势。结论 优化的QIAamp DNA Stool Mini Kit法适用于新生儿粪便样本DNA的快速提取,为后续扩增子高通量测序和研究体重差异双胎新生儿肠道菌群构成规律奠定基础。     

棉花高质量DNA的提取及SRAP反应体系的优化

建立一种简便、快速、经济、有效的gDNA提取方法,并以得到高质量的gDNA为模板摸索棉花SRAP反应体系的最优条件。在提取棉花DNA之前对样品进行预除酚处理,采用CTAB法并加以改进,摸索了一种简便、快速、经济、有效的gDNA提取方法。结果表明预处理除酚法提取天然彩色棉的gDNA为白色,OD260 nm/OD280 nm平均值达到1.900,OD260 nm/OD230 nm平均值1.659,琼脂糖电泳检测表明所提取的DNA较完整,RNA含量少;通过对重要参数进行摸索和优化试验,建立一套稳定可靠、扩增效果好、可重复性强的适用于棉花的SRAP反应体系：25μL的反应体系中,模板DNA量30ng、2.5mmolm/L Mg2＋浓度、0.8μmol/L的上下游引物、200μmol/L的dNTPs以及Taq酶1U。     

开放手术与内镜治疗胆总管结石的临床疗效对比分析研究

目的:分析探讨内镜括约肌切开与胆管切开取石治疗胆总管结石的疗效比较。方法:回顾性分析2006年1月至2013年1月间收治的胆总管结石病人150例,65例为开放手术组,55例为内镜治疗组,通过比较两组患者手术治疗成功率、操作时间、术中出血量、术后并发症、住院时间及住院费用。结果:开放手术组和内镜治疗组治疗成功率分别为96.92%和98.18%;平均手术时间分别为95.8士14.6和51.32±22.76分钟;术中出血量分别为177.25±48.67和28.23±18.96 mL;术后并发症的发生率分别为9.23%和3.63%;术后住院天数分别为20.54±10.69和8.83±6.41天;住院费用分别为22312.04±4563.42和10518.42±5368.62元;两组间治疗成功率差异均无统计学意义(P0.05)。两组间平均手术时间、术中失血量、术后并发症的发生率、住院天数及住院费用差异均有统计学意义(P0.05)。结论:与开放手术相比,内镜治疗胆总管结石具有安全、有效的优点,是目前治疗胆总管结石的首选方法。     

微创单枚椎间融合器单边椎弓根螺钉内固定术治疗腰椎间盘突出症的疗效观察

目的：比较微创单边椎弓根螺钉加单枚椎间融合器和双边椎弓根螺钉加椎间植骨融合术治疗腰椎间盘突出症的临床疗效,探讨微创单边内固定的可行性。方法：选择2009年1月～2012年11月在我科行椎间盘切除椎体间融合内固定术治疗的腰椎间盘突出症患者共43例,其中微创单边内同定18例,平均随访15.8个月;双边内固定25例,平均随访16.3个月。对比分析两组患者的一般资料、手术时间、术中出血、住院天数、住院费用、疼痛视觉模拟评分（VAS）和日本骨科协会评估治疗（JOA）评分、植骨融合率及并发症的发生情况。结果：与单边内固定组比较,双边内固定处理的患者的手术时间明显缩短（P〈0.001）,术中失血量明显减少（P〈0.05）,平均住院费用明显降低（P〈0.05）。而两组之间的住院时间、随访时间、植骨融合率、并发症的发生率以及末次随访时的VAS和JOSA评分比较均无统计学差异（P〉0.05）。结论：单边内固定椎间融合治疗单间隙腰椎间盘突出症能够达到双边内固定同样的疗效,且具有手术时间短、出血量少、费用低等优点,但手术适应症需严格控制。     

应用RNA干扰沉默猪内源性反转录病毒

目的:尝试应用RNA干扰(RNAi)沉默猪源PK-15细胞中的猪内源性反转录病毒(PERV),并通过反转录酶活性及pol基因相对荧光定量PCR检测沉默效果。方法:依据GenBank公布的PERV pol基因序列,采用Invitro-gen公司的BLOCK-iT RNAi Designer软件设计Stealth小干扰RNA(siRNA)序列;将合成的siRNA转染PK-15细胞,72 h后检测细胞上清PERV反转录酶活性及细胞内pol基因拷贝数并评价沉默效果。结果:反转录酶活性及pol基因拷贝数检测结果表明,设计的3条Stealth siRNA序列中,位于pol基因3272～3296 bp的序列能有效沉默PERV。结论:RNAi方法可有效使猪源PK-15细胞中的PERV沉默,为进一步研究天然抗病毒分子与PERV的相互作用提供了实验基础,同时也为猪源异种移植研究中去除PERV提供了一种可供尝试的方法。     

玉米蛋白粉DNA提取方法比较研究

饲料样本本身的复杂性给进出口产品转基因（genetically modified,GM）成分的检测工作带来了巨大的压力和挑战。玉米蛋白粉主要包含蛋白质、淀粉和脂类等成分,从中提取高品质的DNA比较困难,而高品质的DNA是转基因检测研究的关键,能够大大降低进出口检验中的“假阴性”结果。采用市售主流品牌常用的7种试剂盒（Promega公司、Biotecon公司、天根生化科技有限公司、Invitrogen公司、Qiagen公司、TaKaRa公司）、CTAB法以及改良SDS?CTAB法提取玉米蛋白粉中的DNA。通过对玉米内源基因进行实时荧光PCR检测,发现改良SDS?CTAB法提取的玉米蛋白粉DNA质量明显优于其他方法,改良SDS?CTAB法内源基因zSSIIb的C_t值为28.14,较CTAB法提高了27%。研究建立的改良SDS?CTAB法在国内外尚属首次应用于饲料转基因产品中,并对7批次实验室送检样品进行转基因成分检测,成功检出2批次阳性样品。     

羊水直接PCR法快速诊断脊肌萎缩症的实验研究

目的：建立一种快速、简便的产前诊断脊肌萎缩症的检测方法。方法：基于运动神经元生存基因SMNc和SMNt的两个同源拷贝碱基的差异,对SMNt基因第7、8外显子进行缺失分析,抽取孕妇羊水后用作者自行研制的“HpH—Buffer”,以离心后羊水沉淀中的胎儿细胞为模板直接进行PCR扩增,扩增产物进行酶切限制性片断长度多态性分析,对2例有脊肌萎缩症患儿生育史的孕妇怀有的胎儿进行产前基因诊断。同时,为考察羊水直接扩增方法的效率,对羊水样本直接扩增和对羊水样本中提取的基因组DNA扩增进行了平行实验。结果：2例胎儿均有SMNt基因第7、8外显子缺失;以羊水为模板和以基因组DNA为模板进行扩增的效率相似。结论：应用“HpHBuffer”直接对羊水样本中SMN基因上外显子7、8进行扩增,结合限制性片断长度多态性分析SMNt上是否发生缺失,可缩短诊断时间,节约诊断成本,减少检测过程中可能出现的样本交叉污染,有望成为临床上产前诊断脊肌萎缩症的新方法。     

脾动脉栓塞术后出现严重粘连的脾切除手术体会

目的:探讨脾动脉栓塞术后严重脾粘连脾切除手术技巧,为临床实践提供可借鉴的方法。方法:收集我院2005年4月-2013年6月收治的18例脾动脉栓塞术后严重脾粘连行脾切除术的患者临床资料,分析手术时间、术中出血、术中特殊处理及术后恢复情况等。结果:18例患者均顺利恢复出院,无围手术期死亡,开腹后到脾切除完成平均耗时55 min、出血550 mL。术后并发症为腹水(8例)、肺部感染(1例)、胰瘘(1例)及腹腔内出血(1例)。结论:脾动脉栓塞术后出现严重脾粘连行脾切除术,手术风险较大,手术时间、术中出血较常规脾切除术明显延长、增多。规范手术操作,细致分离脾周粘连,合理处理脾蒂,是安全、有效完成此类脾切除术的关键。     

髋关节置换治疗高龄不稳定型股骨粗隆间骨折的临床效果观察

目的：探讨髋关节置换手术治疗高龄人群不稳定型股骨粗隆间骨折的稳定性及愈后生活质量。方法：选取我院骨科收治的110 例不稳定型股骨粗隆间骨折患者作为研究对象,随机分为两组,观察组55 例采用人工全髋关节置换术,对照组55 例采用DHS内固定治疗,观察两组患者的手术时间、手术出血量、平均住院时间、临床疗效、术后并发症及愈后生存质量。结果：观察组手术时间及手术出血量大于对照组,但患者平均卧床时间及显著短于对照组（P＜0.05）。观察组手术总有效率为87.27%,对照组手术总有效率为70.90%,观察组手术效果明显优于对照组（P＜0.05）。观察组术后并发症发生率为7.27%,显著低于对照组（25.45%）（P ＜ 0.05）。观察组患者生活质量满意度为80.00 %,明显高于对照组（61.82%）（P ＜ 0.05）。结论：髋关节置换手术能减少术中出血量、患者下地活动时间早,局部组织修复速度快,对于体质较差、年龄大的老年患者,该术式是延长预期寿命的最佳手术方式。     

PSA在前列腺增生和前列腺癌中的诊断价值

目的：探讨临床上检测前列腺特异性抗原（PSA）的变化情况对前列腺增生和前列腺癌等疾病的诊断价值。方法：采用回顾性分析的方法,选取2010年6月至2012年4月在我院泌尿科接受治疗的前列腺增生患者64例定义为前列腺增生组（BPH）,前列腺癌患者83例定义为前列腺癌组（PCa）,另选取同期接受体检的健康人群137例作为对照组。分别检测三组患者入院时的游离前列腺特异性抗原和总前列腺特异性抗原的水平变化情况。对比并分析三组检测结果。结果：经检测,前列腺增生患者的血清总PSA明显高于对照组健康人群的正常值,而前列腺癌患者的血清总PSA比前列腺增生患者增高的更为明显。对照组游离PSA为（2．78±0．94）ng／mL,总PSA（1．05±0．57）ng／mL,游离PSA与总PSA的比值为,（0．38±0．61）;前列腺增生患者游离PSA为（6．36＋3．24）ng／mL,总PSA为（1．64±0．76）ng／mL,游离PSA与总PSA的比值为（0．26±0．23）;前列腺癌患者游离PSA为（12．42±4．97）ng／mL,总PSA为（1．44±0．78）ng／mL,游离PSA与总PSA的比值为（0．12±0．16）。组间比较差异明显,具有统计学意义（P〈0．05）。结论：对患者的PSA进行检测,对前列腺增生和前列腺癌的诊断具有良好的辅助作用和,临床价值。     

体重指数对腹腔镜直肠癌根治术的影响及分析

目的：回顾性分析我院同一组医生施行腹腔镜下直肠癌根治术患者的临床资料,探讨体重指数对于腹腔镜直肠癌根治术的影响,评估腹腔镜下直肠癌根治术在肥胖患者中的应用。方法：选择2009年1月至2010年12月因直肠癌在我院行腹腔镜直肠癌根治术的患者199例为研究对象,根据患者不同体重指数分为3组,正常体重组：BMI〈24．0kg／m2143例、超重组：24．0〈=BMI〈28．0kg/m^2 50例、肥胖组：BMI〉=28．0kg／m^2 6例,进而比较3组间患者围术期的各项指标,包括手术时间,估计术中出血量,术后住院时间,取检淋巴结数,对正常体重组,超重组及肥胖组三组患者围术期的各项数据进行比较。结果：3组患者均顺利完成手术,无术中死亡病例。1例患者中转开腹,中转开腹率为0．5％。1例患者术后3天死亡。分别比较三组间的手术时间、术中出血量、取检淋巴结数、术后住院天数,在正常体重组、超重组、肥胖组,手术时间分别为183．5±49．1min,191．2±54．3min,170．0±26．8min;术中出血量分别为65．6±66．4mL,59．9±61．1mL,83．3±20．4mL;取检淋巴结数分别为10．5±6．8枚、9．0±4．3枚、11．5±10．0枚;术后住院天数分别为13．1±3．8天、13．1±3．6天、12．7±1．0天,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论：腹腔镜下直肠癌根治术是一种安全、有效的手术方式,可安全地用于肥胖患者,可体现出其微创优势。